ODBORNÁ PRAXE

Zuzana KAUEROVÁ

4. r. biochemie

2004/2005

A) ÚVOD

1. POPIS LABORATOŘÍ

• Soukromé imunoanalytické a mikrobiologické laboratoře RNDr. Čecháček s. r. o. , Bratislavská 2, 604 70 Brno

• Oddělení: mikrobiologické, sérologické a imunoanalytické laboratoře

2. ČINNOST LABORATOŘÍ

Sérologie a imunoanalýza

• Imunokomplexní reakce – ELISA, EIA, RIA, KFR, aglutinace, hemaglutinace, precipitace, Western Blott

• PCR s elektroforetickou detekcí

• Detektory fotometrické, fluorimetrické, luminometrické, radioaktivní

Mikrobiologie

Gynekologické materiály, hemokultury, moč, stolice, punktát, rány, sputum, výtěry, vyšetření sterility, mykologie.

B) SÉROLOGIE

1. STANOVENÍ ANTI – HAV (IgM) V LIDSKÉM SÉRU METODOU ELISA

- kvalitativní detekce protilátek (Ab) IgM in vitro proti viru hepatitidy A, indikace akutní infekce od staré

- ELISA – enzymová imunoanalýza, princip dvojitého sendviče (firma Murex), detekce fotometricky

1.1 POSTUP PŘI PRÁCI

• 100x naředění vzorku (1 ml konjugátu + 10 μl vzorku)

• Pipetáž do stripu po 100 μl

 

 

 

NEG.

NEG.

POZ.

79910 - VZ

79910 - VZ

• Inkubace 60 minut při teplotě 37 °C

• Promytí jamek 5x na automatické promývačce

• Přidat po 100 μl konjugátu, 60 minut inkubace

• Přidat stejné množství substrátového roztoku, inkubace 30 minut => barevná změna na modrozelenou

• Zastavení reakce 1M kyselinou sírovou, proměření ve spektrofotometru

1.2 VÝSLEDKY

• řazeno dle pořadí ve stripu, poslední tři hodnoty bez vzorku

• naměřené absorbance:

JAMKY STRIP 1

A 0,092

B 0,104

C 1,340

D 0,087

E 0,102

F 0,036

G 0,033

H 0,030

1.3 VYHODNOCENÍ

• Výpočet hodnot absorbance negativních kontrol:

A = (0,092 + 0,104) : 2 = 0,098

• CUT OFF rovno součtu průměru absorbance neg. Kontrol a hodnoty 0,2:

X = 0,2 + 0,098 = 0,298

• hodnoty naměřené u pacienta: 0,087 ; 0,102;

• Naměřené hodnoty pacienta jsou srovnatelné s negativními kontrolami – VZOREK Č. 79910 BYL

NEGATIVNÍ• diagnostická senzitivita Murex anti – HAV (IgM) testu

se odhaduje na 98,8 % s intervalem spolehlivosti 96,4 – 99,68 %.

2. STANOVENÍ DNA CYTOMEGALOVIRU (CMV) in vitro V MOČI NEBO SÉRU

• Indikace onemocnění způsobeného napadením organizmu CMV (herpetické viry)

• Stanovení především u těhotných (poškození plodu)

• Metoda PCR – Polymere Chain Reaction – enzymatická syntéza sekvencí DNA za využití syntetických oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární s hledanou cílovou sekvencí na obou vláknech DNA

• Identifikace DNA gelovou elektroforézou

2.1 POSTUP PŘI PRÁCI

a) Separace soupravou Chemagen Biopolymer – Technologie CMV (Elisabeth Farmacon s. r. o.) extrakcí na magnetických partikulích

• Lýza buněk, denaturace nepotřebných bílkovin enzymem proteázou

• Navázání DNA na magnetické partikule, odstranění denaturovaných bílkovin a vazba DNA na eluční pufr (principem změna pH a tím i afinity) => uvolnění DNA

b) Vlastní PCR

• Aplikace specifického primeru v tzv. amplifikaci – dvoufázový cyklus teplot 94 °- 60 °- 72 °C v thermocykleru:

94 °C – denaturace (rozdvojení) vlákna DNA 60 °C – zmnožení sekvencí DNA aktivací primeru 72 °C – aktivace termostabilní DNA – polymerázy,

která doplní komplementární dvojice dvoušroubovice

c) Imunoelektroforéza

• Nalití agarózového gelu s malým množstvím barevného indikátoru (ethidiumbromid, viditelný pod UV – zářením, koncentrace 2,5 μl/50 ml), po zchladnutí vytvořit zářezy.

• Umístění markerů do zářezů, dále vzorky a pozitivní a negativní kontroly. Spustí se zdroj napětí => elektroendoosmóza, difúze vzorků.

• Po 45 minutách vyhodnocení.

2.2 VYHODNOCENÍ

Poloha vzorků na elektroforeogramu se ve všech případech blíží negativním kontrolám, všechny vzorky jsou

NEGATIVNÍ

C) MIKROBIOLOGIE

1. ANALÝZA VÝTĚRU Z KRKU

• Odběr při podezření na infekční onemocnění horních cest dýchacích – tonzilitidách a akutních zánětech hrtanu

• akutní tonzilitidy – rhinoviry, koronaviry, adenoviry, EB – viry, coxsackviry

• akutní záněty hltanu – Streptococcus pyogenes, Str. pneumoniae, Haemophillus influenzae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitis

1.1 MATERIÁL

• Výtěr z krku pacienta (6 – ti leté dítě, podezření na akutní tonzilitidu)

• Půdy: Krevní agar (KA) Endův agar (EA) NaCl – agar (NaCl) Miller – Hüntenova půda (MHA)

1.2 ZPRACOVÁNÍ

• Vyočkování tamponu se vzorkem na KA, EA a NaCl (křížová metoda)

• Inkubace 24 hodin při teplotě 37 °

• Analýza primokultury:=> šedobílé drobné kolonie, satelitní růst – podezření na

rod Haemophillus bělavé mukózní kolonie, β – hemolýza (neúplná) –

podezření na rod Staphylococcus Nažloutlé kolonie s hemolýzou α – podezření na rod

Streptococcus

• znovu pomnožit na KA s druhem Staphylococcus aureus, vložit disky se streptomycinem (S) a bacitracinem (BAC), inkubace 24 h při 37 °C

• Analýza pomnožené kultury: Stafylokok neurčeného druhu silná β – hemolýza ,

kolem BAC zóna inhibice Kolem zlatého stafylokoku růst velkého množství rodu

Haemophillus, malé, tužší bílé kolonie Streptokok α hemolýza, zóna inhibice kolem disku s S

1.3 VYHODNOCENÍ

a) Identifikace druhu Streptococcus

• testy na polysacharidovou substanci C pomocí latexové aglutinace

• pozitivní reakce nastala u typu A => druh Streptococcus pyogenes

b) Identifikace druhu Staphylococcus

• test na katalázu a latexová aglutinace k průkazu plazmakoagulázy

• test na katalázu silně pozitivní, plazmakoaguláza pozitivní => druh Staphylococcus aureus

c) Identifikace druhu Haemophillus

• Naočkování kolonie na MHA, vložit disky s faktory V, X a VX; inkubace 24 h při 37 °C

• Po inkubaci na agaru růst kolonií kolem faktoru VX a X => druh Haemophillus influenzae

Z testů plyne, že pacient je nakažen těmito mikroorganizmy: Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Haemophillus influenazae

Doporučuje se antibiotiková léčba.

2. ANALÝZA GYNEKOLOGICKÉHO POŠEVNÍHO VÝTĚRU

• nejčastěji výtěry z pochvy, cervix, plodová voda, sperma, gynekologické rány, stěry z glans penis, mateřské mléko apod.

• vyšetření při podezření na zánětlivá onemocnění pochvy, způsobená kvasinkami, gardnerelami, mykoplazmaty atd.

2.1 MATERIÁLY

• Gynekologický materiál – v tomto případě výtěr z pochvy

• Půdy: Krevní agar (KA) Krevní agar s amikacinem (KA – A) Krevní agar s vysokým procentem soli (NaCl) Endův agar (EA) Selektivní půda pro rod Gardnerella (GAR) Dvě půdy na mykoplazmata

2.2 ZPRACOVÁNÍ

• Nátěr, tzv. „MOP“, barvený dle Gramma a Giemsy

V obou preparátech pouze rod Lactobacillus – přirozená mikroflóra

- geometrické tvary, tzv. „döderleiny“

• Analýza kolonií na půdách:

KA – A: drobné bílé kolonie s rozsáhlou hemolýzou – rod Lactobacillus

EA: žádné kolonie (nepřítomnost enterokoků) NaCl: žádné kolonie (nepřítomnost Streptococcus

agalactiae) GAR: žádné kolonie Test na mykoplazmata: ani po 48 hodinách žádná

barevná změna - negativní

2.3 VYHODNOCENÍ

• VÝTĚR FYZIOLOGICKÝ, BEZ ZNÁMEK PATOGENITY.