U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E

P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a

K a t e d ra f yz ik á l n í a ma k ro mo l e ku l á rn í ch emi e

OPTIMALIZACE HPLC METODY PRO SEPARACI

ENANTIOMERŮ AMINOKYSELIN OBSAŽENÝCH V BCAA

DOPLŇCÍCH PRO SPORTOVCE

D i p l o m o v á p r á c e

s t u d i j n í h o o b o r u C h e m i e ž i v o t n í h o p r o s t ř e d í

Praha 2008 Simona Srkalová

1

Předmětová hesla:

Separace

Aminokyseliny

Chromatografie

Klíčová slova:

Větvené aminokyseliny

HPLC

Teikoplanin

Teikoplanin aglykon

Chirální separace

2

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně, pod vedením

školitele Doc. RNDr. Evy Tesařové, CSc. a že jsem všechny použité prameny řádně

citovala.

Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo

Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity.

V Praze dne……………………

………………………………………….

podpis

3

PODĚKOVÁNÍ

Mé poděkování patří zejména Doc. RNDr. Evě Tesařové, CSc. za odborné

vedení diplomové práce a podnětné rady a připomínky při jejím sepisování. Dále velice

děkuji Mgr. Květě Kalíkové za úvodní zaškolení v chromatografickém systému Breeze

a za veškerý čas, který mi vždy ochotně věnovala.

Na závěr děkuji svým rodičům a Bc. Filipu Baumgartnerovi za velkou trpělivost

a duševní podporu.

4

OBSAH

Seznam zkratek a symbolů................................................................................................6

1 Úvod..............................................................................................................................8

2 Teoretický úvod...........................................................................................................9

2.1 Enantiomery - základní pojmy a popis vlastností...................................................9

2.2 Význam enantiomerů v potravinách.....................................................................10

2.3 Aminokyseliny......................................................................................................12

2.4 Potenciální toxicita aminokyselin.........................................................................14

2.5 Sportovní potravinové doplňky............................................................................16

2.5.1 Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem.....................................................16

2.5.2 Vliv BCAA na snižování únavy při fyzické námaze...................................19

2.5.2.1 Hypotéza centrální únavy...............................................................19

2.5.2.2 Serotonin.........................................................................................21

2.5.3 Terapeutické využití BCAA........................................................................22

2.6 Principy enantioseparace v HPLC........................................................................24

2.6.1 Chirální stacionární fáze..............................................................................25

2.6.2 Makrocyklická antibiotika...........................................................................25

2.6.2.1 Teikoplanin.....................................................................................26

2.6.2.2 Teikoplanin aglykon.......................................................................27

3 Cíl práce......................................................................................................................29

4 Experimentální část...................................................................................................30

4.1 Seznam použitých chemikálií...............................................................................30

4.2 Charakterizace chirálních aminokyselin...............................................................31

4.3 Použité přístroje....................................................................................................31

4.4 Příprava vzorků.....................................................................................................32

4.5 Příprava mobilní fáze............................................................................................32

4.6 Podmínky měření..................................................................................................33

4.7 Zpracování naměřených dat..................................................................................33

4.8 Postup Waltersova testu........................................................................................35

4.9 Racemizační postupy............................................................................................35

5 Výsledky a diskuze.....................................................................................................36

5.1 Optimalizace metody pro separaci enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu.....36

5

5.2 Charakterizace a vzájemné porovnání chirálních stacionárních fází na bázi

teikoplaninu.........................................................................................................43

5.2.1 Waltersův test..............................................................................................43

5.2.2 Porovnání retenčních faktorů enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu

na kolonách Chirobiotic T, T2 a TAG.........................................................44

5.2.3 Porovnání separačních faktorů enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu

na kolonách Chirobiotic T a T2...................................................................52

5.2.4 Porovnání rozlišení enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na kolonách

Chirobiotic T a T2.......................................................................................55

5.2.5 Porovnání symetrie píků enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu

na kolonách Chirobiotic T a T2...................................................................57

5.3 Určení meze detekce a meze stanovení DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu..62

5.4 Studium procesů vyvolávajících racemizaci aminokyselin ve vzorku.................63

6 Závěr...........................................................................................................................65

Seznam literatury.............................................................................................................67

6

SEZNAM ZKRATEK A SYMBOLŮ

ACN - acetonitryl

BCAA - Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem (z angličtiny Branched Chain Amino

Acids)

CIP - Cahn-Ingold-Prelog

CSP - chirální stacionární fáze

D-Ile - D-isoleucin

D-Leu - D-leucin

D-Val - D-valin

fTrp - volný tryptofan

HI - index hydrofobicity

HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie

k - retenční faktor

L-Ile - L-isoleucin

L-Leu - L-leucin

L-Val - L-valin

LOD - limit detekce

log P - rozdělovací poměr

LOQ - limit stanovení

M - mol·dm-3

(jednotka molární koncentrace)

MA - makrocyklická antibiotika

MeOH - methanol

MF - mobilní fáze

Mr - relativní molekulová hmotnost

n - počet teoretických pater kolony

N,N-DETA - N,N-diethyltoluamid

pI 25

- izoelektrický bod při teplotě 25°C

pKA25

- disociační konstanta kyseliny při teplotě 25°C

pKB25

- disociační konstanta zásady při teplotě 25°C

R - koeficient spolehlivosti

R1,2 - rozlišení složek 1 a 2

S - faktor symetrie

7

SI - silanolový index

T - teikoplaninová chirální stacionární fáze

T2 - teikoplaninová chirální stacionární fáze s vyšším pokrytím chirálním selektorem

TAG - teikoplanin aglykonová chirální stacionární fáze

tM - mrtvý čas kolony

tR - retenční čas

v/v - objem/objem (poměr objemů složek MF)

w - šířka píku při základně

αij - separační faktor složek i a j

σ - výška šumu základní linie

%obj. - objemová procenta

8

1 ÚVOD

Významná část přírodních i uměle připravených sloučenin je chirálních. Je

známo, že v důsledku rozdílného prostorového uspořádání mohou mít enantiomery

často odlišnou biologickou aktivitu a fyziologické vlastnosti. Zejména při aplikaci léčiv

je nutno věnovat enantiomernímu zastoupení patřičnou pozornost, neboť vlivem

rozdílných interakcí chirálních léčiv může mít jeden z enantiomerů požadovaný

terapeutický účinek, zatímco druhý izomer je vysoce toxický. V posledních desetiletích

proto vzrostl zájem o sledování stereoselektivního chování sloučenin a chirální

separační metody dosáhly v oboru analytické chemie významného postavení.

Aminokyseliny se v nedávné době staly populárními výživovými doplňky

užívanými zejména sportovci. Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem (BCAA), které

jsou schopné svaly chránit před jejich degradací po náročném tréninku, a mohou se také

podílet na nárůstu svalové hmoty, se proto staly součástí běžně prodávaných

potravinových doplňků. Výše popsané vlastnosti mají pouze L-enantiomery větvených

aminokyselin, proto přítomnost D-forem vzniklých již během výrobního procesu nebo

následně vlivem nevhodného skladování může vést ke snížení výživových hodnot

výrobku. Pro kontrolu optické čistoty BCAA doplňků jsou nezbytným nástrojem právě

analytické separační metody.

Tato práce je zaměřena na optimalizaci metody vysokoúčinné kapalinové

chromatografie, která by umožnila rozdělit a kvantifikovat šest enantiomerů větvených

aminokyselin. Pro tyto účely byly využívány chirální stacionární fáze na bázi

teikoplaninu, proto součástí práce je i jejich charakterizace a vzájemné porovnání

z hlediska retence analytů, selektivity a účinnosti.

9

2 TEORETICKÝ ÚVOD

2.1 Enantiomery – základní pojmy a popis vlastností

Enantiomery jsou prostorové izomery, které mají stejnou chemickou strukturu,

ale je mezi nimi vztah jako mezi předmětem a jeho zrcadlovým obrazem. Tyto

molekuly mají v izotropickém (achirálním) prostředí stejné fyzikální a chemické

vlastnosti (teplotu tání, teplotu varu, rozpustnost, spektrum, reaktivitu). Výjimkou je

jejich optická aktivita, nebo-li schopnost otáčet rovinou polarizovaného světla1.

Enantiomery otáčejí rovinu polarizovaného světla o stejný úhel, ale v opačném směru2.

Naměřený úhel závisí na podmínkách měření (koncentraci vzorku, délce kyvety, vlnové

délce použitého světla, použitém rozpouštědle, teplotě). Enantiomery se liší v chirálním

prostředí. Jsou jinak rozpustné v chirálním rozpouštědle, jinak se chovají vůči enzymům

a chirálním činidlům3.

Opticky aktivní jsou látky, které jsou asymetrické1,2,4

. Takové látky nemají

v žádné své konformaci prvek symetrie a nazývají se chirální. Slovo chiralita je

odvozeno ze starořeckého slova chiros – dlaň4.

U sacharidů, aminokyselin a peptidů se k rozlišení absolutní konfigurace na

asymetrickém uhlíku dosud používá označení D- a L- (Fisherova projekce)4. U ostatních

enantiomerů se absolutní konfigurace vyjadřuje pomocí konvence podle autorů Cahna,

Ingolda, a Preloga (CIP systém), která používá označení R- a S- 5.

Směs dvou enantiomerů o stejné koncentraci, bez ohledu na jejich skupenství, se

nazývá racemát2,4

. Protože enantiomery mají stejnou absolutní hodnotu optické

otáčivosti, ale liší se smyslem otáčení, příspěvky obou forem se v racemické směsi

vzájemně ruší, a proto má racemát nulovou hodnotu optické rotace3. Racemizace je

proces, při kterém nevratně vzniká z výchozí neracemické chirální sloučeniny racemát4.

Významná část přírodních látek je chirálních, vyskytují se ve formě

enantiomerů, případně diastereomerů6. Lze říci, že chiralita je základní vlastností živé

hmoty.

Obecně se předpokládá, že přírodní makromolekuly jsou „homochirální“

(molekuly, které obsahují stereogenní centra se stejnou konfigurací)7. Aminokyseliny,

ze kterých se skládají peptidy a bílkoviny, se v organizmech vyskytují převážně v L-

formě. Příčinou „homochirality“ může být fakt, že L-aminokyseliny jsou stabilnější než

10

D-formy8. Pro sacharidy, které jsou např. složkou nukleových kyselin, jsou typické D-

izomery. Přírodní výskyt D-aminokyselin nebo L-sacharidů je vzácný nebo je

výsledkem neobvyklých transformací1.

Enantiomery se vyznačují rozdíly nejen v prostorovém uspořádání, ale

v důsledku toho také v chuti a vůni. Např. monoterpen S-(+)-karvon voní jako

kmín, ale R-(–)-karvon voní po mátě. S-limonen voní po citronech, zatímco jeho R-

analog má pomerančové aroma. Enantiomery se také dále mohou lišit ve své biologické

aktivitě a toxicitě. Příkladů lze najít celou řadu. Kyselina askorbová je účinná pouze ve

své S-formě. Léčivo S-propranolol je β-blokátor a R-izomer je neúčinný, R-sotalol je

antiarytmikum, zatímco S-sotalol je β-blokátor, R-penicilamin je antiarytmikum a S-

penicilamin je extrémně toxický1. S-ketoprofen má protizánětlivé účinky, R-enantiomer

se užívá při onemocnění ozubice a může být prodáván jako přísada do zubní pasty7.

Nechvalně známý důsledek aplikace racemátu thalidomidu v 50. a na počátku 60. let

minulého století měl také souvislost se stereochemií9; thalidomid byl nasazen ve 48

zemích jako lék na ranní nevolnosti pro těhotné ženy, vlivem jeho užívání se však

narodilo 12 000 postižených dětí. R-thalidomid má sice sedativní účinky, avšak jeho S-

enantiomer je vysoce teratogenní. Navíc při podání R-thalidomidu dochází k racemizaci

in vivo a vzniká druhý enantiomer s teratogenními účinky10

. Tyto rozdílné biologické a

fyziologické vlastnosti jsou způsobeny stereoselektivními interakcemi mezi

jednotlivými stereoizomery a bílkovinnými receptory1.

Z výše uvedeného je zřejmé, že je zapotřebí věnovat pozornost sledování

stereoselektivního chování či působení sloučenin a z toho vyplývajících důsledků při

aplikaci léčiv, agrochemikálií a při kontrole složek potravin.

2.2 Význam enantiomerů v potravinách

Potraviny obsahují přírodní sloučeniny - některé z nich jsou přítomné pouze jako

čisté enantiomery, jiné se zde vyskytují ve specifickém enantiomerním poměru nebo

jako diastereomery. Chiralita byla shodou okolností poprvé pozorována právě v nápoji

L. Pasteurem, který si všiml, že krystalky soli kyseliny vinné, vytvořené kolem hrdla

lahve od vína, se lišily od těch, které se objevily na dně lahve. Obě rozdílné krystalické

struktury byly později identifikovány jako enantiomery7.

Dlouhou dobu nebyla

významu stereochemie (enantiomernímu zastoupení) u složek potravin věnována

11

odpovídající pozornost. Teprve v posledních desetiletích, s rozvojem stereoselektivních

analytických metod, dosáhlo sledování enantiomerů významnějšího postavení i

v potravinářské chemii11,12

.

Chuť a vůně jsou tvořeny komplexní směsí stovek sloučenin, z nichž některé se

vyskytují pouze ve stopových množstvích13

. V potravinách a nápojích bylo

identifikováno množství těkavých látek, jejichž značná část je známá svou chiralitou.

Řada chirálních složek je přirozeného původu, zatímco jiné vznikají během výrobního

procesu (fermentace, sušení, pražení, alkalického zpracování atd.)7. Chuťové a čichové

vnímání je způsobeno interakcí molekuly s receptorem, který je tvořen chirálními

látkami (např. proteiny). Receptor má tedy možnost enantioselektivního rozpoznávání

daného rozdílnou interakcí s enantiomery14

. Např. D-sacharidy jsou kalorické a

kariogenní. L-sacharidy by neměly být kalorické, ani způsobovat zubní kaz, což by

mohlo být využito při uplatnění L-sacharidů jako náhražky sacharózy. Obě enantiomerní

formy sacharidů mají sladkou chuť 15

. Chirální chuťové a vonné složky v přírodních

produktech jsou obecně charakterizovány specifickou distribucí enantiomerů;

sloučeniny nejsou vždy přítomné ve formě jednoho čistého enantiomeru, ale vyskytují

se ve specifickém enantiomerním poměru. Tento poměr se může lišit podle druhu a

stupně zrání, ale i podle zeměpisného původu. Vyhodnocením specifického

enantiomerního zastoupení sloučenin, které nejsou citlivé k racemizaci, mohou být

rozlišeny přírodní a umělé (obvykle racemické) složky přidané do potravin. Detekce

přítomnosti jiných enantiomerů může mít velký význam pro stanovení kvality daného

produktu. Např. proteiny v potravinách mohou racemizovat následkem nevhodného

technologického zpracování, jako je nadměrný ohřev, ozáření nebo úprava za

extrémních hodnot pH. Eventuelně mohou být do produktu přidány syntetické přísady,

čímž dochází k jeho znehodnocení. Během minulých let proto vzrostl zájem o

prověřování enantiomerní čistoty složek potravin. Napomohl tomu i fakt, že

enantiomery mohou mít rozdílné výživové hodnoty a zejména biologickou aktivitu7.

Enantioselektivní analýza může být využita při kontrole technologického

zpracování, identifikaci příměsí, kontrole fermentačních procesů, stáří, hodnocení

mikrobiální kontaminace a skladovacích podmínek, určování zeměpisného původu a při

studiu a kontrole příchutí a aditiv v potravinách a nápojích1,7

.

12

2.3 Aminokyseliny

Enantiomery aminokyselin obecně, včetně těch přítomných v potravinách, jsou

jednoznačně nejlépe prozkoumanou skupinou chirálních sloučenin. Je to dáno nejen

četností výskytu, ale i relativně dobře zvládnutou možností stanovení enantiomerů

aminokyselin. Lze říci, že většina stávajících enantioselektivních separačních systémů

umožňuje dobré rozdělení a následnou kvantifikaci enantiomerů aminokyselin11,12

.

Enantiomery aminokyselin se často liší chutí. Například většina hydrofóbních

L-aminokyselin je hořkých, zatímco příslušné D-formy mají velmi sladkou chuť (např.

D-asparagin)1. Čajové aroma a chuť ovlivňují kromě řady dalších těkavých složek také

chirální aminokyseliny. Mezi aminokyselinami běžně se vyskytujícími v čaji má

unikátní postavení theanin (5-N-ethylglutamin)13

. L-theanin je majoritní volnou

aminokyselinou v čaji a tvoří téměř 2 % sušiny z čaje16

. Při analýze několika druhů čaje

bylo zjištěno, že celkové množství theaninu a podíl D-izomeru se mění podle druhu

analyzovaného čaje17

. Sledováním procesů racemizace mohou být získány informace o

výrobě, skladování a přepravě čajových produktů.

D-aminokyseliny mohou sloužit jako vhodné ukazatele podmínek zpracování.

Jsou obsaženy v potravinách a nápojích vystavených vysokoteplotní úpravě,

fermentačním procesům a extrémním hodnotám pH. Všechny aminokyseliny přítomné

v peptidech a proteinech racemizují, avšak rozdílnou rychlostí, což je dáno odlišnými

konstantami racemizace. Rychlost racemizace je dále ovlivňována vnějšími faktory,

jakými jsou právě teplota, pH, ale i koncentrace aj.13

. Bylo prokázáno, že L-

aminokyseliny vázané v proteinech podléhají racemizaci desetkrát rychleji než volné

aminokyseliny. Racemizace aminokyselin během zpracovávání za vysokých teplot nebo

v alkalickém prostředí může být zodpovědná za tvorbu DD-, DL- a LD-peptidových

vazeb. Taková variabilita vazeb následně snižuje schopnost proteolytických enzymů

tyto proteiny trávit, a tím dochází ke snižování nutriční hodnoty daných potravin18

.

Faktory, které ovlivňují racemizaci aminokyselin v proteinech během jejich zpracování,

byly již dříve zkoumány. Výsledky studie19

zabývající se vlivem pasterizace a dalších

vysokoteplotních procesů na racemizaci aminokyselin a proteinů v mléce ukázaly, že

krátkodobé vystavení relativně vysokým teplotám v průběhu zpracování racemizaci

nevyvolalo.

13

Pražení kávových a kakaových bobů představuje další příklad vysokoteplotních

procesů, kde lze využít racemizace aminokyselin pro hodnocení kvality finálního

výrobku. Stupeň pražení bývá popisován hodnotou organického úbytku při pražení,

která je zjišťována jako hmotnostní úbytek. Vzájemný vztah mezi stupněm pražení a

racemizací aminokyselin byl popsán matematickou funkcí20

. Tak lze z poměru D/L

enantiomerů a celkového množství aminokyselin zjistit hodnotu organického úbytku při

pražení.

Čerstvě nadojené mléko je většinou kontaminováno mikroorganizmy

přítomnými v bachoru, zejména anaerobními bakteriemi rodů Bacteroides,

Ruminococcus a Butyrivibrio.

Nízké, avšak významné hladiny D-aminokyselin

nalezených v mléce jsou výsledkem trávení a autolýzy bachorových bakterií. D-

aminokyseliny jsou v bakteriích tvořeny z L-analogů za katalýzy racemáz a epimeráz 21

.

D-aminokyseliny by neměly být přítomné v kvalitních nekvašených, nijak

nezpracovaných potravinách. Racemizace aminokyselin je obecně ukazatelem buď

přítomnosti příměsí, a nebo jiného znehodnocení potravin 7.

Enantioselektivní analýza aminokyselin je novým prostředkem pro hodnocení

kvality dalších nekvašených potravinových výrobků, jakými jsou třeba ovocné džusy a

med.7 V ovocných nápojích lze přídavek levné, uměle připravené aminokyseliny

použité k zamaskování zřeďování produktu vodou snadno rozpoznat z přítomnosti

syntetické, tedy obvykle racemické směsi aminokyselin15

. Sedm aminokyselin,

konkrétně DL-arginin, DL-prolin, DL-asparagin, DL-serin, DL-alanin, DL-glutamová

kyselina a DL-asparágová kyselina, je zodpovědných za 90 % veškerého obsahu

aminokyselin nalezených v pomerančových džusech22

. D-arginin, D-alanin, D-

glutamová kyselina a D-asparágová kyselina byly však detekovány v pomerančových

džusech rovněž jako přirozeně se vyskytující D-enantiomery z rostlinných zdrojů, půdy

nebo mikroorganizmů23

. Významné hladiny D-aminokyselin byly nalezeny také v medu.

Určení enantiomerního poměru vybraných aminokyselin může být použito při

zjišťování doby skladování a podmínek, za kterých byl med vyráběn. Enantioselektivní

analýza aminokyselin však také může poskytnout informace o bylinném a zeměpisném

původu medu24

. Nejvýznamnější aminokyselina v medu je L-prolin, jehož obsah činí 50

až 85 % z celkového množství volných aminokyselin. Zpracováním medu za vysokých

teplot se jednak snižuje celkové množství aminokyselin, a zároveň se zvyšuje relativní

zastoupení D-aminokyselin13

.

14

Výskyt D-aminokyselin v kvašených potravinách je přirozený. Důvodem je

jednak přítomnost D-aminokyselin v buněčné stěně bakterií, odkud se mohou uvolňovat

do okolí, a dále pak působení bakteriálních racemáz či epimeráz, které přeměňují L-

aminokyseliny na jejich D-analogy25

. V sýru, jogurtu, víně, octu atd. jsou ve větším

množství zastoupené D-alanin, D-glutamová kyselina a D-asparágová kyselina.

Významné je zastoupení těchto aminokyselin ve zrajících sýrech. Stejné D-

aminokyseliny převládají také v jogurtech. Množství těchto enantiomerů je v korelaci s

bakteriálním nárůstem Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus. Zvláště

obsah D-alaninu, který je produkován pouze bakterií L. bulgaricus, je používán jako

platný rychlý ukazatel pro měření koncentrace L. bulgaricus v jogurtu26

.

D-aminokyseliny mohou vznikat v potravinách nejen činností mikroorganizmů,

ale také v kyselém prostředí z L-analogů za přítomnosti glukózy, fruktózy nebo

sacharózy27

. Hlavní zdroje D-aminokyselin pro člověka jsou potraviny a nápoje. Dále

získává člověk D-aminokyseliny degradací buněčných stěn mikroorganizmů ve střevě a

de novo syntézou28

. Pouze 10-20 % přijatých D-aminokyselin je vyloučeno, zbylých 80-

90 % je zachyceno ve střevech a přeměněno na α-oxokyseliny za působení oxidázy D-

aminokyselin, která je přítomná zejména v játrech, ledvinách a mozku29

. Toxicita D-

aminokyselin pro lidský organizmus nebyla dosud jasně prokázána, také jejich

metabolická dráha není dodnes zcela známá19

. Nahromadění D-aminokyselin

v organizmu, způsobené nízkou aktivitou oxidázy, však může vyvolat řadu poškození,

např. inhibici enzymové syntézy nebo potlačení růstu30

. Metabolizmus těchto

enantiomerů může být ovlivněn i dalšími faktory, jako např. rychlostí transportu,

činností střevních enzymů a bakterií, absorpcí a ledvinovým oběhem7. Při

intravenózním podání čisté racemické směsi aminokyselin dospělým osobám i dětem se

neprojevily žádné toxické účinky, přestože podaná dávka obsahovala vyšší koncentraci

aminokyselin, než je množství přijímané v běžné potravě21

.

2.4 Potenciální toxicita aminokyselin

Toxicita aminokyselin samotných není známá (kromě zažívacích obtíží

vyvolaných příjmem jejich nadměrného množství), nicméně jejich sekundární

metabolity nebo produkty degradace v potravinách již s sebou mohou přinášet řadu

závažných zdravotních rizik.

15

Rostliny a také některé jiné organismy jsou schopné rozkladem kyanogenních

sloučenin (tzv. kyanogeneze) produkovat kyanovodík. Předpokládá se, že tyto

sloučeniny plní v rostlinách ochrannou funkci před škůdci a predátory.

Nejrozšířenějšími kyanogeny jsou kyanogenní glykosidy, jejichž molekula je většinou

složena z monosacharidu β-D-glukosy (výjimečně disacharidu) a na něj navázané

necukerné složky. Kyanogenní glykosidy se obvykle dělí podle aminokyselin, ze

kterých vznikly biosyntézou. Nejjednodušším kyanogenním glykosidem je linamarin

odvozený od valinu. Je obsažen v manioku (Manihot esculenta), který je významnou

součástí jídelníčku obyvatel subsaharské Afriky a Indonésie31

.

Dekarboxylací příslušných aminokyselin vznikají biogenní aminy, které jsou

v nízkých koncentracích přirozenou složkou řady potravin. V živočišných tkáních a

rostlinných pletivech vykonávají mnoho důležitých funkcí. V živočišných produktech

jsou hlavními biogenními aminy histamin (vznikající z histidinu), kadaverin (z lysinu),

putrescin (z ornitinu) a tyramin (z tyrosinu). Při skladování masa, ryb a sýrů dochází ke

zvyšování jejich obsahu vlivem enzymové aktivity přítomných mikroorganismů. Obsah

některých biogenních aminů lze proto využít jako ukazatele čerstvosti masa. Růst

koncentrace biogenních aminů je především ovlivněn teplotou při skladování a druhem

kontaminující mikroflóry. Potraviny, které mají vysoký obsah biogenních aminů, jsou

zdravotně závadné; jejich konzumace vyvolává zvracení, dýchací obtíže, pocení, bušení

srdce, hypotenzi nebo hypertenzi a migrény. Působením monoaminooxidas a

diaminooxidas je část biogenních aminů v lidském organismu odbourána, avšak vysoké

koncentrace těchto látek není tělo schopné odstranit. Koncentrace histaminu přesahující

500 – 1000 mg . kg-1

jsou pro člověka považovány za nebezpečné. Zvýšené množství

tohoto aminu může vyvolat až anafylaktický šok31

.

Zatímco v rozvojových zemích se na vzniku nádorů nejvíce podílejí chronické

infekce virové, mikrobiální a parazitární (celosvětově vyvolávají 20 – 25 % všech

nádorů), v hospodářsky vyspělých státech je to zejména strava, složená především

z rafinovaných potravin s převahou tuku, cukru, výrobků z bílé mouky, velkého podílu

živočišných a malého podílu přirozených rostlinných potravin. Vnější faktory se mohou

u lidí spolupodílet na vzniku až 90 % nádorů32

.

Dusitany přidané do potravin nebo vzniklé bakteriální redukcí z dusičnanů (v

dutině ústní nebo v žaludku) reagují za určitých podmínek se sekundárními aminy nebo

amidy, které v potravě vznikají degradací bílkovin a jiných dusíkatých potravinových

složek a tvoří nitrosaminy nebo nitrosamidy, které jsou klasifikovány jako mutageny a

16

potenciální karcinogeny. Nitrosaminy také vznikají ve kvašených potravinách a jsou

produkovány rovněž během tepelné úpravy potravin, zejména při smažení tučných

masných výrobků. N-Nitrososloučeniny se mohou tvořit z dusičnanů a dusitanů a

aminoskupin i přímo v lidském těle při pH 3 – 7. Snížení produkce nitrosaminů

v potravinách lze dosáhnout přídavkem vitaminu C (přibližně 500 mg . kg-1

) nebo

vitaminu E 33

.

Heterocyklické aminy patří do skupiny velmi škodlivých látek, které mají

genotoxické účinky a u hlodavců (krysy a myši) byla prokázána jejich mutagenní a

karcinogenní aktivita. Tyto sloučeniny vznikají rozkladem proteinů nebo jednotlivých

aminokyselin, především tryptofanu, fenylalaninu a kyseliny glutamové. Tvoří se

během tepelné úpravy potravin. Z každé aminokyseliny vzniká jeden nebo více

heterocyklických aminů33

.

2.5 Sportovní potravinové doplňky

2.5.1 Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem

Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem jsou označovány jako BCAA

(z angličtiny Branched Chain Amino Acids) – jedná se o valin, leucin a isoleucin.

Obr. 2.1 Strukturní vzorec aminokyseliny L-valinu

Obr. 2.2 Strukturní vzorec aminokyseliny L-leucinu

17

Obr. 2.3 Strukturní vzorec aminokyseliny L-isoleucinu

Tyto tři aminokyseliny patří do skupiny tzv. esenciálních aminokyselin, tedy pro

člověka nepostradatelných a je proto nutné, je v nezbytných množstvích dodávat do

organismu potravou. V klinické medicíně se větvené aminokyseliny uplatňují všude

tam, kde je potřeba chránit vlastní bílkoviny organismu před devastací34

. Struktura

myofibrilárních bílkovin je přibližně z 18 % tvořena právě aminokyselinami

s rozvětveným řetězcem35

(některé zdroje34

uvádí až z 35 %). Tyto aminokyseliny

představují okamžitý zdroj energie, neboť jsou využitelné přímo z krevního oběhu,

odkud přecházejí do svalových buněk. Jsou proto schopné svaly chránit před úbytkem

svalové hmoty (antikatabolický efekt) a mohou také přispívat k nárůstu objemu svalů.

Jejich přirozené množství však nevystačí např. při náročném tréninku, následkem je

devastace svalové hmoty související s katabolickými procesy. Z těchto důvodů jsou

rozvětvené aminokyseliny vhodnými potravinovými doplňky pro sportovce (zejména

kulturisty), případně osoby s nadměrnou fyzickou zátěží34,36

. Doplňkový příjem L-

valinu, L-leucinu a L-isoleucinu může být užitečný i v určitých situacích – např. pro

prevenci ztráty svalů ve vysokých nadmořských výškách a zvyšování odolnosti při

výkonech prováděných v teplém prostředí. Mohou také zlepšit stav při úbytku

duševních schopností, vzniklých v důsledku záteže37

(viz kap. 2.5.2.1).

Aminokyseliny s rozvětveným řetězcem zaujímají mimořádné postavení

v metabolismu. V metabolismu těchto aminokyselin lze najít řadu analogií

s odbouráváním mastných kyselin. Katabolismus větvených aminokyselin v organismu

se skládá ze tří základních kroků: transaminace, oxidační dekarboxylace a třetího kroku,

který je podobný β-oxidaci mastných kyselin. Pro rozklad větvených aminokyselin je

typické, že se jen nepatrně metabolizují v játrech. Jsou totiž zpracovávány na periferii,

zejména ve svalu, pro který představují vynikající zdroj energie. Při užívání BCAA

dochází k mnohem nižší tvorbě kyseliny mléčné, což znamená, že tělo při výkonu

využívá menší množství svalového glykogenu k tvorbě energie. Dalším důležitým

faktem je, že doplňování větvených aminokyselin po sportovním výkonu udržuje

18

hladinu glutaminu v krvi (snížená hladina glutaminu v krvi způsobuje oslabení

obranyschopnosti a organismus je tak více náchylný vůči infekcím). Jak tyto

aminokyseliny samotné, tak z nich odvozené produkty mají zvláštní terapeutický

význam – používají se při chorobách jater, svalů a při selhání ledvin (viz kap. 2.5.3). L-

valin, L-leucin a L-isoleucin jsou součástí umělých diet a mají kladný vliv na

metabolismus bílkovin – lze jej označit za antikatabolický, jelikož vedou ke zvýšení

syntézy bílkovin v srdci a játrech34

. Při studiu účinků BCAA bylo rovněž zjištěno, že

doplňkový příjem BCAA přispívá k redukci břišního tuku, naopak efekt na svalový

objem byl nulový, pokud byly tyto doplňky kombinovány s dalšími aminokyselinami38

.

K nejdůležitějším funkcím BCAA z hlediska doplňkového příjmu osobami

s nadměrnou fyzickou zátěží patří zejména tyto34,36

:

Uplatňují se všude tam, kde je zapotřebí chránit vlastní bílkoviny organismu

před devastací.

Jsou užitečné v období svalové regenerace, kdy urychlují novou tvorbu bílkovin.

Jsou rychle vstřebatelné, čímž představují okamžitý zdroj energie.

Pomáhají léčit svalová zranění.

Spolu se svými ketoanalogy jsou velice často používány k léčbě jaterních a

ledvinových onemocnění.

Z běžných potravin je největší množství větvených aminokyselin obsaženo

v kuřecím a krůtím mase, v mořských rybách, mléčných výrobcích a luštěninách. Strava

většiny lidí poskytuje dostatečné množství BCAA, což je okolo 25 – 65 mg / kg / den.

Denní spotřeba leucinu je ze všech tří aminokyselin nejvyšší a pro mladého

nesportujícího jedince se pohybuje v rozmezí 20 – 40 mg / kg / den. Pro sportovce

trénujícího denně tři a více hodin pak vychází dávka minimálně na 60 mg / kg/ den.

Výše spotřeby valinu byla stanovena mírně pod hranicí 40 mg / kg / den, pro intenzivně

trénující jedince je doporučována dávka minimálně 50 mg / kg / den. U isoleucinu se

spotřeba stanovuje velice těžko kvůli obtížnosti měření jeho štěpení, nicméně odborníci

doporučují denní dávku zhruba 20 mg / kg / den. Ideální poměr zastoupení jednotlivých

aminokyselin (v pořadí leucin, isoleucin a valin) je 2 : 1 : 0,5 34

. Právě leucin se výrazně

podílí na zrychlení nárůstu svalové hmoty38

- syntézu bílkoviny v organismu nastartuje

19

mnohem dříve než ostatní aminokyseliny. Protože je celý tento proces závislý na

hladině inzulínu, nemůže pracovat sám, bez dalších aminokyselin a sacharidů.

Celková denní dávka BCAA by neměla překročit 20 g (vyšší množství se sice

nepovažuje za škodlivé, ale může způsobit zažívací obtíže). Denní dávka je součtem

množství větvených aminokyselin ze všech zdrojů přijímaných během dne, tzn. ze

stravy a z doplňků. Ideální je dané množství rozdělit do minimálně šesti denních porcí a

užívat je jak ve dnech tréninku, tak ve dnech regenerace. Je doporučováno užít 5 g

BCAA zhruba 60 minut před tréninkem a dalších 5 g ihned po tréninku spolu s potravou

bohatou na proteiny. V souvislosti s užíváním BCAA nebyly zaznamenány žádné

vedlejší účinky34

.

2.5.2 Vliv BCAA na snižování únavy při fyzické námaze

2.5.2.1 Hypotéza centrální únavy

Fyzická únava je definována jako neschopnost udržet silový výkon a může být

původem centrální nebo periferní. Faktory související s únavou jsou ovlivňovány

intenzitou a délkou cvičení, nutričním příjmem a fyzickou kondicí konkrétního

jedince39

. Příčinami periferní únavy mohou být např. vyčerpání svalového glykogenu

nebo fosfokreatinu, nahromadění H+ iontů (laktátu) nebo nedostatečný nervově svalový

přenos. Faktory, které by mohly být příčinou centrální únavy, jsou méně známé, avšak

několik mechanismů, souvisejících s centrální únavou, již bylo navrženo. Prvním z nich

může být nárůst koncentrace některých klíčových sloučenin ve svalech během tělesné

aktivity, např. H+ iontů, K

+ iontů, bradykininů, fosfátů, prostaglandinů, které se mohou

navázat na specifické receptory ve svalech. Touto vazbou pak mohou být přenášeny

informace ze svalu do mozku za pomoci senzorických nervů. Dalším z mechanismů

může být vyčerpání zásoby glykogenu v játrech, následný pokles hladiny glukózy

v krvi, snížení této hladiny v mozku a z toho vyplývající omezené využití glukózy

některými neurony v těch částech mozku, které jsou zodpovědné za kontrolu motorické

aktivity. Posledním z mechanismů podílejících se na vzniku centrální únavy je nárůst

koncentrace aminokyseliny tryptofanu v krvi, s čímž souvisí zvýšení koncentrace

neurotransmiteru 5-hydrohytryptaminu (serotoninu) v některých neuronech,

zodpovídajících za kontrolu motorické aktivity v mozku40

.

20

Množství tohoto neurotransmiteru v presynaptickém neuronu závisí na rychlosti

jeho syntézy, která je regulována koncentrací tryptofanu v krvi (příjem tryptofanu

mozkem je významným faktorem při řízení syntézy 5-hydroxytryptaminu a tedy jeho

množství v presynaptickém nervu)40

a transportem tryptofanu přes hematoencefalickou

bariéru39

. Tyto procesy pak vedou ke vzniku únavy40

. První studie, která poukázala na

to, že koncentrace 5-hydroxytryptaminu je ovlivňována fyzickým cvičením, byla

publikována v roce 1963 Barchasem a Freedmanem41

. Ti zjistili zvýšené množství

serotoninu v mozku krys, které před tím plavaly až do naprostého vyčerpání.

Transport tryptofanu do mozku není řízen pouze koncentrací této aminokyseliny

v krevním řečišti, ale také množstvím dalších aminokyselin, zejména aminokyselin

s rozvětveným řetězcem, které při transportu přes hematoencefalickou bariéru

s tryptofanem soupeří 38,40

. Během delšího fyzického výkonu jsou BCAA oxidovány v

pracujícím svalu a jejich koncentrace v plasmě klesá. Pokud se během cvičení zvyšuje

v plasmě hladina volných mastných kyselin, které s tryptofanem soutěží o vazebné

místo na albuminu (tryptofan je jedinou aminokyselinou navázanou v krevní plasmě na

albumin; pouze 10% z celkové koncentrace v plasmě se vyskytuje ve volné formě39

),

dochází rovněž k růstu koncentrace volného tryptofanu v plasmě. Rostoucím poměrem

mezi volným tryptofanem a BCAA (fTrp/BCAA) v plasmě, který je pozorován během

námahy a zejména po ní, je upřednostňován transport tryptofanu do mozku. Cvičením

tedy může být zvýšena rychlost syntézy, koncentrace a uvolňování serotoninu

z některých neuronů zodpovědných za únavu během delší námahy40

.

Orálním podáváním BCAA roste jejich koncentrace v krevní plasmě, tím

dochází ke snížení poměru koncentrací fTrp/BCAA, a tedy nižšímu transportu

tryptofanu k presynaptickým neuronům v mozku. Tím klesá podle této hypotézy

syntéza serotoninu v mozku, a následně tak může být redukována velikost únavy38,40

.

Zmiňovaná hypotéza ovšem nemusí být zcela správná. Např. lze namítnout, že

pozitivní efekt orálně podávaných větvených aminokyselin během namáhavého cvičení

nesouvisí se snižováním koncentrace 5-hydroxytryptaminu v mozku, nýbrž s jinými

biochemickými procesy v centrální nervové soustavě. Eventuálně lze podotknout, že

BCAA (zejména pak leucin) mohou být přeměněny na metabolit, který může fungovat

jako nový neurotransmiter s účinky snižujícími únavu40

. Na druhou stranu infuze

větvených aminokyselin v pacientech s cirhózou jater zamezila abnormálnímu příjmu

tyrosinu mozkem42

.V další studii43

bylo rovněž naznačeno, že zvýšením koncentrace

valinu v krvi se snížil transport aromatických kyselin - tyrosinu a tryptofanu přes

21

hematoencefalickou bariéru. Některé studie na lidských jedincích podporují teorii

zapojení 5-hydroxytryptaminu při vzniku únavy44,45

, jiné nikoliv46,47

. Tyto rozpory

mohou být vysvětleny rozdíly v lécích užívaných konkrétní osobou, dávkách BCAA,

době podání dávky, individuálních odchylkách v neuroendokrinní odezvě, stejně tak

jako v typu, intenzitě a délce cvičení39

.

Dalším zajímavým faktem je, že příjem sacharidů během fyzického výkonu

snižuje v krevní plasmě kompetici o vazebné místo na albuminu mezi volnými

mastnými kyselinami a volným tryptofanem38

. Tímto procesem je inhibován cvičením

indukovaný nárůst množství volného tryptofanu v plasmě, a tím také transport

tryptofanu do mozku39

. Tak může být opožděn možný pozitivní efekt BCAA při únavě.

Naopak při studii48

zkoumající vliv infuze větvených aminokyselin na tělesný výkon

jedince ve stavu vyčerpaného svalového glykogenu (dosaženého krátkodobým půstem)

nebyl zjištěn žádný pozitivní efekt podaných BCAA na svalovou výdrž. Doplňkový

příjem aminokyselin s rozvětveným řetězcem měl dokonce škodlivý účinek na tělesný

výkon u pacientů s nedostatkem enzymu glykogen fosforylasy v důsledku rostoucí

produkce amoniaku49

.

2.5.2.2 Serotonin

Biologicky aktivní látka serotonin byla objevena v krevním séru a jako první byl

prokázán její vliv na napětí hladkého svalstva - tonus. Název látky proto vznikl

složením slov sérum a tonus50

. Poprvé byla izolována Irvinem Pagem v roce 1948 a

později byla dána do souvislosti s centrální nervovou soustavou. V organismu

průměrného lidského jedince je obsaženo pouze 5 – 10 mg serotoninu, z toho 90 % se

nalézá ve střevě a zbytek v krevních destičkách a mozku51

.

Významnou funkcí 5-hydroxytryptaminu je přenos nervových vzruchů

(neurotransmiter), podílí se na procesech souvisejících se vznikem nálad50

, kontrolou

chuti, pamětí a učením, termoregulací, chováním, kardiovaskulárními funkcemi,

svalovými kontrakcemi a endokrinní regulací51

. Serotonin podporuje kontrakce

hladkého svalstva a krevní srážlivost. Proto hraje značnou roli při krvácivých

poraněních, kdy vasokonstrikční účinek snižuje únik krve z těla. Serotonin je také

spojován se vznikem únavy50

.

Nedostatek serotoninu způsobuje snížení přenosu nervových vzruchů –

způsobuje tak změny nálad, depresi, popřípadě poruchy spánku, podrážděnost až

22

agresivitu. Změny v jeho metabolismu mohou být zodpovědné také za určité psychické

poruchy – např. schizofrenii, maniodepresivní psychózu, chorobnou úzkost a další.

Nedostatek této biomolekuly lze upravit příjmem potravy, která obsahuje bílkoviny

bohaté na L-tryptofan. Serotonin v těle vzniká z této aminokyseliny působením enzymů.

Na syntézu serotoninu v těle má také velký vliv hladina světelného záření. Proto se jeho

nedostatek projevuje zejména v zimním období, kdy lidé častěji trpí úzkostnými stavy,

depresemi, jsou podráždění a útoční. Zvýšená hladina této látky vyvolává projevy

předávkování, označované jako serotoninový syndrom, který se projevuje třesem,

vyšším krevním tlakem, zrychlením srdeční činnosti, zmateností a bezvědomím50

.

2.5.3 Terapeutické využití BCAA

Schopností BCAA je aktivovat glutamát dehydrogenázu, enzym, jehož deficit se

projevuje u choroby amyotrofická laterální skleróza, zvané též jako Lou Gehrigova

choroba. Provedená studie prokázala, že doplňkový příjem 26 g větvených

aminokyselin denně pomáhá osobám trpícím touto nemocí udržet svalovou sílu.

Malá skupina lidí s poruchami nervového systému, souhrnně označovanými jako

spinoceleberální degenerace, zaznamenala v rámci předběžné studie zlepšení

zdravotního stavu při podávání BCAA.

Lidé s onemocněním jater, tzv. hepatální encefalopatií, mají sníženou hladinu

větvených aminokyselin, a naopak zvýšenou hladinu jiných aminokyselin. Při několika

provedených experimentech byl zjištěn celkový pozitivní účinek BCAA na příznaky

tohoto jaterního onemocnění. Příznivé účinky větvených aminokyselin byly rovněž

prokázány u dětí se selháním jater a dospělých s jaterní cirhózou.

Při intravenózním podání aminokyselin s rozvětveným řetězcem pacientům

s chronickým ledvinovým selháním dochází ke zlepšení kvality spánku a dýchání 37

.

Fenylketonurie je dědičně podmíněné metabolické onemocnění spočívající v

poruše přeměny fenylalaninu na tyrosin způsobené nefunkčním enzymem

hydroxylázou. Vysoké hladiny fenylalaninu v krvi poškozují mozek52

. V rámci

kontrolované studie bylo prokázáno, že pravidelné užívání BCAA adolescenty a

mladými dospělými lidmi trpícími touto nemocí, zvyšuje výkonnost při některých

testech duševních schopností. BCAA totiž mohou vytěsňovat fenylalanin, a tím snižovat

jeho toxický účinek37

.

23

Dlouhotrvající pooperační stav nebo pokročilé nádorové bujení vedou k

nadměrnému systémovému katabolismu, který je charakterizován rostoucí spotřebou

energie, negativní rovnováhou dusíku, oslabením imunitního systému, zvyšující se

spotřebou glutaminu a narušením metabolismu aminokyselin – dochází k úbytku

svalových proteinů a oxidaci větvených aminokyselin v kosterních svalech (během

normálních podmínek je oxidací BCAA v kosterních svalech poskytováno 6 – 7 %

energie, při stavech s vysokým stupněm katabolismu je to až 20 %.

Ztráta váhy a podvýživa se řadí mezi nejběžnější doprovodné rysy pozorované u

pacientů v pooperačních stavech a onkologických pacientů, kteří jsou vystaveni

přetrvávajícímu katabolickému stresu. Zachováním adekvátního příjmu živin lze zlepšit

šance na přežití pacientů ve stavech vysokého stupně katabolismu. Běžná výživa však

nebývá příliš účinná.

Oxidací aminokyselin s rozvětveným řetězcem je poskytována energie pro

činnost svalů a dalších orgánů, tyto aminokyseliny také hrají důležitou roli při regulaci

metabolismu. Exogenně podávané BCAA, zejména leucin, stimulují syntézu proteinů a

snižují jejich degradaci v izolovaných svalových preparátech a při orálním podání in

vivo. Mnoho příznivých účinků větvených aminokyselin během katabolických procesů

je spojeno se syntézou glukoneogenních aminokyselin, alaninu a zejména glutaminu,

klíčové sloučeniny pro udržení životních funkcí orgánů. Oxidací BCAA ve svalech je

poskytován dusík využívaný pro tvorbu glutaminu – zvyšují jeho syntézu a uvolňování

v kosterních svalech a udržují tak koncentraci glutaminu v krevní plasmě. Tyto

vlastnosti větvených aminokyselin podpořily jejich využití v rámci specielní výživy

zaměřené na zlepšení životních funkcí a klinických výsledků u vážně nemocných

pacientů53

.

Ovšem při studiu účinků potravinových doplňků bohatých na větvené

aminokyseliny zaměřené na středně až těžce nemocné pacienty byly pozorovány určité

rozpory; výsledky některých klinických pokusů ukázaly příznivé účinky BCAA na

zdravotní stav pacientů54,55

, zatímco jiné studie tyto účinky nepotvrdily56,57

. Možné

pozitivní vlivy potravinových doplňků bohatých na BCAA (zejména leucin) u pacientů

po chirurgických zákrocích a pacientů trpících rakovinou nejsou tedy zcela jasné.

Důkazy zatím naznačují, že potravinové doplňky se zvýšeným obsahem BCAA mohou

pozitivně působit pouze u těžce nemocných pacientů53

.

Unikátní vlastností nádorového onemocnění je schopnost karcinomu využít

aminokyseliny pro vlastní metabolické pochody a proliferativní a invazivní činnost.

24

Proto ochrana organismu vystaveného katabolickému stresu během onkologického

onemocnění doplňováním větvených aminokyselin může být méně efektivní v důsledku

příjmu BCAA nádorem, čímž je podporováno jeho rozšiřování, růst a schopnost

metastázovat. Nádor, stejně jako zdravé buňky, využívá BCAA pro syntézu bílkovin.

Metoda pozitronové emisní tomografie využívající 11

C-leucin, 11

C-methionin,

11C-tyrosin,

11C-fenylalanin,

11C-tryptofan a

11C-valin, používaná pro zobrazování

mozkových nádorů, poukázala na vysoké výživové nároky tumoru na množství

dostupných aminokyselin. Myšlenka, že doplňková výživa obohacená o aminokyseliny

může podněcovat nádorové bujení zvyšující se syntézou bílkovin je však méně

znepokojující pro BCAA doplňky, neboť právě větvené aminokyseliny jsou méně

zapojené v procesu buněčného množení, na rozdíl např. od methioninu nebo glutaminu.

Na druhou stranu BCAA jsou nezbytnými prekurzory a substráty pro zachování

fyziologických funkcí organismu i pro nádorový růst. Ideální by proto bylo nalézt

takovou dávku doplňkově přijímaných větvených aminokyselin, která by maximálně

zohledňovala nutriční nároky samotného organismu nad nároky zhoubného nádoru35

.

Z výše uvedené podrobné rešerše o používání a účincích větvených

aminokyselin sportovci, jedinci s vysokou tělesnou zátěží a nemocnými není možno

učinit jednoznačný závěr o pozitivním či negativním působení valinu, leucinu a

isoleucinu v organismu. O případných rozdílných účincích jednotlivých enantiomerů

těchto aminokyselin je známo ještě méně. Objasnění této problematiky je proto velkou

výzvou, neboť případné poznatky o stereoselektivním působení těchto látek by našly

široké využití - nejen z hlediska výživy sportovců, ale zejména v medicíně.

2.6 Principy enantioseparace v HPLC

V izotropickém (achirálním) prostředí mají chirální látky shodné vlastnosti a za

těchto podmínek tedy nemohou být rozděleny. Techniky separace enantiomerů jsou

založeny na principech chirálního rozpoznávání pozorovaného v přírodě - enantiomery

je možné rozdělit pouze v chirálním prostředí1.

Při separaci chirálních sloučenin jsou využívány dva základní postupy. Nepřímé

metody dělení jsou založeny na derivatizační reakci racemického analytu s opticky

čistým činidlem. Při této reakci vzniká pár diastereomerních sloučenin, které mají

25

rozdílné fyzikálně-chemické vlastnosti. K následné separaci je pak využíván achirální

chromatografický systém7.

Většího praktického využití nalezly přímé metody dělení, při kterých je do

separačního systému zaveden vhodný chirální selektor. Chirální selektor se nejběžněji

používá ve formě chirální stacionární fáze (CSP), tj. vázaný na pevný nosič, méně často

je přidáván do mobilní fáze1. Pro úspěšné rozdělení enantiomerů jsou zapotřebí

minimálně tři současně probíhající interakce mezi enantiomerem a chirálním selektorem

(tzv. model tříbodové interakce, odvozený v roce 1952 Dalglishem)58

, přičemž alespoň

jedna z interakcí má mít stereoselektivní charakter. K typům interakcí probíhajících

mezi chirálním analytem a chirálním selektorem se řadí: elektrostatické interakce,

vodíková vazba, hydrofóbní interakce, stérické stínění, π-π interakce a dipólové

interakce. Na míře rozdílných afinit enantiomerů k chirálnímu selektoru pak závisí

vlastní enantioseparace v chromatografickém systému59

.

2.6.1 Chirální stacionární fáze

V kapalinové chromatografii jsou pro chirální separace nejčastěji využívány

stacionární fáze tvořené silikagelovým nosičem s navázanými chirálními selektory na

bázi polysacharidů, cyklodextrinů, proteinů, makrocyklických antibiotik, ligandově

výměnné CSP a fáze tvořené syntetickými polymery59

. Právě makrocyklickým

antibiotikům bude, vzhledem k zaměření této práce, věnována větší pozornost.

2.6.2 Makrocyklická antibiotika

Makrocyklická antibiotika (MA) patří do skupiny nejmodernějších chirálních

selektorů. Nejčastěji používanými MA jsou glykopeptidy, mezi něž se řadí teikoplanin,

vankomycin, ristocetin A a avoparcin58

. Tato antibiotika patří do skupiny inhibitorů

syntézy buněčné stěny a jsou účinná proti aerobním a anaerobním grampozitivním

bakteriím60

.

Struktura makrocyklických antibiotik je značně složitá, obsahuje velké množství

chirálních center a vázaných funkčních skupin, které umožňují řadu interakcí

26

s chirálními analyty. CSP na bázi glykopeptidů lze použít v normálním pracovním

modu (stacionární fáze je polárnější než mobilní, uplatňují se zejména π-π, dipólové

interakce a H-vazby), v reverzním pracovním modu (mobilní fáze je polárnější,

převažují hydrofóbní interakce, vodíkové vazby a také inkluze) i v polárně organickém

modu (mobilní fáze je složena z acetonitrilu, methanolu, případně pouze methanolu a

malého množství triethylaminu a kyseliny octové na ovlivnění selektivity), ve kterém se

uplatňuje většina výše zmíněných interakcí - omezené jsou hydrofóbní interakce a

inkluze58,60

.

2.6.2.1 Teikoplanin

Teikoplanin je přirozeným produktem plísně Actinoplanes teicomycetus.

Struktura této biomolekuly (viz obr. 2.4) je velmi zajímavá; tzv. aglykonový koš je

tvořen čtyřmi makrocykly. Molekulu tvoří hexapeptidový řetězec, na který je navázáno

sedm benzenových jader, pět z nich je vzájemně propojeno třemi etherovými

skupinami. Na dvou benzenech je navázán atom chloru a na šesti jsou vázány

hydroxylové skupiny. Aglykon také obsahuje samostatnou karboxylovou skupinu a

primární amin, čímž molekula získává amfoterní charakter. Na aglykonový koš jsou

dále navázány tři cukerné zbytky, tvořené dvěma D-glukosaminy a D-mannosou. Na

jeden D-glukosamin je dále vázán acylový řetězec; přítomnost tohoto hydrofóbního

řetězce významně přispívá k nízké rozpustnosti molekuly ve vodě. V přírodě se

teikoplaninové glykopeptidy liší právě tímto uhlovodíkovým řetězcem61

.

CSP na bázi teikoplaninu jsou tvořeny směsí pěti izomerů, které se liší větvením

acylového řetězce. Molekuly chirálního selektoru jsou vázány kovalentní vazbou na

silikagelový nosič60

. Komerčně dostupné chirální kolony Chirobiotic T a T2 obsahují

silikagelový nosič o velikosti zrn 5 μm, ovšem velikost pórů je u kolony Chirobiotic T

120 Å a u Chirobiotic T2 200 Å. Navíc délka řetězce, který zprostředkovává vazbu

teikoplaninu na silikagel je u Chirobiotic T2 téměř dvojnásobná oproti délce řetězce

v Chirobiotic T62

.

27

Obr. 2.4 Strukturní vzorec molekuly teikoplaninu, chirální centra jsou označena

symboly R a S.

2.6.2.2 Teikoplanin aglykon

Molekulu teikoplanin aglykonu (viz obr. 2.5) lze připravit úpravou přírodního

teikoplaninu nebo také organickou syntézou. Od teikoplaninu se tato molekula liší, jak

je již z názvu patrné, nepřítomností cukerných zbytků včetně hydrofóbního acylového

řetězce. Tím je dosaženo snazšího přístupu analytů k aglykonové dutině, která obsahuje

další chirální centra a množství ionizovatelných skupin. Teikoplanin aglykon je rovněž

špatně rozpustný ve vodě60,63

.

28

Obr. 2.5 Strukturní vzorec molekuly teikoplanin aglykonu, chirální centra jsou

označena symboly R a S.

29

3 CÍL PRÁCE

Teikoplaninové CSP jsou významnou skupinou chirálních stacionárních fází,

které umožňují dělení široké škály strukturně odlišných analytů. Velmi dobré uplatnění

našly v oblasti separace aminokyselin. Novější komerční stacionární fáze, u které má

být silikagelový nosič více pokrytý teikoplaninem (Chirobiotic T2), je zatím málo

známý a málo vyzkoušený produkt.

Aminokyseliny se v nedávných letech staly velmi populárními výživovými

doplňky užívanými zejména sportovci. Významná skupina těchto doplňků pro sportovní

výživu obsahuje L-valin, L-leucin a L-isoleucin. Tyto výrobky jsou volně dostupné a

široce využívané zejména atlety a kulturisty. Během výrobního procesu ale mohou

v těchto produktech vznikat také příslušné D-formy daných aminokyselin. D-

aminokyseliny mají rozdílné biologické a fyziologické vlastnosti, proto je důležité

kontrolovat enantiomerní čistotu těchto výrobků, aby nedocházelo k výživovým ztrátám

z důvodu vzniku nemetabolizovatelných a biologicky nevyužitelných forem těchto

aminokyselin64

.

Cíle této práce lze shrnout do několika bodů:

Optimalizace metody pro separaci enantiomerů aminokyselin valinu, leucinu a

isoleucinu.

Charakterizace a vzájemné porovnání chirálních stacionárních fází na bázi

teikoplaninu.

Určení limitu detekce a limitu stanovení enantiomerů valinu, leucinu a

isoleucinu na chirální stacionární teikoplaninové fázi.

Sledování procesů vyvolávajících racemizaci aminokyselin obsažených

v měřeném vzorku BCAA 500.

30

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1 Seznam použitých chemikálií

methanol (MeOH): pro chromatografii (Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika)

acetonitryl (ACN): pro chromatografii (Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika)

kyselina chlorovodíková 35 %: (Lachema a.s., Neratovice, Česká republika)

deionizovaná voda (H2O) filtrovaná Milli-Q filtrovacím systémem (Millipore, Milford,

MA, USA)

anthracen: p. a. (Sigma, St. Louis, MO, USA)

benzen: p. a. (Sigma, St. Louis, MO, USA)

N,N-diethyltoluamid: p. a. (Sigma, St. Louis, MO, USA)

standardy aminokyselin: L-valin (L-Val): čistota ≥ 99,5 % (Fluka, Praha, Česká

republika), DL-valin (DL-Val): čistota ≥ 99,0 % (Fluka, Praha, Česká republika), L-

leucin (L-Leu): pro biochemii (Merck, Německo), DL-leucin (DL-Leu): čistota ≥ 99,0 %

(Fluka, Praha, Česká republika), L-isoleucin (L-Ile): čistota ≥ 99,5 % (Fluka, Praha,

Česká republika), D-isoleucin (D-Ile): čistota ≥ 98,0 % (Sigma-Aldrich, Praha, Česká

republika)

měřený vzorek: BCAA 500 tobolky: obsah: L-leucin 218,75 mg, L-valin 156,25 mg, L-

isoleucin 125,00 mg (Petr Novák - Bolid Beroun, ve spolupráci s NUTRI-EXACT CZ

s.r.o., Česká republika)

31

4.2 Charakterizace chirálních aminokyselin

V tabulce 4.1 jsou uvedeny základní charakterizace studovaných analytů.

Tabulka 4.1 Studované aminokyseliny a jejich vlastnosti: relativní molekulová

hmotnost (Mr), disociační konstanty (pKA25

, pKB25

), izoelektrický bod (pI25

) a

rozdělovací poměr (log P) tří měřených chirálních analytů, aminokyselin valinu, leucinu

a isoleucinu

Název VALIN LEUCIN ISOLEUCIN

Funkční vzorec CH3CH(CH3)CH(NH2)COOH CH3CH(CH3)CH2CH(NH2)COOH CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH

Mr 117,148 131,175 131,175

pKA25

9,719 9,744 9,758

pKB25

11,711 2,328 11,682

pI 25

6,002 6,036 6,038

log P *

-2,26

-1,52

-1,70

* http://www.syrres.com/esc/est_kowdemo.htm

4.3 Použité přístroje

Tato práce byla měřena na kapalinovém chromatografu Breeze System, který se

skládá z HPLC gradientové pumpy 1525, autosampleru 717Plus, termostatu Jetstream 2

Plus , UV/VIS dvoukanálového detektoru 2487 a osobního počítače s nainstalovaným

softwarem Breeze, verze 3.30 SPA (vše od firmy Waters, Milford, USA).

Pro separaci analytů byly využívány kolony s navázaným chirálním selektorem

teikoplaninem resp. jeho analogem teikoplanin aglykonem:

1) Chirobiotic T: kovová kolona, 25 cm x 4,6 mm, naplněná teikoplaninem vázaným

na silikagelový nosič, velikost zrn 5 µm, velikost póru 8 nm (Astec - Advanced

Separation Technologies, Inc., Whipanny, NJ, USA).

2) Chirobiotic T2: kovová kolona, 25 cm x 4,6 mm, naplněná teikoplaninem

navázaným na silikagelový nosič, velikost zrn 5 µm, velikost póru 8 nm (Supelco,

Bellefonte, USA).

3) Chirobiotic TAG: kovová kolona, 25 cm x 4,6 mm, naplněná teikoplanin aglykonem

vázaným na silikagelový nosič, velikost zrn 5 µm, velikost póru 8 nm (Astec -

Advanced Separation Technologies, Inc., Whipanny, NJ, USA).

32

Dále byly při práci používány ultrazvuková lázeň Ultrasonic LC 30 (Elma,

Německo), pH metr PHM-210 standardní (Radiometer, Kodaň, Dánsko), termostat,

který je sestaven z ponorného ohřívacího cirkulátoru MB a vodní lázně F12 (Julabo,

Seelbach, Německo), analytické váhy Mettler AE 240 (Greifensee, Švýcarsko),

míchačka MS2-S8 (IKA Works, Inc., Wilmington, NC, USA) a centifuga MC2

(Qualitron, Inc., Ohio, USA).

4.4 Příprava vzorků

Zásobní roztoky standardů aminokyselin byly připraveny rozpuštěním 1 mg

látky v 1 ml solventu tvořeného 60-i objemovými procenty (%obj.) methanolu a 40-i

objemovými procenty deinizované vody. Poté se tyto roztoky nechaly 10 minut

odstředit na centrifuze a následně byly přefiltrovány. Při měření kalibrační závislosti a

při sledování vlivu teploty na racemizaci byly zásobní roztoky standardů L-Val, L-Leu a

L-Ile připraveny rozpuštěním 1 mg látky v 1 ml deinizované vody a poté centrifugovány

10 minut.

Zásobní roztoky měřeného vzorku byly připraveny rozpuštěním 1mg BCAA 500

v 1 ml deinizované vody a poté se tyto roztoky nechaly 10 minut odstředit na centrifuze.

Příprava vzorků pro Waltersův test byla provedena podle návodu převzatého

z literatury65

.

4.5 Příprava mobilní fáze

Při chirálních separacích aminokyselin byla používána mobilní fáze složená

z methanolu a deionizované vody podle tabulky 4.2.

Tab. 4.2 Složení studovaných mobilních fází - objemová procenta methanolu a vody.

Složka S l o ž e n í m o b i l n í f á z e

MeOH (%obj.) 10 20 30 40 60 70 75 80 90

H2O (%obj.) 90 80 70 60 40 30 25 20 10

33

Při provádění Waltersova testu byla pro stanovení indexu hydrofobicity

používána mobilní fáze složená z 65 %obj. ACN a 35 %obj. H2O, pro stanovení

silanolového indexu byla používána mobilní fáze tvořená čistým ACN.

4.6 Podmínky měření

Používané mobilní fáze jsou uvedeny v kap. 4.5. Destilovaná voda pro přípravu

mobilní fáze byla před měřením vždy odvzdušňována v ultrazvukové lázni po dobu 10

minut. Průtoková rychlost mobilní fáze byla pro všechna měření 1 ml/min. Teplota

kolony v termostatu byla vždy nastavena na 25°C. Detekce aminokyselin byla

prováděna při vlnové délce 200 nm, pro Waltersův test při vlnové délce 254 nm.

Dávkované množství látky na kolonu bylo vždy 20 μl a jednotlivá měření byla

prováděná minimálně dvakrát, při měření kalibrační závislosti bylo každé měření

provedeno třikrát.

4.7 Zpracování naměřených dat

Naměřená data byla vyhodnocena programem Breeze, verze 3.30 SPA. Tímto

programem byly u jednotlivých analytů určeny retenční časy, retenční faktory, rozlišení,

a faktory symetrie, dále využité pro zpracování výsledků.

Hodnoty retenčních faktorů byly vypočítány podle vztahu

M

MR

t

ttk (1)

kde tR je retenční čas, tedy celkový čas, který analyt setrvá v koloně a tM je mrtvý objem

kolony, tedy retenční čas analytu, který se na koloně nezadržuje.

34

Hodnoty separačních faktorů byly vypočítány podle vztahu

i

j

k

k

ji, (2)

)

kde kj resp. ki jsou retenční faktory později resp. dříve eluující složky.

Hodnoty rozlišení byly vypočítány podle vztahu

21

12 ).(2

2,1 ww

tt RRR (3)

kde tR2 resp. tR1 jsou retenční časy později resp. dříve eluující složky, w1 a w2 jsou šířky

píků při základně.

Hodnota rozlišení je závislá na počtu teoretických pater kolony, separačním a

retenčním faktoru podle vztahu

j

j

ij

ij

k

knjiR

1

1

4,,

,

(4)

kde n je počet teoretických pater dané kolony.

Hodnoty faktoru symetrie (S) byly vypočítány ze vztahu (5) podle obrázku 4.1.

f

WS

2

05,0

(5)

Obr. 4.1 Názorné schéma ilustrující výpočet faktoru symetrie66

.

35

4.8 Postup Waltersova testu

Pro provedení Waltersova testu byl využit postup dle literatury65

.

4.9 Racemizační postupy

Při zkoumání vlivu nevhodných skladovacích podmínek na racemizaci byl

vzorek ponechán v letním období, tzn. červenec - září 2008, na světle a při laboratorní

teplotě v těchto formách: chráněný v tobolce, volně vysypaný na dno kádinky,

rozpuštěný v deionizované vodě a rozpuštěný v ovocném čaji. Okraje kádinek byly

překryty parafilmem. Vzorek chráněný tobolkou a vzorek volně vysypaný byly vždy

před měřením rozpuštěny, a to 1 mg látky v 1 ml deionizované vody, a poté odstředěny

po dobu 10 minut. Vzorky rozpuštěné v deionizované vodě a ovocném čaji byly

přefiltrovány a rovnou dávkovány na kolonu.

Na vznik racemizačních procesů ve vzorku byl také zkoumán vliv pH. K 1 mg L-

Val, L-Leu, L-Ile a vzorku byl přidán vždy 1 ml vodného roztoku HCl o molární

koncentraci 0,01 mol·dm-3

(pH 2,04; tj. přibližné pH kyseliny chlorovodíkové v lidském

žaludku) a o molární koncentraci 6,00 mol.dm-3

. Před nadávkováním na kolonu byly

vzorky rozpuštěné v 0,01 M HCl naředěny deionizovanou vodou v poměru 1:1. Vzorky

rozpuštěné v 6,00 M HCl byly deionizovanou vodou naředěny v poměru 1:5 a

dávkovány na kolonu jeden den a sedm dní po přípravě.

Dále byl zkoumán vliv teploty. Vzorky v tobolce, volně vysypaný a rozpuštěný

v dionizované vodě byly zahřívány v termostatu po dobu 15 minut při teplotách 25°C,

37°C, 50°C a 60°C. Dále byly jak zásobní roztoky standardů L-Val, L-Leu, L-Ile a

vzorku ve vodě, tak jejich roztoky v 6,00 molární HCl (před nadávkováním na kolonu

naředěné deionizovanou vodou v poměru 1:5) zahřívány v termostatu po dobu 30 minut

při teplotách 60°C a 90°C. Dalším z postupů bylo přelití obsahu jedné tobolky (500 mg)

500 ml destilované vody a ovocného čaje přivedených k varu. Tyto roztoky vzorku byly

po úplném vychladnutí přefiltrovány a dávkovány na kolonu.

36

5. VÝSLEDKY A DISKUZE

5.1 Optimalizace metody pro separaci enantiomerů valinu, leucinu a

isoleucinu

V BCAA potravinových doplňcích jsou v určitém poměru obsaženy

aminokyseliny L-valin, L-leucin a L-isoleucin, které však v důsledku nevhodných

skladovacích podmínek, mikrobiální kontaminace nebo již během výrobního procesu

mohou racemizovat. Vzniklé D-analogy jsou pro člověka z hlediska výživy nevyužitelné

a jejich přítomnost ve výrobku tak snižuje jeho nutriční hodnotu. Jedním z cílů této

práce proto bylo nalézt vhodnou HPLC metodu, která by umožnila rozdělení všech šesti

enantiomerů aminokyselin s dostatečnou hodnotou rozlišení a s jejíž pomocí by pak

bylo možné kontrolovat enantiomerní čistotu těchto výrobků. Za tímto účelem byla

měření prováděna postupně na chirálních kolonách Chirobiotic TAG, Chirobiotic T a

Chirobiotic T2.

Na chirální kolonu Chirobiotic TAG byla dávkována směs zásobních roztoků

DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu (v poměru 1/1/1) a měření byla prováděna za

použití mobilních fází MeOH/H2O 30/70 (v/v), MeOH/H2O 40/60 (v/v), MeOH/H2O

60/40 (v/v) a MeOH/H2O 70/30 (v/v). Chromatografy zobrazující enantioseparaci na

koloně Chirobiotic TAG při použití daných mobilních fází jsou znázorněny na obrázku

5.1. Ve všech případech eluovaly L-enantiomery aminokyselin před D-analogy. Při

žádné provedené chirální separaci však nebylo dosaženo požadovaných výsledků

z hlediska dostatečného rozlišení všech enantiomerů a symetrie píků. Z těchto důvodů

proto nebyla na této koloně prováděna další měření.

37

0 5 10 15 20

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

,6

,, 23

,65

,

6

,

6

,3

t (min)

54

1

4

32

1

543 2

1

(D)

(C)

(B)

(A)54

21

AU

(V

)

Obr. 5.1 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně

Chirobiotic TAG; mobilní fáze: (A) MeOH/H2O 30/70 (v/v), (B) MeOH/H2O 40/60

(v/v), (C) MeOH/H2O 60/40 (v/v), (D) MeOH/H2O 70/30 (v/v). Analyty: 1: L-Val,

2: L-Leu, 3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

Na chirální kolony Chirobiotic T a T2 byla taktéž dávkována směs zásobních

roztoků DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu (v poměru 1/1/1) za použití mobilních

fází MeOH/H2O v rozmezí 10/90 až MeOH/H2O 90/10 (v/v). Podrobnější srovnání

doplněná chromatogramy a příslušné diskuze výsledků jsou uvedeny v další části této

kapitoly (str. 38 až 42). Stejně jako u kolony Chirobiotic TAG eluovaly ve všech

případech L-enantiomery aminokyselin před D-analogy. Chirální separace provedené

v systémech s mobilními fázemi s nižším podílem methanolu (10 až 40 %obj.)

neposkytly na žádné z obou kolon dostatečná rozlišení všech šesti enantiomerů

aminokyselin. Optimalizace metody byla následně koncipována tak, aby došlo k eluci

všech L-enantiomerů v jednom píku a jednotlivé D-aminokyseliny (minoritní složky ve

vzorcích) se rozdělily až na základní linii. Hodnoty rozlišení, kterých bylo dosaženo na

kolonách Chirobiotic T a T2 při použití mobilních fází s vyšším podílem MeOH (60 až

80 %obj.) jsou shrnuty v tab. 5.1.

38

Tab. 5.1 Rozlišení píků D-enantiomerů na kolonách Chirobiotic T a T2 za použití

mobilních fází (MF) s vyšším obsahem methanolu.

Chirobiotic T Chirobiotic T2 MF

(MeOH/H2O, v/v) RD-Val, D-Leu RD-Leu, D-I le

MF (MeOH/H2O, v/v)

RD-Val, D-Leu RD-Leu, D-I le

60/40 - - 60/40 1,61 1,35

70/30 2,68 1,26 70/30 0,82 1,63

75/25 2,43 1,46 75/25 - -

80/20 2,11 1,58 80/20 - 2,39

Základní trend, který je možné pozorovat v tabulce 5.1, je pokles hodnot

rozlišení D-Val a D-Leu s rostoucím obsahem MeOH v mobilních fázích, a naopak

zlepšení rozlišení mezi D-Leu a D-Ile na obou srovnávaných kolonách. Při

enantioseparaci na koloně Chirobiotic T za použití mobilní fáze MeOH/H2O 70/30 (v/v)

bylo dosaženo následujících výsledků: L-enantiomery aminokyselin eluovaly v jediném

píku, zatímco D-formy eluovaly každá zvlášť v pořadí D-Val, D-Leu a D-Ile. Píky D-Leu

a D-Ile však nebyly rozlišeny až na základní linii. Při zvýšení podílu MeOH v mobilní

fázi na 80 %obj. se podařilo zlepšit rozlišení píků D-Leu a D-Ile, čehož však bylo

docíleno na úkor značného prodloužení doby analýzy. Proto byl zvolen vhodný

kompromis mezi hodnotou rozlišení a dobou analýzy a kontrola enantiomerní čistoty

měřeného vzorku BCAA 500 byla prováděna při mobilní fázi MeOH/H2O 75/25 (v/v).

Chromatografy zobrazující enantioseparaci aminokyselin na koloně Chirobiotic

T při použití výše popsaných mobilních fází jsou znázorněny na obrázcích 5.2 až 5.4.

V chromatogramech je navíc demonstrována vynikající opakovatelnost měření, neboť

dvě měření poskytují zcela totožné retence, rozlišení i tvary píků.

39

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

65

, ,

4

321AU

(V)

t (min)

Obr. 5.2 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně

Chirobiotic T; mobilní fáze: MeOH/H2O 70/30 (v/v). Analyty: 1: L-Val, 2: L-Leu,

3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

65

,,

4

321

AU (V

)

t (min)

Obr. 5.3 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně

Chirobiotic T; mobilní fáze: MeOH/H2O 80/20 (v/v). Analyty: 1: L-Val, 2: L-Leu,

3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

40

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04 ,,

654

321

AU (V

)

t (min)

Obr. 5.4 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně

Chirobiotic T; mobilní fáze: MeOH/H2O 75/25 (v/v). Analyty: 1: L-Val, 2: L-Leu,

3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

Při enantioseparaci prováděné na koloně Chirobiotic T2 s mobilní fází

MeOH/H2O 60/40 (v/v) došlo k obdobnému rozdělení enantiomerů pozorovanému na

koloně Chirobiotic T, při použití mobilní fáze MeOH/H2O 75/25 (v/v): L-enantiomery

eluovaly společně v jednom píku, poté následovala eluce D-forem aminokyselin

v pořadí D-Val, D-Leu a D-Ile. Při zvýšení podílu MeOH v mobilní fázi na 70 %obj. se

zmenšila hodnota rozlišení píků D-Val a D-Leu a v mobilní fázi MeOH/H2O 80/20 (v/v)

pak D-Val a D-Leu eluovaly společně v jednom píku.

Na obrázcích 5.5 až 5.7 jsou pro srovnání pod sebou zobrazeny chromatogramy

separace směsi DL-Val, DL-Leu a DL-Ile na kolonách Chirobiotic T a Chirobiotic T2

v mobilních fázích MeOH/H2O 60/40 (v/v), MeOH/H2O 70/30 (v/v) a MeOH/H2O

80/20 (v/v).

41

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04 0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

65

, ,

(B)

4

321

AU

(V)

t (min)

6

,

(A)

54

321A

U (V

)

t (min)

Obr. 5.5 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně (A)

Chirobiotic T a (B) Chirobiotic T2; mobilní fáze: MeOH/H2O 60/40 (v/v). Analyty:

1: L-Val, 2: L-Leu, 3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

65

,,

4

321

(B)

AU

(V)

t (min)

65

,,

4

321

(A)

AU

(V)

t (min)

Obr. 5.6 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně (A)

Chirobiotic T a (B) Chirobiotic T2; mobilní fáze: MeOH/H2O 70/30 (v/v). Analyty:

1: L-Val, 2: L-Leu, 3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

42

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

6

,54

,, 321

(B)

AU

(V)

t (min)

65

,,

4

321

(A)

AU

(V)

t (min)

Obr. 5.7 Chirální separace směsi DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na koloně (A)

Chirobiotic T a (B) Chirobiotic T2; mobilní fáze: MeOH/H2O 80/20 (v/v). Analyty:

1: L-Val, 2: L-Leu, 3: L-Ile, 4: D-Val, 5: D-Leu, 6: D-Ile.

Z obrázků 5.5 až 5.7 je na první pohled patrné zkrácení doby analýzy při použití

chirální stacionární fáze s vyšším pokrytím teikoplaninem. Tuto skutečnost je však třeba

dát do souvislosti s větší porozitou nosiče stacionární fáze (Chirobiotic T 120 Å,

Chirobiotic T2 200 Å), než s pokrytím chirálním selektorem. Z hlediska rozlišení

jednotlivých enantiomerů aminokyselin, se zvláštním důrazem na rozdělení D-

enantiomerů, lze považovat za nejvhodnější separační systémy: (a) Chirobiotic T2 -

MeOH/H2O 60/40 (v/v) a (b) Chirobiotic T - MeOH/H2O - 70/30 (v/v) nebo 80/20

(v/v).

Ačkoliv se ani na jedné z použitých kolon nepodařilo nalézt takové separační

podmínky, za kterých by se všech šest enantiomerů dávkované směsi DL-valinu, DL-

leucinu a DL-isoleucinu rozdělilo s dostatečným rozlišením, následná kontrola optické

čistoty vzorku BCAA 500 byla prováděna na koloně Chirobiotic T při použití mobilní

fáze MeOH/H2O 75/25 (v/v). V tomto separačním systému bylo dosaženo

odpovídajícího rozlišení všech tří D-forem aminokyselin, což bylo podmínkou pro

následné kvantitativní a kvalitativní zhodnocení přítomnosti D-enantiomerů

aminokyselin produkovaných během racemizačních pochodů ve vzorcích potravinových

doplňků.

43

5.2 Charakterizace a vzájemné porovnání chirálních stacionárních fází

na bázi teikoplaninu

5.2.1 Waltersův test

Waltersův test se používá pro klasifikaci reverzních achirálních stacionárních

fází. Je založen na zhodnocení převládajících retenčních interakčních mechanismů v

RPLC, hydrofobicitě a silanofilicitě stacionární fáze. Hydrofóbní interakce, které

závisejí na četnosti a délce uhlovodíkových řetězců, jsou vyjádřeny poměrem retenčních

faktorů anthracenu a benzenu v mobilní fázi složené z acetonitrilu a vody (tzv. index

hydrofobicity HI). Silanolové interakce, které jsou závislé na množství přístupných

silanolových skupin, jsou vyjádřeny poměrem retenčních faktorů N,N-diethyltoluamidu

(N,N-DETA) a anthracenu v mobilní fázi tvořené čistým acetonitrilem (tzv. silanolový

index SI). Právě v čistém acetonitrilu jsou dobře solvatovány alkylové řetězce (např.

C18, C8). Zadržování N,N-DETA souvisí se silanolovou aktivitou stacionární fáze,

zatímco retence anthracenu je spojována výlučně s hydrofóbními interakcemi67

.

Waltersův test byl proveden na kolonách Chirobiotic T a T2. Vypočtené indexy

hydrofobicity a silanolové indexy jsou znázorněny v tabulce 5.2.

Tabulka 5.2 Index hydrofobicity (HI) a silanolový index (SI) změřené na kolonách

Chirobiotic T a Chirobiotic T2.

kolona HI

k (anthracen)/k (benzen) SI

k (N,N-DETA)/k (anthracen)

Chirobiotic T 0,95 2,17

Chirobiotic T2 1,18 1,76

Waltersův test sice není navržen pro porovnávání kolon na bázi teikoplaninu a

podobných, a také reverzní systém s použitím teikoplaninových CSP není typickým

reverzním systémem, přesto lze z hodnot uvedených v tabulce 5.2 učinit určité závěry.

Relativně nízké hodnoty HI potvrzují skutečnost, že teikoplaninové kolony se od

reverzních fází typu C18, kde se hodnoty HI pohybují v rozmezí 3 - 4 (podle konkrétní

kolony), značně liší. Přitom CSP Chirobiotic T2 s vyšším pokrytím chirálním

selektorem má hodnotu HI poněkud vyšší než kolona Chirobiotic T. Rozdíl mezi oběma

chirálními stacionárními fázemi z pohledu indexu hydrofobicity však není velký. Tato

44

skutečnost vyvolává otázku, jak moc se pokrytí obou stacionárních fází teikoplaninem

liší. Výrobce totiž hodnoty pokrytí neudává.

Srovnání hodnot silanolového indexu koresponduje s výsledky získanými pro

HI, tj. vyšší hodnotě HI pro Chirobiotic T2 odpovídají nižší hodnoty SI, zatímco pro

kolonu Chirobiotic T je tomu naopak. Silanolové interakce se v retenčním mechanismu

tedy zřejmě uplatňují více při použití kolony s menším pokrytím chirálním selektorem.

Větší rozdíl v hodnotách SI pro zkoumané kolony oproti hodnotám HI má však

pravděpodobně souvislost i s delším řetězcem („spacerem“), kterým je teikoplanin

vázán na silikagelový nosič v případě kolony Chirobiotic T2, kde lze tudíž předpokládat

větší odstínění silanolových skupin, než v případě kolony Chirobiotic T.

5.2.2 Porovnání retenčních faktorů enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na

kolonách Chirobiotic T, T2 a TAG

Retenční faktor charakterizuje retenci, tzn. jak moc jsou analyty na koloně

zadržovány a zpožďovány.

Porovnání retenčních faktorů jednotlivých enantiomerů aminokyselin valinu,

leucinu a isoleucinu v závislosti na procentuálním obsahu MeOH v mobilní fázi na

kolonách Chirobiotic T, T2 a TAG jsou znázorněna na obrázcích 5.8 až 5.13. Při měření

na koloně Chirobiotic TAG byla dávkována směs DL-valinu, DL-leucinu a DL-

isoleucinu, v případě kolon Chirobiotic T a T2 byly racemáty těchto tří aminokyselin

dávkovány zvlášť.

45

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

Obr. 5.8 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny L-valinu na kolonách Chirobiotic

T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až MeOH/H2O 90/10

(v/v).

Obr. 5.9 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny L-leucinu na kolonách Chirobiotic

T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až MeOH/H2O 90/10

(v/v).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

46

Obr. 5.10 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny L-isoleucinu na kolonách

Chirobiotic T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

Obr. 5.11 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny D-valinu na kolonách

Chirobiotic T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

47

Obr. 5.12 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny D-leucinu na kolonách

Chirobiotic T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

Obr. 5.13 Porovnání retenčních faktorů aminokyseliny D-isoleucinu na kolonách

Chirobiotic T, T2 a TAG při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

k

T

T2

TAG

48

Porovnáme-li kolony Chirobiotic T, T2 a TAG z hlediska retence analytů (obr.

5.8 až 5.13), je zřejmé, že nejnižších retenčních faktorů bylo pro všechny enantiomery

dosaženo na koloně Chirobiotic T2. Nejvyšší retence bylo naopak dosaženo na koloně

Chirobiotic T pro L-enantiomery a pro D-enantiomery na koloně Chirobiotic TAG. Ze

závislostí retenčních faktorů na množství MeOH v mobilní fázi dále vyplývá, že s

rostoucím podílem MeOH v mobilní fázi většinou roste retence u všech šesti

enantiomerů na všech třech použitých kolonách. Tento trend je dobře patrný zejména na

koloně Chirobiotic T, kde u mobilních fází s nižším procentem MeOH retenční faktor

vzrůstá jen mírně, u L-leucinu a L-isoleucinu dokonce nepatrně klesá (obr. 5.9 a 5.10),

avšak u mobilních fází s nadpolovičním podílem MeOH již retence u všech šesti

enantiomerů prudce roste.

Na koloně Chirobiotic T2 již není výše popsaný trend tolik výrazný. Při nižším

procentu MeOH v mobilní fázi retenční faktor (s výjimkou L-leucinu, obr. 5.9) mírně

vzrůstá. Při porovnání retence za použití mobilní fáze MeOH/H2O 10/90 (v/v) a

MeOH/H2O 20/80 (v/v) lze konstatovat, že zadržování všech analytů (kromě D-valinu a

D-isoleucinu, obr. 5.11 a 5.13) na této koloně je vyšší při použití mobilní fáze s nižším

obsahem MeOH. V mobilních fázích s nadpolovičním obsahem organické fáze se

retence analytů na této koloně, stejně tak jako u Chirobiotic T, zvyšuje. Výjimku lze

nalézt u retenčních faktorů L-leucinu, L-isoleucinu a D-leucinu (obr. 5.9, 5.10 a 5.12) v

mobilní fázi s 90 %obj. MeOH. Důvodem změny retence může být fakt, že při použití

mobilní fáze s nadbytkem organického modifikátoru se mohou při separačním

mechanismu spíše uplatňovat interakce, které jsou charakterističtější pro polárně-

organický separační mod.

Na koloně Chirobiotic TAG bylo měřeno pouze za použití mobilních fází s 30 až

70 %obj. MeOH. Retenční faktory se na této koloně také zvyšují s rostoucím podílem

MeOH v mobilní fázi, dobře patrné je to zejména u všech tří D-enantiomerů (obr. 5.11

až 5.13). Retence L-leucinu v mobilních fázích 30 až 60 %obj. MeOH také vzrůstá, při

70 % MeOH však již klesá (obr. 5.9). V poslední zmíněné mobilní fázi eluuje L-leucin

v jednom píku společně s L-valinem a L-isoleucinem (viz obr. 5.1). Retence

jednotlivých L-enantiomerů, jejichž retenční časy jsou velmi blízké, může být navíc

vzájemně ovlivňována.

Za nejvýraznější výsledek, vyplývající z obr. 5.8 až 5.13, lze považovat

minimální vliv složení mobilní fáze na retenci všech sledovaných analytů na koloně

Chirobiotic T2. Z analytického pohledu má tato skutečnost pozitivní dopad na

49

robustnost metody. Naopak negativním důsledkem je menší prostor pro optimalizaci

separace.

Grafy na obrázcích 5.14 až 5.17 slouží k vzájemnému porovnání retenčních

faktorů L- resp. D-enantiomerů aminokyselin na procentuálním podílu MeOH

v mobilních fázích na kolonách Chirobiotic T a T2.

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

0 20 40 60 80 100

% MeOH

k

L-Val

L-Leu

L-Ile

Obr. 5.14 Porovnání retenčních faktorů aminokyselin L-valinu, L-leucinu a L-isoleucinu

na koloně Chirobiotic T při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

50

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80 100

% MeOH

k

D-Val

D-Leu

D-Ile

Obr. 5.15 Porovnání retenčních faktorů aminokyselin D-valinu, D-leucinu a

D-isoleucinu na koloně Chirobiotic T při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v)

až MeOH/H2O 90/10 (v/v).

Obr. 5.16 Porovnání retenčních faktorů aminokyselin L-valinu, L-leucin a L-isoleucinu

na koloně Chirobiotic T2 při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90 (v/v) až

MeOH/H2O 90/10 (v/v).

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1,8

1,9

0 20 40 60 80 100

% MeOH

k

L-Val

L-Leu

L-Ile

51

Obr. 5.17 Porovnání retenčních faktorů aminokyselin D-valinu, D-leucinu a

D-isoleucinu na koloně Chirobiotic T2 při použití mobilních fází MeOH/H2O 10/90

(v/v) až MeOH/H2O 90/10 (v/v).

Jak je patrné z grafů na obrázcích 5.14 až 5.17, retence aminokyselin valinu,

leucinu a isoleucinu v mobilních fázích s nižším obsahem methanolu na obou

studovaných kolonách velmi dobře korelují s hodnotami log P (tab. 4.1).

Nejhydrofóbnější DL-leucin je při použití mobilních fází s nadpolovičním podílem H2O

zadržován nejvíce. Naopak nejnižší hodnotu log P má DL-valin, u něhož se hydrofóbní

interakce uplatňují již v menší míře a je v těchto mobilních fázích zadržován nejméně.

Z grafů závislosti retenčních faktorů L-enantiomerů a D-enantiomerů na podílu

MeOH v mobilní fázi dále vyplývá, že na koloně Chirobiotic T i T2 dochází při

zvyšujícím se množství MeOH v mobilní fázi k záměně elučního pořadí některých

enantiomerů.

Na koloně Chirobiotic T se při použití mobilní fáze obsahující přibližně 66 %obj.

MeOH mění eluční pořadí L-valinu a L-isoleucinu, od ~ 78 %obj. MeOH v mobilní fázi

byly získány stejné hodnoty retenčních faktorů L-leucinu a L-valinu (obr. 5.14). Rovněž

eluční pořadí mezi D-enantiomery se na koloně Chirobiotic T mění; při ~ 45 %obj.

MeOH v mobilní fázi se zaměňuje eluce mezi D-leucinem a D-isoleucinem (obr. 5.15).

Zatímco v případě CSP Chirobiotic T jsou získané závislosti (obr. 5.14 a 5.15)

relativně konzistentní, tj. trend závislostí je jednoznačný, pouze dochází při určitém

složení mobilní fáze k záměně elučního pořadí dvou enantiomerů, grafy zkonstruované

pro CSP s vyšším pokrytím teikoplaninem (obr. 5.16 a 5.17) jsou mnohem

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 20 40 60 80 100

% MeOH

k

D-Val

D-Leu

D-Ile

52

komplikovanější (obzvláště v případě závislostí pro L-enantiomery), a tudíž obtížněji

interpretovatelné. Získané výsledky je možné přibližně popsat následujícím způsobem.

Na koloně Chirobiotic T2 lze, ve srovnání s Chirobiotic T, ještě častěji pozorovat

změnu elučního pořadí se zvyšujícím se množstvím MeOH v mobilní fázi. Při použití

mobilní fáze obsahující ~ 53 %obj. MeOH se zaměňuje eluce mezi L-valinem a L-

isoleucinem (L-Ile eluuje před L-Val), dále se při ~ 60 %obj. MeOH mění pořadí eluce

mezi L-valinem a L-leucinem (L-Leu eluuje před L-Val). Se zvýšením podílu MeOH na

72 %obj. se zaměňuje eluční pořadí mezi L-leucinem a L-isoleucinem (L-Leu eluuje před

L-Ile) (obr. 5.16). Také mezi D-analogy dochází k záměně eluce; při ~ 42 %obj. MeOH

v mobilní fázi se zaměňuje eluce D-leucinu a D-isoleucinu (D-Leu eluuje před D-Ile), při

79 %obj. MeOH se mění pořadí D-valinu a D-leucinu (D-Leu eluuje před D-Val)

(obr. 5.17).

5.2.3 Porovnání separačních faktorů enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na

kolonách Chirobiotic T a T2

Separační faktor vyjadřuje selektivitu separace.

Na obrázcích 5.18 až 5.20 jsou znázorněny grafy závislosti separačního faktoru

DL-valinu, DL-leucinu a DL-isoleucinu na složení mobilní fáze na kolonách Chirobiotic

T a T2.

53

Obr. 5.18 Závislost separačního faktoru DL-valinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2. Body jsou proloženy polynomem

2. stupně.

Obr. 5.19 Závislost separačního faktoru DL-leucinu na procentuálním obsahu

methanolu v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2. Body jsou proloženy

polynomem 2. stupně.

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

0 20 40 60 80 100

% MeOH

α

T

T2

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

0 20 40 60 80 100

% MeOH

α

T

T2

54

Obr. 5.20 Závislost separačního faktoru DL-isoleucinu na procentuálním obsahu

methanolu v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2. Body jsou proloženy

polynomem 2. stupně.

Jak je zřejmé z obrázků 5.18 až 5.20, s rostoucím podílem MeOH v mobilní fázi

roste selektivita separačního systému vůči separovaným analytům. U nižších obsahů

MeOH v mobilní fázi není příliš patrný rozdíl v selektivitě mezi kolonami Chirobiotic T

a T2 (zejména u DL-valinu a DL-isoleucinu, obr. 5.18 a 5.20). U nadpolovičního podílu

MeOH v mobilní fázi se zvyšuje rozdíl v selektivitě mezi oběma kolonami. Vyšších

hodnot separačních faktorů bylo ve všech třech případech dosaženo na koloně

Chirobiotic T. Nejnižší separační faktor byl získán u DL-valinu na koloně Chirobiotic

T2 v mobilní fázi MeOH/H2O 10/90 (v/v), naopak nejvyšší selektivita byla dosažena u

DL-isoleucinu na koloně Chirobiotic T při použití mobilní fáze MeOH/H2O 90/10 (v/v).

Z celkového pohledu bylo nejnižší selektivity dosaženo u DL-valinu a nejvyšší u DL-

isoleucinu.

1

1,4

1,8

2,2

2,6

3

0 20 40 60 80 100

% MeOH

α

T

T2

55

5.2.4 Porovnání rozlišení enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na kolonách

Chirobiotic T a T2

Rozlišení charakterizuje míru rozdělení dvou analytů (píků), popř. míru

vzájemného překrývání dvou sousedních píků.

Na obrázcích 5.21 až 5.23 jsou znázorněny grafy závislosti rozlišení DL-valinu,

DL-leucinu a DL-isoleucinu na složení mobilní fáze na kolonách Chirobiotic T a T2.

Obr. 5.21 Závislost rozlišení DL-valinu na procentuálním zastoupení methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

R

T

T2

56

Obr. 5.22 Závislost rozlišení DL-leucinu na procentuálním zastoupení methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

Obr. 5.23 Závislost rozlišení DL-isoleucinu na procentuálním zastoupení methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

Z grafů závislosti rozlišení na obsahu MeOH v mobilní fázi na obrázcích 5.21 až

5.23 vyplývá, že s rostoucím procentuálním podílem MeOH v mobilní fázi roste

rozlišení L- i D-enantiomerů všech tří měřených aminokyselin. Vyšších hodnot rozlišení

bylo dosaženo ve všech případech na koloně Chirobiotic T. Dostatečně rozlišit (R ≥ 1,5)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

R

T

T2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

R

T

T2

57

enantiomery DL-valinu se podařilo na koloně Chirobiotic T při použití mobilní fáze

s obsahem vyšším než 30 %obj. MeOH, na Chirobiotic T2 s obsahem min. 40 %obj.

MeOH. U enantiomerů DL-leucinu a DL-isoleucinu bylo dostatečného rozlišení

dosaženo na obou kolonách již v mobilní fázi s nejnižším zkoumaným množstvím

MeOH, tedy 10 %obj..

V grafu na obr. 5.23 (DL-isoleucin) je na obou separačních kolonách zřejmý

pokles hodnoty rozlišení v mobilní fázi MeOH/H2O 90/10 (v/v). Tento jev lze vysvětlit

v souvislosti s výsledky uvedenými v kap. 5.2.3, tj. s jednoznačným trendem závislosti

pro separační faktor, zhoršením symetrie píků (viz kap. 5.2.5) resp. účinnosti separace

při vyšších hodnotách retence (viz rovnice (4) na str. 34). Dalšími faktory, které mohou

mít vliv na pozorovaný pokles rozlišení enantiomerů isoleucinu, může být zatížení

výsledků získaných při použití mobilní fáze s vysokým obsahem MeOH větší chybou,

neboť malé a rozmyté píky bylo obtížné integrovat. Lze také zvážit i změnu separačního

mechanismu při přechodu k polárně organickému modu.

5.2.5 Porovnání symetrie píků enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na

kolonách Chirobiotic T a T2

Faktor symetrie charakterizuje tvar píku daného analytu. Pokud je hodnota

faktoru symetrie rovna jedné, pík je zcela symetrický (má gaussovský tvar), pokud je

menší než jedna, pík je nesymetrický vpředu, pokud je větší než jedna, pík je rozmytý,

tak zvaně chvostuje.

Na obrázcích 5.24 až 5.29 jsou znázorněny grafy závislosti symetrie píků

enantiomerů valinu, leucinu a isoleucinu na složení mobilní fáze na kolonách

Chirobiotic T a T2.

58

Obr. 5.24 Závislost symetrie píku L-valinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

Obr. 5.25 Závislost symetrie píku L-leucinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

59

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

Obr. 5.26 Závislost symetrie píku L-isoleucinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

Obr. 5.27 Závislost symetrie píku D-valinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

60

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

Obr. 5.28 Závislost symetrie píku D-leucinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 20 30 40 60 70 80 90

% MeOH

S

T

T2

Obr. 5.29 Závislost symetrie píku D-isoleucinu na procentuálním obsahu methanolu

v mobilní fázi na kolonách Chirobiotic T a T2.

Z grafů na obrázcích 5.24 až 5.29 vyplývá, že hodnoty faktoru symetrie jsou u

všech enantiomerů na obou kolonách větší, než jedna, čili u všech píků docházelo

k jejich rozmývání. Jedinou výjimkou je pouze L-valin v mobilní fázi MeOH/H2O 10/90

(v/v) (obr. 5.24), kde faktor symetrie dosahoval hodnoty mírně pod jedna. Z celkového

pohledu se zdá být poněkud lepší symetrie píků na koloně Chirobiotic T2, což je patrné

61

zejména u mobilních fází s vyšším obsahem MeOH. Při nižších obsazích MeOH

v mobilních fázích je naopak nižších hodnot faktoru symetrie u většiny enantiomerů

dosahováno na koloně Chirobiotic T.

V případě píku L-valinu (obr. 5.24) je na koloně Chirobiotic T zřejmý růst

hodnoty faktoru symetrie se zvyšujícím se podílem MeOH v mobilní fázi. To má také

souvislost s retenčním faktorem - čím déle je analyt na koloně zadržován, tím více

dochází k rozmývání jeho zóny. Na koloně Chirobiotic T2 rovněž u nižších obsahů

MeOH faktor symetrie roste, s nadpolovičním podílem MeOH v mobilní fázi však

zůstává přibližně konstantní resp. klesá.

Symetrie píku L-leucinu (obr. 5.25) na koloně Chirobiotic T opět mírně vzrůstá, i

když hodnoty faktoru symetrie jsou u nižších a vyšších obsahů MeOH vcelku

vyrovnané. Na koloně Chirobiotic T2 symetrie píku L-leucinu s rostoucím množstvím

MeOH spíše klesá.

Hodnoty faktoru symterie píku L-isoleucinu (obr. 5.26) jsou na koloně

Chirobiotic u nižších obsahů MeOH opět vyrovnané, s nadpolovičním podílem MeOH

se faktor symetrie zvyšuje. Na koloně Chirobiotic T2 faktor symetrie s rostoucím

množstvím MeOH mírně klesá, i když hodnoty jsou u všech používaných mobilních

fází velmi vyrovnané. Lze říci, že výsledky získané pro leucin a isoleucin jsou

analogické.

V grafu na obrázku 5.27 nejsou vyneseny hodnoty faktoru symetrie u mobilních

fází s 10 až 30 %obj. MeOH. Při těchto obsazích MeOH se totiž píky L- a D-leucinu

natolik překrývaly, že software nebyl schopen vypočítat faktor symetrie píku D-leucinu.

U mobilních fází s vyšším obsahem MeOH je však již patrný růst faktoru symetrie se

stoupajícím procentem MeOH v mobilní fázi, zejména na koloně Chirobiotic T.

Pro symetrie píků D-leucinu a D-isoleucinu (obr. 5.28, 5.29) nelze jednoznačně

říci, zda-li má závislost faktoru symetrie na složení mobilní fáze stoupající nebo

klesající charakter. Vzhledem k tomu, že se píky D-leucinu a D-isoleucinu při nižších

obsazích MeOH v mobilní fázi překrývaly s píky jejich L-analogů, nejsou výpočty

hodnot faktorů symetrie zcela přesné.

62

5.3 Určení meze detekce a meze stanovení DL-valinu, DL-leucinu

a DL-isoleucinu

Kalibrace byla provedena na koloně Chirobiotic T při použití mobilní fáze

optimalizovaného složení MeOH/H2O 75/25 (v/v). V tomto separačním systému

eluovaly L-aminokyseliny v jednom píku, zatímco D-enantiomery eluovaly každý

zvlášť. Z tohoto důvodu jsou hodnoty meze detekce (LOD) a meze stanovení (LOQ)

vypočítány pro každou D-aminokyselinu zvlášť, zatímco hodnoty LOD a LOQ pro L-

enantiomery představují sumu koncentrací všech tří L-forem.

Na kolonu byla dávkována směs standardů DL-valinu, DL-leucinu a DL-

isoleucinu rozpuštěných v H2O o pěti různých koncentracích získaných postupným

ředěním výchozí koncentrace směsi aminokyselin. Jednotlivá měření byla provedena

vždy třikrát. Koncentrace jednotlivých enantiomerů aminokyselin použitých k

proměření kalibrační závislosti jsou uvedeny v tabulce 5.3.

Tabulka 5.3 Koncentrace standardů aminokyselin valinu, leucinu a isoleucinu použité

pro kalibraci.

l á t k o v á k o n c e n t r a c e (mg/ml)

L-Val, L-Leu, L-Ile D-Val D-Leu D-Ile

0,3137 0,1047 0,1041 0,1050

0,6275 0,2094 0,2081 0,2100

1,2550 0,4188 0,4163 0,4200

2,5100 0,8375 0,8325 0,8400

5,0200 1,6750 1,6650 1,6800

Kalibrační přímky pro jednotlivé enantiomery byly sestrojeny ze závislosti

výšky píku (μV) na koncentraci analytu (mg/ml). Odečtená výška šumu základní linie

(σ) činila 4 μV. Z jednotlivých kalibračních rovnic byly vypočítány limity detekce a

limity stanovení pro každý enantiomer dosazením hodnot 3σ resp. 10σ za y.

Výsledky získané z kalibračních závislostí jsou uvedeny v tabulce 5.4.

63

Tabulka 5.4 Kalibrační rovnice, koeficienty spolehlivosti, limity detekce (LOD) a

limity stanovení (LOQ) enantiomerů aminokyselin valinu, leucinu a isoleucinu pro

optimalizovanou metodu k hodnocení enantiomerní čistoty měřeného vzorku.

aminokyselina kalibrační rovnice R LOD

(10-4

mg/ml) LOQ

(10-4

mg/ml)

L-Val, L-Leu, L-Ile y = 46913x + 13874 0,998 2,558 6,395

D-Val y = 41001x + 4221 0,998 2,927 7,317

D-Leu y = 21931x + 2677 0,997 5,472 13,679

D-Ile y = 15134x + 3312 0,991 7,929 19,823

Hodnoty limitů detekce se pohybovaly řádově v desetinách µg/ml a hodnoty

limitů stanovení dosahovaly v případě D-enantiomerů aminokyselin spíše jednotek

µg/ml. Z tabulky 5.4 je zřejmé, že hodnoty LOD i LOQ rostou v korelaci s elučním

pořadím enantiomerů, což souvisí se zhoršováním tvarů píků analytů více zadržovaných

na koloně.

5.4 Studium procesů vyvolávajících racemizaci aminokyselin ve vzorku

Jedním z cílů této části práce bylo určit podmínky prostředí, které se případně

mohou podílet na racemizaci L-aminokyselin obsažených v měřeném vzorku. Studován

byl vliv teploty, světla a rovněž kyselého pH (po orálním příjmu BCAA v lidském

žaludku).

Nejprve byl na kolonu nadávkován zásobní roztok vzorku skladovaného v

chladu a temnu. Po kontrole jeho enantiomerní čistoty byl vzorek vystaven výše

zmíněným podmínkám a byl zkoumán jejich potenciální vliv na racemizaci L-valinu, L-

leucinu a L-isoleucinu ve vzorku. Použité pracovní postupy jsou přesně popsány

v kap. 4.9.

Přítomnost D-enantiomerů však v žádném ze sledovaných vzorků prokázána

nebyla. Pro tento fakt jsou dvě možná vysvětlení:

Aminokyseliny obsažené ve vzorku nepodléhají racemizaci za daných

podmínek, což je příznivou zprávou pro ty, kteří výživové BCAA doplňky

užívají. V práci64

, zabývající se enantioseparací DL-aminokyselin s rozvětveným

řetězcem metodou kapilární elektroforézy, byla také potvrzena optická čistota

vybraných komerčních BCAA doplňků pro sportovní výživu.

64

V úvahu připadá také možnost, že proces racemizace proběhl, ale množství

vzniklých D-analogů aminokyselin bylo nízké a vzhledem k malé citlivosti

používaného UV/VIS detektoru byla hodnota koncentrace D-enantiomerů pod

mezí detekce (LOD).

Pro ověření jedné či druhé hypotézy by bylo nutné provést derivatizaci vhodným

činidlem, které by zvýšilo citlivost detekce.

65

6 ZÁVĚR

V této práci byla optimalizována metoda vysokoúčinné kapalinové

chromatografie pro separaci enantiomerů aminokyselin valinu, leucinu a isoleucinu.

L-formy těchto aminokyselin jsou obsaženy v BCAA potravinových doplňcích pro

sportovce.

Měření byla postupně prováděna na separačních kolonách Chirobiotic T, T2 a

TAG. Pro účely následné kontroly enantiomerní čistoty vzorku bylo nejlepší chirální

separace dosaženo na koloně Chirobiotic T s mobilní fází MeOH/H2O 75/25 (v/v). Při

tomto složení chromatografického systému se sice nepodařilo vzájemně oddělit L-

enantiomery aminokyselin, ovšem D-formy byly dostatečně rozlišeny, což bylo pro

kontrolu přítomnosti D-enantiomerů v měřeném vzorku velmi vhodné.

Všechny tři používané chirální stacionární fáze byly porovnány z hlediska

retence analytů. Na koloně Chirobiotic T byly L-enantiomery aminokyselin zadržovány

ze studovaných kolon nejvíce. Naopak retenční faktory D-enantiomerů byly nejvyšší na

koloně Chirobiotic TAG.

Dále byly podrobně studovány a porovnávány kolony Chirobiotic T a T2

z hlediska elučního pořadí, separačních faktorů, rozlišení a rozmývání zón analytů.

Eluční pořadí bylo na všech kolonách na bázi teikoplaninu ve všech zkoumaných

separačních systémech vždy stejné - L-enantiomer eluoval před D-aminokyselinou. Při

změně složení mobilní fáze docházelo, především na stacionární fázi Chirobiotic T2,

k záměně retenčního pořadí jednotlivých D-aminokyselin. Na koloně Chirobiotic T bylo

dosaženo lepší selektivity separace enantiomerů. Vyšších hodnot rozlišení píků D- a L-

enantiomerů jednotlivých aminokyselin bylo jednoznačně dosaženo rovněž na koloně

Chirobiotic T. Dále byly tyto dvě kolony porovnávány z hlediska symetrie píků. Z

výsledků nelze vyvodit zcela jednoznačný závěr, na které koloně docházelo k menšímu

rozšiřování zón měřených aminokyselin. Z celkového pohledu je však patrné, že na

koloně Chirobiotic T2 bylo dosaženo účinnější separace enantiomerů studovaných

aminokyselin.

Na kolonách Chirobiotic T a T2 byl také proveden Waltersův test, ze kterého

vyplynulo, že poněkud vyšší index hydrofobicity měla stacionární fáze s větším

pokrytím chirálním selektorem. Rozdíl v hodnotách HI mezi oběma kolonami však

nebyl velký. Naopak vyšší hodnotu silanolového indexu měla stacionární fáze

66

Chirobiotic T - silanolové interakce se v retenčním mechanismu tedy zřejmě uplatňují

více při použití kolony s menším pokrytím chirálním selektorem.

Dalším z cílů této práce bylo sledování procesů, které mohou ve vzorku vyvolat

racemizaci aminokyselin. Přítomnost D-enantiomerů však v žádném ze vzorků

detekována nebyla.

67

SEZNAM LITERATURY

1. Tesařová E., Armstrong D. W., v knize: Advanced Chromatographic and

Electromigration Methods in BioSciences (Deyl Z., ed.), kap. 5. Elsevier, Amsterdam

1998.

2. Streblová E.: Souhrnné texty z chemie, II. díl. Univerzita Karlova v Praze, Praha

2000.

3. Trnka T., Klinotová E., Kotora M., Sejbal J.: Organická chemie. Univerzita Karlova

v Praze, Praha 2003.

4. Červinka O.: Chem. Listy 93, 294 (1999).

5. Cahn R. S., Ingold C. K., Prelog V.: Angew. Chem. 5, 385 (1966).

6. Maier N. M., Franco P., Lindner W.: J. Chromatogr. A 906, 3 (2001).

7. Marchelli R., Dossena A., Palla G.: Trends Food Sci. Technol. 7, 113 (1996).

8. MacDermott A. J.: Origins Life Evol. Biosphere 25, 191 (1995).

9. Fassihi A. R.: Int. J. Pharm. 92, 1 (1993).

10. Knocke B., Blaschke G.: J. Chromatogr. A 666, 235 (1994).

11. Srkalová S.: Bakalářská práce, PřF UK, Praha 2006.

12. Srkalová S., Kalíková S., Tesařová E.: Chem. Listy, přijato k tisku.

13. Ekborg –Ott K. H., Armstrong D. W., v knize: Chiral Separations: Applications and

Technology (Ahuja S., ed.), kap. 9. American Chemical Society, Washington, DC

1997.

14. Pickenhagen W., v knize: Flavor Chemistry – Trends and Developments (Teranishi

R., Buttery R. G., Shahidi F., eds.). American Chemical Society, Washington, DC

1989.

15. Simó C., Barbas C., Cifuentes A.: Electrophoresis 24, 2431 (2003).

16. Lekh R. J., Djong-Chi C., Tsutomu O., Yukiko N., Hidehiko Y.: Trends Food Sci.

Technol. 10, 199 (1999).

17. Ekborg-Ott K. H., Armstrong D. W., Taylor A. D.: J. Agric. Food Chem. 50, 473

(2002).

18. Liardon R., Lederman S.: J. Agric. Food Chem. 34, 557 (1986).

19. Tovar L. R., Schwass D. E., v knize: Xenobiotics in Foods and Feeds (Finley J. W.,

Schwass D. E., eds.). American Chemical Society, Washington, DC 1983.

68

20. Nehring U. P.: Proceedings of the Symposium on Chemical Reactions in Foods

(Velíšek J., ed.). VUPP-STI, Praha 1992.

21. Brückner H., Jaek P., Langer M., Godel H.: Amino Acids 2, 271 (1992).

22. Simó C., Barbas C., Cifuentes A.: J. Agric. Food Chem. 50, 5288 (2002).

23. Friedman M. J.: J. Agric. Food Chem. 47, 3457 (1999).

24. Poncini L., Wimmer F. L., Vakamoce V.: Fiji Agric. J. 45, 65 (1983).

25. Casal S., Alves A. R., Mendes E., Oliveira M. B. P. P., Ferreira M. A.: J. Agric.

Food Chem. 51, 6495 (2003).

26. Pantó F: v knize: Progress in Food Fermentation, Proceedings of the Euro Food

Chem. (Benedito de Barber C., ed.), sv. VII. IATA-CSIC, Valencia 1993.

27. Brückner H., Justus J., Kirschbaum J.: Amino Acids 21, 429 (2001).

28. Zagon J., Dehne L. I., Bögl K. W.: Nutr. Res. 14, 445 (1994).

29. D´Aniello A., D´Onofrio G., Pischetola M., D´Aniello G., Vetere A., Petrucelli L.,

Fisher G. H.: J. Biol. Chem. 268, 16949 (1993).

30. D´Aniello A., Di Fiore M., Fisher G.: Trends Compar. Biochem. Physiol. 4, 1

(1998).

31. http://www2.zf.jcu.cz/public/departments/koz/vyz/pred_08.pdf, staženo 27.11.2007.

32. Stratil P., Kubáň V.: Chem. Listy 98, 379 (2004).

33. Stratil P., Kubáň V.: Chem. Listy 99, 3 (2005).

34. http://kulturistika.ronnie.cz/c-2263-bcaa-fenomen-nebo-mytus-.html, staženo

5.11.2007.

35. Baracos V. E., Mackenzie M. L.: J. Nutr. 136, 237 (2006).

36. http://www.lekarnaexpres.cz/?page=detail&id=1097, staženo 25.2.2008.

37. http://obchod.symbinatur.com/produkt68-BCAA-500-Starlife.html#, staženo

25.2.2008.

38. Crowe M. J., Weatherson J. N., Bowden B. F.: Eur. J. Appl. Physiol. 97, 664 (2006).

39. Blomstrand E.: J. Nutr. 136, 544 (2006).

40. Newsholme E. A., Blomstrand E.: J. Nutr. 136, 274 (2006).

41. Barchas J. D., Freedman D. X.: Biochem. Pharmacol. 12, 1232 (1963).

42. Sato Y., Eriksson S., Hagenfeldt L., Wahren J.: Clin. Physiol. 1, 151 (1981).

43. Gomez-Merino D., Béquet F., Berthelot M., Riverain S., Chennaoui M., Guezennec

C. Y.: Int. J. Sports Med. 22, 317 (2001).

44. Wilson W. M., Maughan R. J.: Exp. Physiol. 77, 921 (1992).

69

45. Struder H. K., Hollmann W., Platen P., Donike M., Gotzmann A., Weber K.: Horm.

Metab. Res. 30, 188 (1998).

46. Meeusen R., Piacentini M. F.: Adv. Exp. Med. Biol.: 527, 521 (2003).

47. Strachan A. T., Leiper J. B., Maughan R. J.: Exp. Physiol. 89, 657 (2004).

48. Varnier M.: Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 69, 83 (1994).

49. Wagenmakers A. J. M.: Muscle fatigue mechanisms in exercise and training

(Marconnet P., Komi P. V., Saltin B., Sejersted O. M., eds.), str. 69. Karger AG,

Basel 1992.

50. http://cs.wikipedia.org/wiki/Serotonin, staženo 3.12.2007.

51. http://www.chm.bris.ac.uk/motm/serotonin/home1.htm, staženo 3.12.2007.

52. http://cs.wikipedia.org/wiki/Fenylketonurie, staženo 21.3.2008.

53. Choudry H. A., Pan M., Karinch A. M., Souba W. W.: J. Nutr. 136, 314 (2006).

54. Freund H., Hoover H. C. Jr., Atamian S., Fischer J. E.: Ann. Surg. 190, 18 (1979).

55. Cerra F. B., Mazuski J., Teasley K., Nuwer N., Lysne J., Shronts E., Konstantinides

F.: Crit. Care Med. 11, 775 (1983).

56. Cerra F. B., Upson D., Angelico R., Wiles 3rd C., Lyons J., Faulkenbach L.,

Paysinger J.: Surgery 92, 192 (1982).

57. Jaing Z. M., Sugarbaker S., Wilmore D.: Surg. Gynecol. Obstet. 166, 115 (1988).

58. Štulík K. a kol.: Analytické separační metody. Univerzita Karlova v Praze, Praha

2004.

59. Tesařová E.: Analýza chirálních sloučenin (Tesařová E., ed.), str. 31. Pražské

analytické centrum inovací, Praha 2007.

60. Kalíková K.: Diplomová práce, PřF UK, Praha 2005.

61. Berthod A., Youbang L., Bagwill C., Armstrong D. W.: J. Chromatogr. A 731, 123

(1996).

62. Ilisz I., Ballet

S., Van Rompaey K., De Wachter R., Tourwé D., Armstrong D. W.,

Péter A.: J. Sep. Sci. 30, 1881 (2007).

63. Berthod A., Chen X. H., Kullman J. P., Armstrong D. W., Gasparrini F.,

D’Acquarica I., Villani C., Carotti A.: Anal. Chem. 72, 1767 (2000).

64. Boniglia C., Carratu B., Sanzini E.: J. Food Sci. 67, 1352 (2002).

65. Walters M. J.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 465 (1987).

66. http://www.jascofrance.fr/pdf/hplc.pdf, staženo 15.4.2008.

67. Kafková B., Tesařová E., Suchánková J., Bosáková Z., Coufal P.: J. Sep. Sci. 26,

686 (2003).