48
Přehled rychlých metod stanovení mikroorganismů: biochemické, imunochemické, fyzikální metody Sabina Purkrtová
Přehled rychlyacutech metod stanoveniacute mikroorganismů biochemickeacute
imunochemickeacute fyzikaacutelniacute metody
Sabina Purkrtovaacute
Konvenčniacute metody
Membraacutenovaacute filtrace
MPN
Roztěr přeliv
Stanoveniacute počtu
Průkaz
Ředěniacute - izolace - konfirmace ndash stanoveniacute počtu
Ředěniacute - kultivace ndash konfirmace ndash stanoveniacute počtu
Pomnoženiacute ndash izolace ndash konfirmace
Konfirmace (identifikace přiacutep seacuterotypizace)
Biochemickeacute reakce
Barveniacute a světelnaacute mikroskopie
KONVENČNIacute METODY = KULTIVAČNIacute METODY A KONFIRMACE + JEDNODUCHAacute BARVENIacute A ZAacuteKLADNIacute SVĚTELNAacute MIKROSKOPIE
Konvenčniacute metody
Vyacutehody Omezeniacute
Dobře charakterizovaneacute Pomaleacute doba nutnaacute k ziacuteskaacuteniacute vyacutesledku obvykle 2-10 dniacute
Obecně akceptovaneacute Naacuteročneacute na materiaacutel a praacuteci
Omezeniacute dobře znaacutema Zdlouhaveacute
Relativně maacutelo validačniacutech vyacutezev Nekonzistentniacute ndash vyacutesledky se lišiacute v zaacutevislosti na mikrobiaacutelniacute populaci meacutediiacutech a
podmiacutenkaacutech
Pro naacutes spolehliveacute paradigma Spoacutery a stresovaneacute pomalu rostouciacute mikroorganismy vyžadujiacute prodlouženiacute času
pro růs
Uznaacutevaacuteny a požadovaacuteny naacuterodniacutemi a mezinaacuterodniacutemi regulačniacutemi orgaacuteny pro
oficiaacuteln kontroly
Naacutechylneacute k chybě operaacutetora
POMNOŽENIacute
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Konvenčniacute metody Zrychlit a zjednodušit ndash noveacute postupy
Pomnožovaciacute krok je takřka vždy zachovaacuten (hledaacuteniacute jehly v kupce sena ndash jedneacute buňky v 25 g10 g ndash vysokeacute naacuteroky na sensitivitu metody Novaacute selektivniacute pomnožovaciacute meacutedia
Vylepšit a zjednodušit staacutevajiacuteciacute metody Technickeacute pomůcky Automatizace Minituarizace
Vyacutevoj selektivniacutech a specifickyacutech půd (chromogenniacute a fluorogenniacute půdy) Rychleacute metody pro možnost detekce již z pomnožovaciacute suspenze Noveacute přiacutestupy pro detekci (např konduktance)
Rychleacute metody identifikace
Průkaz
Počet
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Noveacute metody stanoveniacute počtu
Konvenčniacute vs alternativniacute metody VERIFIKACE ndash ověřeniacute fungovaacuteniacute daneacute standardniacute konvenčniacute metody za podmiacutenek daneacute laboratoře
VALIDACE ndash ověřeniacute alternativniacute metody vůči daneacute standardniacute konvenčniacute metodě ndash naacuteročnyacute proces alternativniacute metoda musiacute poskytovat stejneacute nebo lepšiacute vyacutesledky než standardniacute konvenčniacute metoda
ISO 161402003 ndash Mikrobiologie potravin a krmiv ndash Protokol pro validaci alternativniacutech metod 2 čaacutesti srovnaacutevaciacute studie obou metod (aplikace na různeacute typy vzorků s různyacutemi kmeny sledovaneacuteho patogenu při různyacutech koncentraciacutech apod) mezilaboratorniacute srovnaacuteniacute (provedeniacute daneacute metody na stejnyacutech vzorciacutech paralelně ve viacutece laboratořiacutech) Velice naacutekladnyacute a zdlouhavyacute proces ndash validaci alternativniacutech metod obvykle provaacutedějiacute specializovaneacute organizace na naacuteklady vyacuterobce alternativniacute metody Referenčniacute metoda ndash obvykle mezinaacuterodniacute normy (ISO)
httpwwwaoacorg httpwwwafnororgen httpwwwnmklorgNordValNordValhtm
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute metody
Membraacutenovaacute filtrace
MPN
Roztěr přeliv
Stanoveniacute počtu
Průkaz
Ředěniacute - izolace - konfirmace ndash stanoveniacute počtu
Ředěniacute - kultivace ndash konfirmace ndash stanoveniacute počtu
Pomnoženiacute ndash izolace ndash konfirmace
Konfirmace (identifikace přiacutep seacuterotypizace)
Biochemickeacute reakce
Barveniacute a světelnaacute mikroskopie
KONVENČNIacute METODY = KULTIVAČNIacute METODY A KONFIRMACE + JEDNODUCHAacute BARVENIacute A ZAacuteKLADNIacute SVĚTELNAacute MIKROSKOPIE
Konvenčniacute metody
Vyacutehody Omezeniacute
Dobře charakterizovaneacute Pomaleacute doba nutnaacute k ziacuteskaacuteniacute vyacutesledku obvykle 2-10 dniacute
Obecně akceptovaneacute Naacuteročneacute na materiaacutel a praacuteci
Omezeniacute dobře znaacutema Zdlouhaveacute
Relativně maacutelo validačniacutech vyacutezev Nekonzistentniacute ndash vyacutesledky se lišiacute v zaacutevislosti na mikrobiaacutelniacute populaci meacutediiacutech a
podmiacutenkaacutech
Pro naacutes spolehliveacute paradigma Spoacutery a stresovaneacute pomalu rostouciacute mikroorganismy vyžadujiacute prodlouženiacute času
pro růs
Uznaacutevaacuteny a požadovaacuteny naacuterodniacutemi a mezinaacuterodniacutemi regulačniacutemi orgaacuteny pro
oficiaacuteln kontroly
Naacutechylneacute k chybě operaacutetora
POMNOŽENIacute
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Konvenčniacute metody Zrychlit a zjednodušit ndash noveacute postupy
Pomnožovaciacute krok je takřka vždy zachovaacuten (hledaacuteniacute jehly v kupce sena ndash jedneacute buňky v 25 g10 g ndash vysokeacute naacuteroky na sensitivitu metody Novaacute selektivniacute pomnožovaciacute meacutedia
Vylepšit a zjednodušit staacutevajiacuteciacute metody Technickeacute pomůcky Automatizace Minituarizace
Vyacutevoj selektivniacutech a specifickyacutech půd (chromogenniacute a fluorogenniacute půdy) Rychleacute metody pro možnost detekce již z pomnožovaciacute suspenze Noveacute přiacutestupy pro detekci (např konduktance)
Rychleacute metody identifikace
Průkaz
Počet
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Noveacute metody stanoveniacute počtu
Konvenčniacute vs alternativniacute metody VERIFIKACE ndash ověřeniacute fungovaacuteniacute daneacute standardniacute konvenčniacute metody za podmiacutenek daneacute laboratoře
VALIDACE ndash ověřeniacute alternativniacute metody vůči daneacute standardniacute konvenčniacute metodě ndash naacuteročnyacute proces alternativniacute metoda musiacute poskytovat stejneacute nebo lepšiacute vyacutesledky než standardniacute konvenčniacute metoda
ISO 161402003 ndash Mikrobiologie potravin a krmiv ndash Protokol pro validaci alternativniacutech metod 2 čaacutesti srovnaacutevaciacute studie obou metod (aplikace na různeacute typy vzorků s různyacutemi kmeny sledovaneacuteho patogenu při různyacutech koncentraciacutech apod) mezilaboratorniacute srovnaacuteniacute (provedeniacute daneacute metody na stejnyacutech vzorciacutech paralelně ve viacutece laboratořiacutech) Velice naacutekladnyacute a zdlouhavyacute proces ndash validaci alternativniacutech metod obvykle provaacutedějiacute specializovaneacute organizace na naacuteklady vyacuterobce alternativniacute metody Referenčniacute metoda ndash obvykle mezinaacuterodniacute normy (ISO)
httpwwwaoacorg httpwwwafnororgen httpwwwnmklorgNordValNordValhtm
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute metody
Vyacutehody Omezeniacute
Dobře charakterizovaneacute Pomaleacute doba nutnaacute k ziacuteskaacuteniacute vyacutesledku obvykle 2-10 dniacute
Obecně akceptovaneacute Naacuteročneacute na materiaacutel a praacuteci
Omezeniacute dobře znaacutema Zdlouhaveacute
Relativně maacutelo validačniacutech vyacutezev Nekonzistentniacute ndash vyacutesledky se lišiacute v zaacutevislosti na mikrobiaacutelniacute populaci meacutediiacutech a
podmiacutenkaacutech
Pro naacutes spolehliveacute paradigma Spoacutery a stresovaneacute pomalu rostouciacute mikroorganismy vyžadujiacute prodlouženiacute času
pro růs
Uznaacutevaacuteny a požadovaacuteny naacuterodniacutemi a mezinaacuterodniacutemi regulačniacutemi orgaacuteny pro
oficiaacuteln kontroly
Naacutechylneacute k chybě operaacutetora
POMNOŽENIacute
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Konvenčniacute metody Zrychlit a zjednodušit ndash noveacute postupy
Pomnožovaciacute krok je takřka vždy zachovaacuten (hledaacuteniacute jehly v kupce sena ndash jedneacute buňky v 25 g10 g ndash vysokeacute naacuteroky na sensitivitu metody Novaacute selektivniacute pomnožovaciacute meacutedia
Vylepšit a zjednodušit staacutevajiacuteciacute metody Technickeacute pomůcky Automatizace Minituarizace
Vyacutevoj selektivniacutech a specifickyacutech půd (chromogenniacute a fluorogenniacute půdy) Rychleacute metody pro možnost detekce již z pomnožovaciacute suspenze Noveacute přiacutestupy pro detekci (např konduktance)
Rychleacute metody identifikace
Průkaz
Počet
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Noveacute metody stanoveniacute počtu
Konvenčniacute vs alternativniacute metody VERIFIKACE ndash ověřeniacute fungovaacuteniacute daneacute standardniacute konvenčniacute metody za podmiacutenek daneacute laboratoře
VALIDACE ndash ověřeniacute alternativniacute metody vůči daneacute standardniacute konvenčniacute metodě ndash naacuteročnyacute proces alternativniacute metoda musiacute poskytovat stejneacute nebo lepšiacute vyacutesledky než standardniacute konvenčniacute metoda
ISO 161402003 ndash Mikrobiologie potravin a krmiv ndash Protokol pro validaci alternativniacutech metod 2 čaacutesti srovnaacutevaciacute studie obou metod (aplikace na různeacute typy vzorků s různyacutemi kmeny sledovaneacuteho patogenu při různyacutech koncentraciacutech apod) mezilaboratorniacute srovnaacuteniacute (provedeniacute daneacute metody na stejnyacutech vzorciacutech paralelně ve viacutece laboratořiacutech) Velice naacutekladnyacute a zdlouhavyacute proces ndash validaci alternativniacutech metod obvykle provaacutedějiacute specializovaneacute organizace na naacuteklady vyacuterobce alternativniacute metody Referenčniacute metoda ndash obvykle mezinaacuterodniacute normy (ISO)
httpwwwaoacorg httpwwwafnororgen httpwwwnmklorgNordValNordValhtm
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
POMNOŽENIacute
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Konvenčniacute metody Zrychlit a zjednodušit ndash noveacute postupy
Pomnožovaciacute krok je takřka vždy zachovaacuten (hledaacuteniacute jehly v kupce sena ndash jedneacute buňky v 25 g10 g ndash vysokeacute naacuteroky na sensitivitu metody Novaacute selektivniacute pomnožovaciacute meacutedia
Vylepšit a zjednodušit staacutevajiacuteciacute metody Technickeacute pomůcky Automatizace Minituarizace
Vyacutevoj selektivniacutech a specifickyacutech půd (chromogenniacute a fluorogenniacute půdy) Rychleacute metody pro možnost detekce již z pomnožovaciacute suspenze Noveacute přiacutestupy pro detekci (např konduktance)
Rychleacute metody identifikace
Průkaz
Počet
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Noveacute metody stanoveniacute počtu
Konvenčniacute vs alternativniacute metody VERIFIKACE ndash ověřeniacute fungovaacuteniacute daneacute standardniacute konvenčniacute metody za podmiacutenek daneacute laboratoře
VALIDACE ndash ověřeniacute alternativniacute metody vůči daneacute standardniacute konvenčniacute metodě ndash naacuteročnyacute proces alternativniacute metoda musiacute poskytovat stejneacute nebo lepšiacute vyacutesledky než standardniacute konvenčniacute metoda
ISO 161402003 ndash Mikrobiologie potravin a krmiv ndash Protokol pro validaci alternativniacutech metod 2 čaacutesti srovnaacutevaciacute studie obou metod (aplikace na různeacute typy vzorků s různyacutemi kmeny sledovaneacuteho patogenu při různyacutech koncentraciacutech apod) mezilaboratorniacute srovnaacuteniacute (provedeniacute daneacute metody na stejnyacutech vzorciacutech paralelně ve viacutece laboratořiacutech) Velice naacutekladnyacute a zdlouhavyacute proces ndash validaci alternativniacutech metod obvykle provaacutedějiacute specializovaneacute organizace na naacuteklady vyacuterobce alternativniacute metody Referenčniacute metoda ndash obvykle mezinaacuterodniacute normy (ISO)
httpwwwaoacorg httpwwwafnororgen httpwwwnmklorgNordValNordValhtm
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute vs alternativniacute metody VERIFIKACE ndash ověřeniacute fungovaacuteniacute daneacute standardniacute konvenčniacute metody za podmiacutenek daneacute laboratoře
VALIDACE ndash ověřeniacute alternativniacute metody vůči daneacute standardniacute konvenčniacute metodě ndash naacuteročnyacute proces alternativniacute metoda musiacute poskytovat stejneacute nebo lepšiacute vyacutesledky než standardniacute konvenčniacute metoda
ISO 161402003 ndash Mikrobiologie potravin a krmiv ndash Protokol pro validaci alternativniacutech metod 2 čaacutesti srovnaacutevaciacute studie obou metod (aplikace na různeacute typy vzorků s různyacutemi kmeny sledovaneacuteho patogenu při různyacutech koncentraciacutech apod) mezilaboratorniacute srovnaacuteniacute (provedeniacute daneacute metody na stejnyacutech vzorciacutech paralelně ve viacutece laboratořiacutech) Velice naacutekladnyacute a zdlouhavyacute proces ndash validaci alternativniacutech metod obvykle provaacutedějiacute specializovaneacute organizace na naacuteklady vyacuterobce alternativniacute metody Referenčniacute metoda ndash obvykle mezinaacuterodniacute normy (ISO)
httpwwwaoacorg httpwwwafnororgen httpwwwnmklorgNordValNordValhtm
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvalitativniacute metody - kriteacuteria
1 Selektivita (inkluzivita schopnost detekovat ciacutelovyacute mikroorganismu z
velkeacuteho množstviacute kmenů exkluzivita zanedbatelnaacute interference relevantniacuteho
rozsahu neciacutelovyacutech mikroorganismů)
2 Relativniacute přesnost (stupeň shody mezi vyacutesledky ziacuteskanyacutemi oběma metodami
na stejnyacutech vzorciacutech)
3 Mez detekce
4 Relativniacute sensitivita (schopnost alt metody detekovat shodně s referenčniacute
metodou) Relativniacute specifita (schopnost alt metody nedetekovat pokud neniacute
detekovaacuteno referenčniacute metodou) shodně s referenčniacute metodou
5 Shoda mezi metodami
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute vs alternativniacute metody
Kvantitativniacute metody ndash přiacuteklady kriteacuteriiacute
linearita
Relativniacute přesnost
Limit detekce a limit kvantifikace
Specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelnyacutem i nevyhnutelnyacutem okolnostem ndash jinyacute
pracovniacutek jinaacute šarže apod)
Přesnost a spraacutevnost
Opakovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash stejnaacute laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejnyacute vzorek ndash stejneacute podmiacutenky ndash různaacute laboratoř)
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute metody - automatizace Technickeacute pomůcky pro jednotliveacute kroky konvenčniacutech metod ndash automatizace - zrychleniacute - vyššiacute miacutera standardizace vyacutesledků - sniacuteženiacute naacuteroků na pracnost
Prvotniacute ředěniacute vzorku ndash gravimetrickeacute řediacuteciacute jednotky
Automatickeacute přidaacuteniacute řediacuteciacuteho meacutedia
Video httpwwwiul-instcomensample-preparationgravimentric-diluter
Homogenizace vzorku ndash bdquopaacutedlovyacuteldquo typ pulsifikačniacute typ
httpwwwiul-instcomimagesmasticator_capjpg httpsweberscientificcomproduct-resourcesimages3068-57_optjpg
Odlišnaacute konstrukce
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute metody - automatizace
Očkovaacuteniacute pomociacute spiraacutely ndash až tři ředěniacute po sobě jsou ve spiraacutele naneseny na plotnu vyhodnoceniacute pomociacute software ndash obrazovaacute analyacuteza
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationspiral-plater httpwwwyoutubecomwatchv=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využitiacute teacutež pro testovaacuteniacute kvality půd
Desiacutetkoveacute ředěniacute vzorku
Video httpwwwiul-instcomeninnoculationbio-dilutor
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
VIDEO httpwwwbiomiccomcolony-counting1html
Konvenčniacute metody - automatizace
PC automatickeacute počiacutetačky koloniiacute ndash načteniacute obrazu plotny do PC - označeniacute koloniiacute ktereacute se počiacutetajiacute a) uživatelem b) Pomociacute software
httpwwwhpcimediacomimageswebsiteManChemNewsDIR_6F_10443jpg
Manuaacutelniacute počiacutetačky koloniiacute ndash plotna umiacutestěna na prosvětlenyacute průzor kolonie značeny fixem na viacutečko ndash sniacutemaacuteniacute dotyku
Měřeniacute zoacuten (ATB rezistence)
Video httpwwwiul-instcomencolony-counting-zone-readingzone-reader
Počiacutetaacuteniacute koloniiacute
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Konvenčniacute metody - automatizace Barveniacute
Barviacuteciacute stanice ndash 4 naacutedobky na jednotlivaacute činidla možnost se zaacutevěrečnyacutem ožehem či bez
Video httpwwwiulinstcomimagespoly_stainer_capjpg
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Biosenzor = analytickyacute naacutestroj kteryacute převaacutediacute biologickou odpověď do elektrickeacuteho signaacutelu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivniacute element (rozeznaacutevaacute ciacutelovyacute analyt) - celaacute buňkamikroorganismus nebo jejiacute specifickaacute čaacutest (buněčneacute systeacutemy enzymy neenzymatickeacute proteiny) schopnaacute se specificky vaacutezat na mikroorganismy určityacutech druhů - tkaacuteň mikroorganismus buňka enzym protilaacutetka nukleovaacute kyselina apod + převaděč (transducer) převaacutediacute udaacutelost rozpoznaacuteniacute do měřitelneacuteho elektrickeacuteho signaacutelu ndash optickyacute elektrochemickyacute thermometrickyacute piezoelektickyacute magnetickyacute a mikromechanickyacute nebo jejich kombinace
Biosenzory
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Fluorescence - princip
Princip fluorescence Laacutetka absorbuje energii zaacuteřeniacute o určiteacute vlnoveacute deacutelce přejde do excitovaneacuteho stavu a při naacutevratu do zaacutekladniacuteho stavu emituje zaacuteřeniacute o nižšiacute vlnoveacute deacutelce Pro laacutetku schopnou fluorescence je vlnovaacute deacutelka excitačniacuteho a emisniacuteho zaacuteřeniacute specifickaacute Epifluorescence Zaacuteřeniacute dopadaacute na vzorek (epi=na) neprochaacuteziacute jiacutem
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
httpwwwonline-tensiometercomproduktecleanospectorbilderfluorescence_jabolinski_diagramjpg
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
LIVE BacLighttrade Bacterial Gram
Stain Kit
LIVEDEADreg BacLighttrade
Bacterial Viability Kit
LIVEDEADreg Reduced
Biohazard Cell Viability Kit 1
LIVEDEADreg Yeast Viability Kit
Ciacutel Bakterie Kvasinky
Vyacutesledek Živeacute G-+ se barviacute zeleně a živeacute G- se barviacute červeně
Odlišneacute zbarveniacute je založeno na propustnosti membraacuten Živeacute buňky se
barviacute hlavně zeleně a mrveacute buňky převaacutežně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivniacute buněčneacute vakuoly se barviacute oranžově živeacute i mrveacute buněčneacute stěny modře
Fluorescenčniacute laacutetky
SYTOreg 9 SYTOreg 9 SYTOreg 10 FUNreg 1
Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardniacute filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Redreg Texas Redreg Texas Redreg DAPI
ExEm (nm) 480500 480500 484505 488560ndash610
480625 536617 535624 365440
Odlišeniacute živyacutechmrtvyacutech buňky - kity
httplibjiangnaneducnasm254-Introducehtm
Fluorescence - aplikace
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
DEFT - direct epifluorescent filter technique ndash přiacutemaacute epiflurescenčniacute technika spojenaacute s filtraciacute
httpwwwpharmtechcompharmtechdataarticlestandardpharmtech182012771886i1gif
Bakteriaacutelniacute buňky jsou filtraciacute zachyceny na membraacutenu Po kraacutetkeacute inkubaci je membraacutena obarvena akridinovou červeniacute ndash vizualizace a spočteniacute zatiacutem okem neviditelnyacutech koloniiacute Re-inkubace membraacuteny ndash možnaacute izolace a identifikace vykultivovanyacutech mikroorganismů
httpwwwperceptivecoukimgapplicationsapplications_deft1jpg
Fluorescence ndash rychleacute metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probou
httpwwwbiovisiblecomphotopageshtml
Fluorescence ndash rychleacute metody
FISH ndash fluorescenčniacute hybridizace in situ Identifikace bakteriiacute ndash vazby specifickeacute fluorescenčně značeneacute DNA proacuteby na gen pro 16S rRNA
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Fluorescence + MPN ndash aplikace Miniaturizace a automatizace stanoveniacute
TEMPOcopy (vyacuter bioMeacuterieux) Automatizovanyacute systeacutem na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
225 microl
225 microl
225 microl
Patentovanaacute karta s jamkami různyacutech velikostiacute Jednotliveacute jamky obsahujiacute přiacuteslušneacute dehydratovaneacute meacutedium
Naneseniacute vzorku ndash Automaticky se rozplniacute do všech jamek
Naacutesledně kultivace a detekce
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Metody detekce ndash dvou faacutezovaacute 1) Speciaacutelně navrženaacute meacutedia umožňujiacute ciacutelovyacutem mikroorganismům růst 2) Detekce růstu provaacuteděna fluorescenčně a) fluorescentniacute pH indikaacutetor Celkovyacute počet koliformů definice koliformů dle ISO Enterobacteriaceae zkvašujiacuteciacute laktoacutezu ndash dochaacuteziacute ke změně pH fluorescentniacute pH indikaacutetor 4-Methylumbelliferone (4MU)
4MU
fluorescene při
pH 7
4MU
bez fluorescence při
pH
Fluorescence + MPN ndash aplikace
Negativniacute jamka fluorescence
Pozitivniacute jamka bez fluorescence
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
b) Fluorescenčniacute substraacutet pro specifickyacute enzym ndash detekce specifickeacute enzymatickeacute aktivity
MUG
β-D-glukuronidaacuteza
(95 E coli)
glukuronaacutet 4-methylumbelliferon
+
E coli medium přiacutetomnost β-D-glukuronidaacutezy Specifickyacute substraacutet 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využitiacute v agarovyacutech půdaacutech)
nefluorescenčniacute mol fluorescenčniacute mol
Pozitivniacute jamka fluorescence
Negativniacute jamka bez fluorescence
Fluorescence + MPN ndash aplikace
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
UV
světlo
Koacuted (počet pozitivniacutech jamek)
KTJg MPN tabulky
+
Uacuteroveň ředěniacute
TEMPO ndash PŘIacutePRAVNAacute STANICE
TEMPO-ODEČIacuteTACIacute STANICE
Fluorescence + MPN ndash aplikace
16 15 4
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Imunochemickeacute metody - princip Princip využitiacute specifickeacute vazby mezi protilaacutetkou (antibody polyklonaacutelniacute monoklonaacutelniacute rekombinantniacute) a přiacuteslušnyacutem antigenem ndash vznik komplexu protilaacutetka-antigen Protilaacutetka je obvykle imobilizovanaacute na substraacutetu Detekce komplexu protilaacutetka-antigen - přiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
značenaacute protilaacutetka kteraacute sloužiacute i k detekci - nepřiacutemaacute detekce k reakci s antigenem použita
neznačenaacute primaacuterniacute protilaacutetka k detekci použita dalšiacute značenaacute sekundaacuterniacute protilaacutetka
Způsoby značeniacute enzymy biotin fluorofory radioaktivniacute izotopy apod
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Imunomagnetickaacute separace
httpohwaterusgsgovmicro2imagesims_figurejpg
Protilaacutetka je vaacutezanaacute na magnetickou čaacutestici = imunomagnetickaacute čaacutestice
Vazba antigenu na povrchu buněčneacute stěny na imunomagnetickou čaacutestici = bdquovychytaacuteniacuteldquo přiacuteslušnyacutech buněk bakteriiacute či virů
Odděleniacute imunokomplexu za použitiacute magnetu ndash imunomagnetickaacute separace
PCR amplifikace
Imunodetekce
Přiacutemyacute vyacutesev
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Např využitiacute k izolaci E coli O157H7 dle ČSN EN ISO 16654
kultivace imunomagnetickyacutech čaacutestic na selektivniacutech půdaacutech (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho FLU-fluorocult E coli O157H7 agar) - k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech kmenů E coli je využito nepřiacutetomnosti β-glukuronidaacutezy ndash nedochaacuteziacute ke zkvašovaacuteniacute sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpeniacute fluorogenniacuteho substraacutetu MUG (FLU agar)
konfirmace k odlišeniacute E coli O157H7 od ostatniacutech sorbitol-negativniacutech gramnegativniacutech střevniacutech tyčinek např rod Shigella je provedena detekce tvorby indolu (typickaacute pro Ecoli)
Imunomagnetickaacute separace
Kmen Toxiny Seacuterotyp Onemocněniacute
Enterohemoragickeacute Shigatoxigenniacute (EHECSTEC) E coli
Shiga toxin verotoxin O157H7 O103H2 O111H8 O121H19
Kolonizace v tlusteacutem střevě shigatoxiny ndash afinita ke stěně ceacutev
pomnoženiacute - mTSB (modifikovanyacute bujoacuten s
enzymaticky natraacutevenyacutem kaseinem soacutejou a
novobiocinem ) ndash 25 ml vzorku a 225 ml mTSB 415
degC 18-24 hodin
separace bakteriiacute po 8 a 16 hodinaacutech
pomociacute imunomagnetickyacutech čaacutestic na jejichž
povrchu je protilaacutetka vůči antigenu E coli
O157H7 (Dynabeads E coli O157H7 )
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
aplikace vzorku na podložku v okeacutenku vzorek pomnoženaacute suspenze zahřaacutetaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotu ndash lyacuteze buněk ndash čaacutesti buněčneacute stěny s antigeny majiacute lepšiacute pohyblivost podložka chromatografickyacute papiacuter
C-kontrolniacute zoacutena ndash dochaacuteziacute k navaacutezaacuteniacute a vizualizaci volnyacutech primaacuterniacutech protilaacutetek ndash potvrzeniacute funkčnosti testu T - testovaciacute zoacutena ndash obsahuje sekundaacuterniacute imobilizovaneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash komplex s primaacuterniacute značenou protilaacutetkou putujiacuteciacute z reakčniacute zoacuteny je zachycen a imobilizovaacuten a vizualizovaacuten diacuteky zlateacutemu značeniacute ndash červenyacute pruh
Reakčniacute zoacutenandash obsahuje koloidniacute zlatem značeneacute protilaacutetky specifickeacute k Listeria monocytogenes ndash pokud je L monocytogenes přiacutetomna dojde ke vzniku komplexu
httpwwwmeridianbioscienceeumediahome_3columns_images751630jpg
Imunochemickeacute rychleacute metody
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Imunochemickeacute rychleacute metody Využitiacute metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) ndash nepřiacutemaacute metoda detekce (sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute)
httpthefutureofthingscomuploadimagearticles2006biopenbiopen-elisa-schematicjpg
Singlepathreg Listeria ndash imunochromatografickyacute rychlaacute metoda - Vzorek (suspenze pomnožovaciacuteho meacutedia inkubovanaacute 20 minut při 80 degC a zchlazenaacute na pokojovou teplotundash uvolněniacute antigenů) aplikovaacuten do is an immunochromatographic rapid test based on gold-labelled antibodies 1 The sample is applied to the chromatography paper via the circular sample port 2 The sample is absorbed through the pad to the reaction zone containing colloidal gold-labelled antibodies specific to Listeria 3 Any Listeria antigen present complexes with the gold-labelled antibody and migrates through the port until it encounters a binding zone in the test (T) area 4 The binding zone (T) contains another anti- Listeria Antibody which immobilises any Listeria -antibody complex present Due to the gold-labelling a distinct red line is then formed 5 The rest of the sample continues to migrate to a second binding reagent zone within the control (C) zone and also forms a second distinct red line (positive control) Regardless of whether any Listeria is present or not this distinct red line is always formed in the control (C) zone thus ensuring the test is working correctly
Princip metody ELISA
Sendvičoveacute uspořaacutedaacuteniacute ndash vazba sekundaacuterniacute protilaacutetky konjugovaneacute s enzymem na zachycenyacute antigen
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
VIDAS systeacutem ELISA + fluorescenčniacute vizualizace - ELFA
Detekce Přidaacuteniacute fluorescenčniacuteho substraacutetu (4-methyl umbeliferyl fosfaacutet) ndash v přiacutetomnosti alkalickeacute fosfataacutezy dochaacuteziacute k jeho štěpeniacute ndash intenzita fluorescence odpoviacutedaacute množstviacute zachyceneacute antigenu
Zachyceniacute ciacuteloveacuteho patogenu přes antigen na primaacuterniacute protilaacutetku (přes antigen)
Průběh stanoveniacute pomnoženiacute vzorku v doporučenyacutech pomnožovaciacutech meacutediiacutech naneseniacute vzorku do vzorkovaciacute jamky stripu vloženiacute do přiacutestroje ndash reagencie pro jednotliveacute kroky imunochemickeacute reakce jsou v ostatniacutech jamkaacutech stripu a imunoreakce probiacutehaacute automaticky včetně vyhodnoceniacute
Video httpwwwbiomerieux-industrycomfoodvidas-listeria-monocytogenes-detectionVIDAS LMO2
Imunochemickeacute rychleacute metody
Navaacutezaacuteniacute sekundaacuterniacute protilaacutetky značeneacute alkalickou fosfataacutezou
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Detekce a konfirmace bakteriiacute rodu Salmonella v potravinaacutech krmivu a prostřediacute validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR NdegBIO 1216-0905
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validovaacuteno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostřediacute) a validovaacuteno AOAC (vzorky potravin) dle Method no 200402)
httpwwwbiomerieuxcom
bioMeacuterieux
Imunochemickeacute rychleacute metody
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Průtokovaacute cytometrie (průtokoveacute měřeniacute buněk) ndash od 80 let použiacutevaacutena v mediciacuteně pro počiacutetaacuteniacute relativně velkyacutech krevniacutech buněk Modifikace pro uacutečely mikrobiologie buňky barveny fluorescenčniacutemi barvivy Buňky daacutele po jedneacute prochaacutezejiacute uacutezkou skleněnou kapilaacuterou kde jsou prosvěcovaacuteny laserem - dochaacuteziacute k fluorescenci a rozptylu Každeacute prošleacute buňce naacuteležiacute hodnoty sledovanyacutech fluorescenciacute a rozptylu světla (zaacutevisiacute na velikosti a složitosti povrchu) LZE URČIT POČET PROŠLYacuteCH BUNĚK (až 1000 buněksekunda) A TEacuteŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZAacuteVISLOSTI NA POUŽITYacuteCH BARVIVECH
httpwwweawagchmedienbulletin20130124prinzip_flowzyto2_egifhires
Průtokovaacute cytometrie
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Průtokovaacute cytometrie Jednotliveacute v čase ziacuteskaneacute signaacutely jsou složeny a zobrazeny v grafu na zaacutekladě fluorescence při dvou sledovanyacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (zelenaacute ndash 520 nm červenaacute ndash 630 nm) ndash sloužiacute k odlišeniacute buněk (znaacutem poměr obou fluorescenciacute) od jinyacutech čaacutestic Dole Zelenaacute fluorescence vynesenaacute proti vedlejšiacutemu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s niacutezkyacutem a vysokyacutem obsahem nukleovyacutech kyselin
httpwwwbdbiosciencescomeuwcmimagesEawag_bacteriajpg
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Počiacutetaacuteniacute živyacutech a mrtvyacutech buněk ndash např BacLightreg Živeacute buňky fluoreskujiacute zeleně (FL1) mrveacute červeně (FL3) po excitaci 488 nm argonovyacutem laserem stained marine bacteria
Průtokovaacute cytometrie
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
ATP bioluminiscence
httpwwwpromegacouk~mediaimagesresourcesfiguresenotesfe0027_fig1jpgla=en
httpwwwbiotekptassetstech_resources143clarity_atp_conc_fig2gif
Princip detekce uacuterovně přiacutetomnosti ATP (uacuteměrnaacute přiacutetomnosti mikroorganismů či produktovyacutech residuiacute) V přiacutetomnosti ATP a kysliacuteku katalyzuje enzym luciferaacuteza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzaacuteřeniacute světla o vlnoveacute deacutelce 560 nm
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
ATP bioluminiscence
httpwwwbioxyscomimages2figure-B11gif
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
httpwwwmicromaticcomdraft-keg-beerline-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviewshtml
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Chorianopoulos N G et al Appl Environ Microbiol
2010762018-2022
Malthus ndash v průběhu kultivace v selektivniacutem meacutediu pro danyacute mikroorganismus dochaacuteziacute ke změně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živneacuteho bujoacutenu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Biosenzor =celaacute buňkamikroorganismus (CBS ndash cell-based sensors)
Buněčneacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
Patogenniacute mikroorganismy interagujiacute během infekce se svačiacutemi
buňkami - využitiacute přiacuteslušnyacutech savčiacutech tkaacuteňovyacutech buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů Systeacutem je vhodnyacute pro živeacute bakterie a aktivniacute toxiny Poškozeniacute tkaacuteňovyacutech buněk je měřeno opticky či elektricky
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Chromatofor pigmentoveacute buňky ryby
bojovnice pestraacute (Betta splendens) ndash
důsledkem kontaktu se specifickyacutemi
biologickyacutemi agens dochaacuteziacute k jejich
agregaci
httppatentimagesstoragegoogleapiscomUS6913877B1US06913877-20050705-D00007png
Buněčneacute biosensory
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Bakteriofaacutegoveacute biosensory
Cell-Based Sensor (CBS)
httppubsrscorgencontentarticlehtml2014anc3an01989f
Bakteriofaacutegoveacute jsou schopni rozeznat specifickeacute receptory na povrchu buněk na ktereacute se vaacutežiacute Vazba buněk na pro ně specifickeacute bakteriofaacutegy Detekce vazby optickaacuteelektrickaacute (vazbou se měniacute prochaacutezejiacuteciacute proud)
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Děkuji vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Využitiacute MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtovaacute1 Petra Junkovaacute2 1Laboratoř potravinaacuteřskeacute mikrobiologie 2Laboratoř aplikovaneacute proteomiky
Uacutestav biochemie a mikrobiologie Fakulta potravinaacuteřskeacute a biochemickeacute technologie
Vysokaacute škola chemicko-technologickaacute v Praze
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě fenotypu Fyziologickeacute + biochemickeacute znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barveniacute tvar) b) požadavky na teplotu atmosfeacuteru živneacute laacutetky c) zaacutekladniacute biochemickeacute testy oxidaacuteza katalaacuteza fermentaceoxidace glukoacutezy hemolyacutezy
apod d) Biochemickeacute testy specifickeacute pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např Bacillus cereus G+ tyčka tvořiacuteciacute endospoacutery vlhkeacute snadno rostouciacute kolonie při 37 degC katalaacuteza pozitivniacute β-hemolyacuteza nefermentuje manitol + enzym lecitinaacuteza na půdě MYP roste v růžovyacutech koloniiacutech se zoacutenou precipitace
httpwwwfoodhaccpcommemberonlynewsletter164html
httpwwwnapavalleyedupeoplesrosePublishingImagesBacillus20cereus202(Gram20stain)jpg
Souprava biochemickyacutech testů Microgen Bacillus ID (doba stanoveniacute 48 hodin)
39
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na zaacutekladě genotypu Kriteacuterium druhu u prokaryot (bakterie a archea) Sbiacuterka kmenů ktereacute jsou charakterizovaacuteny nejmeacuteně jedniacutem diagnostickyacutem fenotypovyacutem znakem a jejich purifikovaneacute DNA molekuly vykazujiacute nejmeacuteně 70 DNA-DNA hybridizaci což odpoviacutedaacute nejmeacuteně 97 shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analyacuteza ziacuteskaneacute sekvence
Mapa genomu pro B cereus ATCC 14579
httpwwwacgtinccomspecialty_dna_sequencinghtm 40
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
MALDI-TOF MS Identifikace na zaacutekladě fenotypu Analyacuteza převaacutežně intracelulaacuterniacutech proteinů ndash MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostniacute spektrometrie s průletovyacutem analyzaacutetorem a ionizaciacute laserovou desorpciacute v přiacutetomnost matrice
Obraacutezek 1 Scheacutema MALDI (httpbiomikrovschtcz (květen 2008)
měkkaacute ionizačniacute metoda - niacutezkyacute stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru ndash při odpařovaacuteniacute s sebou matrice strhaacutevaacute molekuly vzorku převaacutediacute je do plynneacuteho skupenstviacute a ionizuje přenosem protonu - vznik pseudomolekuloveacute ionty [A+H] +
vzorek mikrobiaacutelniacute kultura (buněčnyacute materiaacutel jedneacute nebo viacutece koloniiacute) nebo extrakt intracelulaacuterniacutech proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matriciacute
41
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
MALDI-TOF MS Průletovyacute analyzaacutetor - měřeniacute tzv doby letu - doba letu je funkciacute měrneacute hmotnosti iontu (mz)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost z naacuteboj
L deacutelka driftoveacute
zoacuteny e elementaacuterniacute
naacuteboj U urychlovaciacute
napětiacute Obraacutezek 2 Scheacutema MALDI TOF MS (httpbiomikrovschtcz (květen 2008))
Provedeniacute analyacutezy ndash ziacuteskaacuteniacute proteinoveacuteho profilu daneacuteho izolaacutetu specifickeacuteho jako otisk prstu (fingerprint)
Proteinovyacute profil mikroorganismu
Proteinovyacute profil -složenyacute z jednotlivyacutech spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost piacuteků odpoviacutedaacute měrneacute hmotnosti iontu mz (z obvykle rovno jedneacute = molekuloveacute hmotnosti) ndash rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpoviacutedaacute množstviacute přiacutetomneacuteho proteinu 42
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
MALDI-TOF MS Proteinovyacute profil mikroorganismu Obsahuje převaacutežně intracelulaacuterniacute (vnitrobuněčneacute) proteiny menšiacute než 15 kDa ktereacute se vyskytujiacute ve velkeacutem množstviacute jsou bazickeacute a středně hydrofobniacute většina ribozomaacutelniacute proteiny daacutele proteiny vaacutežiacuteciacute se na DNA cold-shock proteiny heat-shock proteiny chaperony atd většina proteinů přiacutetomnyacutech v profilu jsou tedy konzervovaneacute provozniacute (house-keeping) geny ndash nižšiacute ovlivnitelnost kultivačniacutemi podmiacutenkami + shoda s identifikaciacute založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
Volba matrice absorpce při vlnoveacute deacutelce použiteacuteho laseru (obvykle 337 nm) tvorby žaacutedouciacutech krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyseleacuteho charakteru (uacutečinnaacute ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organickeacute kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (CHC) 35-dimethoxy-4-hydroxyskořicovaacute kyselina (sinapovaacute kyselina - SA) 25-dihydroxybenzoovaacute kyselina (DHB) 43
Přiacuteprava vzorku Přiacutemeacute naneseniacute intaktniacutech buněk - k lyacutezi buněk dochaacuteziacute samovolně při kontaktu s matriciacutendash většina bakteriiacute Plnaacute extrakce proteinů - organickeacute kyseliny anebo alkoholy (kvasinky pliacutesně některeacute druhy bakteriiacute ndash v zaacutevislosti na odolnosti buněčneacute stěny) ndash např extrakce za použitiacute kyseliny mravenčiacute a ethanolu
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
MALDI-TOF MS Analyacuteza proteinoveacuteho profilu 2) srovnaacuteniacute proteinoveacuteho profilu (fingerprint) s referenčniacute (komerčniacute) databaacuteziacute kontrolniacutech kmenů - provaacutediacute software ndash 3 komponenty 1)shodnost neznaacutemeacuteho spektra s nejpodobnějšiacutem spektrem databaacuteze 2) shodnost vybraneacuteho nejpodobnějšiacuteho spektra s neznaacutemyacutem spektrem 3) korelace mezi intenzitami piacuteků danyacutech spekter hodnota 0 (žaacutednaacute shoda) až 1000 (absolutniacute shoda) ndash převedeno do dekadickeacuteho logaritmu ndash skoacutere podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současneacute komerčniacute databaacuteze od vyacuterobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics ndash MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomeacuterieux - VITEKreg MS Dalšiacute databaacuteze kompatibilniacute s oběma hardware systeacutemy např Andromas
vizualizace proteinovyacutech profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol 2010)
44
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
MALDI-TOF MS - POSTUP Přiacutemaacute metoda nanaacutešeniacute vzorku ndash naneseniacute vzorku ve dvou paralelaacutech o nižšiacute a vyššiacute koncentraci buněk ndash po zaschnutiacute na kovoveacute spotovaciacute desce překryty matricovyacutem matricovyacutem roztokem (1 microl) a ponechaacuteny ke krystalizaci při pokojoveacute teplotě
Matrice nasycenyacute roztok -kyano-4-hydroxyskořicoveacute kyseliny (obvykle 10 mgml) v 50 acetonitrilu s 25 kyseliny trifluoroctoveacute
Proteinovyacute standard (1 μl) Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics SRN) ndashproteiny extrahovaneacute z Escherichia coli DH5alpha BRL + některeacute dalšiacute přidaneacute
Přiacutestroj
Bruker Autoflex Speed
Databaacuteze MALDI Biotyper 3 45
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Bacillus cereus Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
NCBI
Identifier
1
( +++ ) Bacillus cereus 994000168 LBK 2358 1396
2
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2246 1396
3
( + ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1977 1396
4
( + ) Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1782 64104
5
( - ) Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1596 1428
6
( - ) Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 1529 1405
7
( - ) Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB 1486 1282
8
( - )
Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi DSM
4809 DSM 1452 74707
9
( - )
Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T
DSM 145 83526
10
( - ) Acidovorax temperans DSM 7270T HAM 1438 80878
Rozsah skore Popis Symbol
2300 3000 vysoce pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( +++ )
2000 2299 bezpečnaacute rodovaacute identifikace
pravděpodobnaacute druhovaacute identifikace ( ++ )
1700 1999 pravděpodobnaacute rodovaacute identifikace ( + )
0000 1699 nespolehlivaacute identifikace ( - )
46
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched Pattern Score
Value
1
( ++ ) Bacillus cereus 4080 LBK 2034
2
( + ) Bacillus cereus 994000168 LBK 1967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM 1654
4
( - ) Bacillus cereus DSM 31T DSM 1514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM 1479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM 1403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD 1338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM 1304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM 1297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ 1289
Rank
(Qualit
y)
Matched Pattern Score
Value
1
( + ) Bacillus cereus 4080 LBK 1964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK 1851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG 1388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM 1388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM 1378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL 1361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM 1352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ 1341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG 1313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM 1311
47
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
Děkujeme vaacutem za pozornost
SabinaPurkrtovavschtcz PetraJunkovavschtcz
