Analytická HPLC

Příprava materiálu byla podpo řena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Část 22 – Analytická HPLC

Kvalitativní analýza

Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku

v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou

ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu

semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými

analytickými metodami.

Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro

nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly

naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků,

mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty,

aby byla identifikace spolehlivější:

a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho

aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším

Analytická HPLC

počtem teoretických pater má větší schopnost rozlišit dvě podobné látky se

srovnatelným chromatografickým chováním.

b) Stejný test by měl být proveden i s jinou mobilní a nejlépe i jinou stacionární fází.

Fáze by měly mít diametrálně rozdílné vlastnosti (třeba normální vs reverzní fáze).

Pokud sledovaný pík nejeví ani při jedné analýze známky separace, je velmi

pravděpodobné, že se jedná o identické látky.

Už jsme zmínili, že zkoumaný pík musí být důkladně analyzován, aby mohl být určen

s potřebnou jistotou. K dalšímu zlepšení kvalitativní analýzy můžeme dospět i bez větších

výdajů následujícími postupy:

a) Specifičtější detektor přispívá k identifikaci píku. RI detektor je univerzální a zachytí

všechny složky, ale UV detektor dává odezvu jen pro absorbující látky a fluorescenční

detektor reaguje jen na fluoreskující sloučeniny. Ještě vyšší specificity

(u fluoreskujících látek) může být dosaženo nastavením excitační a emisní vlnové

délky.

b) Změna zaznamenávané vlnové délky UV detektoru musí být doprovázena stejnou

odezvou signálu vzorku i reference. To znamená, že relativní nárůst i pokles by měl

být stejný. Poměr absorbancí při dvou vlnových délkách je specifický pro každou

látku.

c) Poměr signálů UV a za ním zapojeného RI detektoru (nebo jiné dvojice detektorů) je

za daných podmínek pro látku charakteristický.

Průkaznější, nicméně náročnější, jsou speciální metody. Zejména diodové pole a spřažené

techniky s hmotností spektrometrií jsou v kvalitativní analýze využívány.

Vlivem použitého rozpouštědla vzorku mohou vznikat píky související se změnou indexu

lomu eluentu (tzv. refractive index peaks) a nesmí být zaměňovány za píky analytu (obr.

níže). Vždy je lepší vzorek rozpouštět v samotné mobilní fázi, abychom se těmto

neočekávaným píkům vyhnuli. Nicméně pokud není možné vzorek rozpouštět v mobilní fázi,

můžeme provést slepý pokus s čistým solventem.

Porovnání retenčních časů je významně ovlivněno stabilitou průtoku mobilní fáze kolonou a

je tak méně citlivé než metoda nástřiku směsi reference se vzorkem.

Analytická HPLC

Stopová analýza

Jestliže je cílem analýzy kvantitativní nebo kvalitativní analýza látek v nízkých

koncentracích, je nezbytná optimalizace chromatografického systému. Při izokratické eluci

vždy platí, že je koncentrace v maximu píku cmax nižší než koncentrace v nástřiku ci.

kde:

Vi je objem nastříknutého vzorku,

VR je retenční objem, VR = tR F,

a N je počet teoretických pater kolony.

(S gradientovou elucí je cmax vyšší než vychází z výpočtu pomocí tohoto vzorce.)

Příklad

Je nastříknuto 10 µl roztoku s koncentraci zkoumaného analytu 1ppm (10-6 g ml-1). Retenční

objem odpovídajícího píku je 14 ml. K tomuto píku je vyčíslen počet teoretických pater

kolony na 10 000. Jaká je koncentrace v maximu píku (cmax)?

Řešení

Pro stopovou analýzu je nezbytné získat nejvyšší signál, to znamená nejvyšší možnou

koncentraci v maximu píku. Jak toho docílit?

Příklad

Pro separaci z úlohy výše byla použita kolona o délce 15 cm, vnitřním průměru 4,6 mm a

náplní 5 µm. Koncentrace v maximu píku 0,028 ppm poskytla signál 1mV na UV detektoru.

Vypočtěte intenzitu signálu při následujících podmínkách (všechny ostatní parametry

zůstávají nezměněny).

a) délka kolony je 25 cm,

Analytická HPLC

b) vnitřní průměr kolony je 3 mm,

c) náplň kolony tvoří částice o průměru 3,5 µm.

Řešení

a) Jestliže je náplň nové kolony identické kvality, je výška teoretického patra H stejná.

Proto je počet teoretických pater N, stejně tak retenční objem VR, 25 cm dlouhé kolony

1,7 násobně vyšší (25 : 15 = 1,7).

odpovídající signálu 0,8 mV.

b)

odpovídající signálu 2,4 mV.

c) S identickou náplní kolony s částicemi 3,5 µm bude teoretický počet pater 1,4 krát

vyšší (5,0 : 3,5 = 1,4).

odpovídající signálu 1,2 mV.

Je jasné, že nejmenšího ředění a nejvyššího píku je dosaženo, jestliže je použita krátká

a hlavně úzká kolona s největším možným počtem teoretických pater. Separační účinnost

kolony je důsledkem její kvality, použití dobré náplně, ale nikoliv její délky. Delší kolona

dává nižší koncentrace v maximech píků, protože VR stejně jako N jsou úměrné délce kolony

LC, tudíž cmax závisí na . S danou koncentrací vzorku ci je ředění píků menší s větším

objemem nástřiku, vyšším počtem pater a menším retenčním objemem.

Dříve zmíněná rovnice může být napsána i jiným způsobem (protože a

):

Analytická HPLC

kde:

dC je vnitřní průměr kolony,

ε je celková porozita,

k je retenční faktor,

LC je délka kolony,

a H je výška teoretického patra.

Nyní je nejlepší strategie zřejmá:

- Použít kolonu s malým vnitřním průměrem. Dvojnásobné zúžení znamená čtyřnásobné

zvýšení cmax

- Použít krátkou kolonu

- Použít náplň kolony s malou výškou teoretického patra. Toho je dosaženo menšími

částicemi, výborným plněním a stacionární fází s dobrými vlastnostmi přenosu hmoty.

Kolona musí být provozována ve svém van Deemterovském optimu

- Eluovat analyt s malým retenčním faktorem

Ačkoli jsou preferovány krátké kolony, musí být zároveň dostatečně dlouhé k dosažení dělení

směsi. Metoda musí být optimalizována s ohledem na stopové složky.

Z rovnice rovněž vyplývá, že látkové množství vzorku (neboli součin ciVi) by mělo být velké.

Může dokonce docházet i k přetížení kolony majoritní složkou pokud není ovlivněno rozlišení

stopového píku (obr. níže). Nicméně objem nástřiku je na druhou stranu omezen kvůli

rozšiřování píku. Největší objem nástřiku, který způsobí rozšiřování pásů do 9% je dán:

Analytická HPLC

Je možný i alternativní způsob zápisu rovnice (protože retenční čas a rychlost

průtoku ):

Pokud máme k dispozici dostatečné množství vzorku (např. analýzy potravin), je možné

nastříknout Vi max, i když budou dříve eluované píky široké nebo hlavní složka přetíží kolonu

(za předpokladu, že se tím nezmění rozlišení pro stopový analyt).

Tím pádem bude koncentrace v maximu píku definována ze spojených rovnic pro cmax

a Vi max:

Toto je nejpříznivější situace pro izokratickou eluci (a 9% rozšiřování píků) i přes to, že je

čtyřnásobné ředění poměrně velké.

Všimněte si, že za těchto podmínek (dostatečné množství analytu a nástřik Vi max) nemají dříve

zmíněné požadavky, jako jsou dostatečně krátká a úzká kolona, malá výška teoretického patra

a krátký retenční čas, žádný význam. Jestliže Vi max neovlivňuje rozlišení, rovnice cmax =

0,24ci platí i pro široké, dlouhé a špatně naplněné kolony. Nicméně je vždy žádoucí

optimalizovat separační proces, protože tím ušetříme čas a množství potřebného solventu.

Ve stopové analýze musíme rovněž vzít v úvahu některé další skutečnosti:

a) Vyhýbáme se chvostování. Asymetrické píky jsou širší, a tím pádem i nižší než

symetrické píky.

Analytická HPLC

b) Gradientovou elucí jsou píky zužovány, a proto jsou i vyšší. Jestliže není možné

eluovat složku ve stopové koncentraci při nízkém retenčním faktoru, je doporučováno

využít gradientovou eluci. Může být použit skokový gradient, který je při správném

načasování jednoduchým a efektivním řešením.

c) Měli bychom použít detektor s nejnižším možným detekčním limitem. Detektory na

principu měření obecných vlastností, jako index lomu aj., nejsou pro stopové analýzy

vhodné. Používanější jsou detektory fluorescenční, elektrochemické, nebo UV

detektory, se kterými můžeme “maskovat” interferující nečistoty volbou vhodné

vlnové délky. Podobného efektu se dá docílit i pomocí MS detekce sledováním

charakteristického iontu. Zlepšení meze detekce až o několik řádů můžeme dosáhnout

derivatizací analytů. Při stopových analýzách může být občas přesnější kvantifikace

pomocí výšky píku, než integrací jeho plochy.

Ačkoli je pro kvantitativní analýzu nezbytný poměr signálu k šumu alespoň 10, pro

kvalitativní analýzu je postačující poměr lepší než 3.

Při stopové analýze je nejdůležitější správná příprava vzorku (pokud to jde i s

obohacením/zkoncentrováním analytu). Samotná HPLC poskytuje účinné možnosti

zakoncetrování. Pokud má rozpouštědlo malou eluční sílu, je vzorek zachycen a koncentrován

přímo na vstupu do kolony. Jestliže je potom použit eluent s vysokou eluční silou, omezuje se

rozšiřování píků a koncentrace v maximu píků jsou vysoké. Tento postup je nejefektivnější

pokud se dá provozovat při k = 0, tzn. s rozpouštědlem na čele. Tato technika je označováno

jako vytěsňovací chromatografie (displacement chromatography). Například se podařilo 4

000 krát obohatit fenoly ve vodách na stacionární fázi styren-divinylbenzenu. Pro oddělení

hlavního analytu od stopových látek může být využita technika přepínání kolony (column

switching).

Limity stanovitelnosti a detekce budou rozebírány i v jiné části textu.

Kvantitativní analýza

Signál detektoru je v HPLC mnohem více závislý na vlastnostech specifické složky než

v plynové chromatografii. Například absorpce UV je funkcí molárního absorpčního

koeficientu, který se pohybuje pro různé látky od 0 až po 10 000 l mol-1 cm-1. Absorpční

Analytická HPLC

koeficient se rovněž liší pro jednotlivé látky homologických řad. Z tohoto důvodu je nezbytné

vytvořit kalibrační závislost pro každou stanovovanou látku.

Kalibrace může být provedena třemi různými metodami: externím (vnějším) standardem,

interním (vnitřním) standardem a standardním přídavkem (viz obrázek dole). Celý postup je

zde vysvětlen na jednobodové kalibraci, i když je v každém případě lepší provádět kalibraci

alespoň na tři nebo více bodů. V takovém případě potom nejsou výpočty prováděny

jednoduchou trojčlenkou, jak je uváděno níže, ale pomocí regresní analýzy kalibračního

grafu. Kalibrační závislost by měla být lineární a měla by procházet počátkem

souřadnicového systému. Jestliže používáme ke kvantifikaci starší kalibraci, je možné, že se

současné chromatografické podmínky liší od těch minulých, a tím roste systematická chyba

měření. Pro kvantitativní analýzu můžeme využít plochy i výšky píků, v následujícím textu

slovem „signál“ budeme označovat obě možnosti.

Modelovým příkladem bude stanovení glukózy v limonádách. Obsah glukózy předpokládáme

asi kolem 5 g l-1. Tři kalibrační postupy v tomto případě budou následující:

a) Metoda externího standardu. Připravíme roztok standardu o známé koncentraci

6 g l-1 (není důležité, aby byla přesně 6,000 g l-1, ale musí být přesně známa). Plocha

píku tohoto roztoku Sstd byla 5400 a plocha píku neznámého vzorku Svz byla 3600.

Analytická HPLC

Analytická HPLC

b) Metoda interního standardu. Ke vzorku i ke standardu (z odstavce a) přidáme stejné

množství jiné látky, která není přítomna ve vzorku. Například přidáme fruktózu (obsah

v obou roztocích 10 g l-1). Plochy píků pro glukózu jsou stejné, jako v předchozím

případě. Plochy píků fruktózy jsou pro oba roztoky stejné, rovny 6300. Z uvedených

měření je možné vypočítat poměr signálů, který udává i poměr obsahu složek.

c) Metoda standardního přídavku. Do vzorku je přidáno známé množství analytu.

V tomto případě tedy přídavek glukózy 5 g l-1. Plochy píků jsou 3600 pro samotný

vzorek a 8100 pro vzorek s přídavkem.

Metoda externího standardu je nejjednodušší a měla by být použita jen pro jednodušší

analýzy. Nástřik musí být v tomto případě proveden s dobrou reprodukovatelností, proto je

doporučován nástřik vzorku s využitím zcela naplněné smyčky. Při vícebodové kalibraci není

vhodné nastřikovat různé objemy vzorku a referenčních standardů (např. 10, 20, 30, 40

a 50 µl), protože není možné zajistit dostatečnou přesnost a správnost těchto nástřiků. Je

výhodnější připravit množství kalibračních roztoků s různými koncentracemi a nastříknout

pokaždé stejný objem (pomocí zcela naplněné smyčky nebo alespoň stejným postupem,

kterým byl dávkován vzorek).

V případě kalibrace na vnitřní standard odchylky v objemu nástřiku nejsou podstatné. Tato

metoda je preferována, pokud je příprava vzorku složitá. Přídavek standardu probíhá před

samotnou úpravou vzorku. Výběr vhodného vnitřního standardu není jednoduchý. Musí být

dostatečně čistý, s přesně definovaným složením a podobnými vlastnostmi, jaké má analyt

zejména ohledně úpravy vzorku, chromatografické separace a samozřejmě konečné detekce.

Navíc by měl být pík standardu v chromatogramu vmezeřený mezi ostatními píky, ne na

začátku ani na konci záznamu.

Analytická HPLC

Standardní přídavek je elegantní metoda pokud máme k dispozici neomezené množství

vzorku. Umožňuje analýzu kalibrovat za realistických podmínek se všemi intercedenty, tedy

v aktuální matrici. Metody standardního přídavku a vnitřního standardu mohou být navzájem

kombinovány.

Definovat, jak často je třeba provádět kalibraci, je důležitou součástí validace analytických

postupů. Je rovněž nezbytné zvážit možné chyby v kalibračních křivkách. V obrázku níže je

vidět rozdíl mezi konstantní systematickou odchylkou a úměrnou systematickou odchylkou.

V prvním případě kalibrační křivka neprochází počátkem. Odchylka může být pozitivní (jako

v tomto grafu), ale i negativní. Při použití metody standardního přídavku tento typ chyby

nemůžeme určit! K řivka s úměrnou chybou má odlišný sklon, který může být větší nebo

menší. Oba typy odchylek se mohou objevovat současně a mohou být odhaleny určením

výtěžnosti.

Pro nalezení meze stanovitelnosti (LOQ) bylo navrženo mnoho metod. Musí být definována

nejnižší koncentrace analytu, kterou je potřeba stanovit s požadovanou správností a

opakovatelností. Nejpragmatičtějším přístupem je stanovit si horní limit standardní nejistoty

opakovatelnosti a najít jej experimentálně. Mělo by být analyzováno nejméně šest různých

koncentrací v okolí očekávaného LOQ a každá koncentrace stanovena nejméně šestkrát.

Analytická HPLC

Příklad

Bylo analyzováno šest roztoků různých koncentrací s matricí, každý z nich desetkrát.

Požadavek na opakovatelnost je specifikován maximální relativní standardní nejistotou 10%.

Byla zjištěna následující data:

c [ppm] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5 5,38 4,06 5,48 5,52 5,70 6,12 4,30 5,18 5,44 4,17

10 8,09 9,36 11,29 9,92 10,76 10,50 9,35 11,38 10,21 12,78

15 17,05 13,21 18,76 17,45 16,05 14,68 14,19 14,03 17,59 15,82

20 17,86 19,36 20,87 18,97 18,37 19,82 17,90 18,25 23,42 22,79

25 21,59 24,22 20,33 27,41 26,54 25,99 24,63 26,90 23,55 22,76

30 31,03 28,82 32,32 27,84 31,86 31,37 26,96 25,47 30,91 33,09

Jaký je LOQ?

Řešení

c [ppm] Průměr x

[ppm]

Standardní nejistota s(x)

[ppm]

RSD

[%]

5 5,14 0,71 13,8

10 10,4 1,31 12,6

15 15,9 1,82 11,5

20 19,8 2,00 10,1

25 24,4 2,37 9,7

30 30,0 2,54 8,5

Požadovaná odchylka je nalezena při LOQ rovném 20 ppm.

Limit stanovitelnosti záleží na vlastnostech analytu, které zaznamenává detektor a hodnotě k.

Mez detekce (LOD) je rovna 30% LOQ, to znamená, že v úloze by byl LOD = 7 ppm.

Gradiendová eluce může být zdrojem dalších chyb, proto je při kvantitativní analýze

doporučováno pracovat s elucí izokratickou. Mimo to je nezbytné, abychom udrželi průtok

(pro určení ploch píků) nebo složení mobilní fáze (pro určení výšek píků) konstantní (bude

ukázáno později v níže uvedeném obrázku).

Analytická HPLC

Vzorek by měl být rozpuštěn v mobilní fázi, protože pokud se liší rozpouštědlo a mobilní fáze

může být analýza méně přesná; je rovněž možné, že odezva detektoru je silně závislá na

rozpouštědle.

Závěrem je třeba říci, že kvantitativní analýza nesmí být prováděna, pokud je přetížena kolona

a pokud odezva detektoru není v lineární oblasti kalibrační závislosti. Je třeba prověřit tyto

okolnosti pro všechny experimenty. Správnost může být zlepšena termostatováním kolony.

Dále bychom si měli uvědomit, že není možné dělat kvantifikaci asymetrických píků. Ověření

analytických výsledků můžeme provést několika způsoby.

Výtěžnost

Pro zjištění možných chyb výsledků plynoucí z úprav vzorků nebo ze samotné matrice je

nezbytné určit funkci výtěžnosti a hodnotu výtěžnosti.

Postup (výtěžnost přípravy vzorku)

a) Analýzou čistého referenčního materiálu, který nebyl podroben postupu zpracování

vzorku (nebo byl vynechán krok úpravy). Vyčíslíme kalibrační přímku:

Kde:

y = signál

x0 = hmotnost nebo koncentrace referenčního analytu

a0 = úsek na ose y

b0 = směrnice přímky

b) Čistý referenční analyt je zpracován stejným postupem jako vzorek. Řešení plyne

z kalibrační funkce:

Kde xp je hmotnost nebo koncentrace analyzovaného referenčního materiálu po

zpracování.

c) Vypočítané hodnoty xp vyneseme do grafu proti příslušným hodnotám x0 a následně

určíme funkci výtěžnosti:

Analytická HPLC

Kde index „p“ vyjadřuje, že jde o parametr veličiny po zpracování vzorku.

d) Následně vypočítáme hodnotu výtěžnosti (recovery rate):

V ideálním případě by funkce výtěžnosti měla mít lineární průběh s úsekem ap = 0 a směrnicí

bp = 1. Pokud ap ≠ 0 je v postupu konstantní systematická chyba a jestliže je bp ≠ 1 postup

úpravy vzorku obsahuje úměrnou systematickou chybu.

Funkce i hodnota výtěžnosti mohou být určeny pro každý krok postupu úpravy vzorku zvlášť.

To nám dovolí jednoduše nalézt kritické části postupu a zaměřit se na jejich optimalizaci.

Následně můžeme stejnou metodiku použít i pro určení matricových efektů se vzorky

obohacenými přídavkem standardu.

Příklad

Následující plochy píků byly naměřeny pro roztok aflatoxinu bez úprav vzorku.

10 ng 2432

20 ng 4829

30 ng 7231

40 ng 9628

Stejné měření bylo provedeno po extrakci vzorku na pevnou fázi. Získaná data byla

následující:

10 ng 1763

20 ng 4191

30 ng 6617

40 ng 9050

Vypočítejte funkci i hodnotu výtěžnosti. Posuďte funkci výtěžnosti.

Řešení

a) Kalibrační křivka získaná lineární regresí je:

Analytická HPLC

Tato funkce má úsek na ose y (konstantní systematickou chybu). Důvod tkví

pravděpodobně v samotné HPLC separaci a měl by být nalezen a odstraněn později.

b)

Analogicky je x(20)=17,3 ng, x(30)=27,4 ng a x(40)=37,6 ng.

c) Funkce výtěžnosti je nalezena lineární regresí bodů [xp; x0] tedy [7,2; 10], [17,3; 20],

[27,4; 30] a [37,6; 40]:

Směrnice je téměř ideální, je zde pouze 1% úměrná systematická chyba. Na ose y je

patrné konstantní systematické vychýlení. Znamená, že nalezený obsah aflatoxinu

bude nižší o 2,91 ng. Z toho plyne, že extrakce na pevnou fázi musí být zlepšena.

d) Kvůli této chybě je hodnota výtěžnosti závislá na absolutní hmotnosti vzorku:

Analogicky je RR(20)=86,5%; RR(30)=91,3% a RR(40)=93,7%.

Odhad výšky a plochy píku pro kvantitativní analýzu

Pro dobře rozlišené píky jsou plocha i výška úměrné koncentraci analytu. Proto je možné

vybrat pro kvantifikaci libovolný z těchto parametrů. Obecně je integrace píku přesnější, ale

mělo by to být otestováno v rámci validace konkrétní metody. Pro stopovou analýzu je

naopak lepší posuzovat výšky píků, protože při nízkém poměru signál/šum je integrace

obtížná.

Při kvantifikaci píků narážíme na dva hlavní problémy, kterým je třeba věnovat pozornost:

vliv vnějšího parametru na výšku a plochu a chyby pocházející z překryvu píků.

Vliv retence a rychlosti toku na výšku a plochu píku

Vlivy t ěchto parametrů na kvantifikaci ukazuje obrázek níže.

a) Při izokratické separci je výška píku silně ovlivněna retencí (%B solventu). Rychle

eluované píky jsou úzké a vysoké (vysoký %B), ale píky s delší retencí jsou nízké a

Analytická HPLC

široké (nízký %B). Pro kvantifikaci pomocí výšky píku je nutné, aby bylo složení

mobilní fáze stejné při kalibračních měřeních a analýzách (například u namíchaných

eluentů z důvodu vypařování složky s nižším bodem varu během dne). Výška je

minimálně ovlivněna změnami v průtoku a je řízena van Deemterovou rovnicí.

b) Plochy píků, při použití koncentračně citlivých detektorů, jsou silně ovlivněny

změnami průtoku mobilní fáze. Pokud analyt protéká pomalu detekční celou, bude

i jeho pík v chromatogramu široký, ale výška píku je ovlivněna pouze koncentrací

v maximu, proto bude i plocha píku velká. Na druhou stranu pokud analyt protéká

rychle, bude plocha jeho píku malá. Z tohoto důvodu je pro kvantifikaci pomocí

plochy píků nutné použít čerpadla, které poskytují stabilní průtok mobilní fáze,

dokonce, i když se mění odpor. Plocha píku je minimálně ovlivněna %B.

Analytická HPLC

Překrývající se píky

Překryv píků je významným zdrojem chyb při kvantifikaci. Důvod je zcela zřejmý (viz

obrázek níže).

Analytická HPLC

Pokud integrátor rozdělí dva píky vertikální přímkou, jejich části přesahují a stávají se tak

součástí druhého píku. Ani rozdělení podle tečen místo vertikální přímky nevede k přesné

ploše píku (tato metoda je často používaná jako tzv. „rider peaks“).

Obrázek níže ukazuje vliv integrace pro různá rozlišení, asymetrie a pořadí eluce píků. Vlivy

s ohledem na plochy píků mohou být shrnuty v několika bodech:

a) S Gausovskými (symetrickými) píky je velký pík zvětšen a malý je naopak zmenšen

nehledě na pořadí, ve kterém jsou eluovány. Pouze pokud jsou oba píky symetrické

i stejně velké nedopouštíme se rozdělením svislou přímkou žádné chyby.

b) Pokud píky chvostují je plocha prvního z nich znevýhodněna a druhý je naopak

zvětšen nehledě na poměr velikostí signálů.

c) Poměr relativních chyb je nepřímo úměrný k poměru ploch píků. To znamená, že jsou

malé píky ovlivněny více.

Zde je několik rad, jak se vyhnout těmto chybám:

Analytická HPLC

a) Dosáhněte úplného rozlišení píků! Nezbytná hodnota rozlišení závisí na poměru

velikostí píků. Pro píky srovnatelné velikosti postačuje rozlišení R = 1,5, ale není

dostatečné pro rozdělení píků s poměrem velikostí 20:1 a více.

b) Určení výšky píku je v některých případech přesnější než integrace. Kvantifikace

pomocí výšky píků je téměř prosta chyb i v případě chvostování, kdy je malý pík

eluován před větším.

c) Vyhněte se chvostování. Chvostování snižuje rozlišení a má negativní vliv na integraci

malých píků před většími. Chvostování můžeme zabránit snížením mimokolonového

objemu v přístroji, dobrým naplněním kolony, použitím vhodné stacionární a mobilní

fáze, rozpuštěním vzorku ve vhodném rozpouštědle a nepřetěžování kolony.

Analytická HPLC

Chyby p ři integraci

Elektronické integrátory a datové systémy jsou nepostradatelné, ale z jejich používání

vyplývají i chyby, které mohou být přehlédnuty. K seznámení s touto problematikou může

pomoct kniha sepsaná Dysonem1 nebo jiné souhrnné práce. Mohou se objevit různé druhy

chyb, nejzávažnější jsou prezentovány v následujícím obrázku.

1

N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London, 2nd edn, 1998.

Analytická HPLC

Druhy chyb

a) Nedostatek datových bodů. Ke správnému popisu tvaru píku je potřeba zaznamenat

minimálně 10 bodů. Jestliže je sběr datových bodů příliš pomalý, nebude možné

správně určit výšku ani plochu píku. Vyhlazování původních dat pomocí integrátoru

není v tomto případě správné řešení. Rychlost sběru dat se může a někdy i musí měnit

během záznamu chromatogramu.

b) Příliš vysoká časová konstanta. Pomalá elektronika detektoru nebo integrátoru

zkresluje výstupní signál. Platí, že plocha píku je téměř neovlivněna, výška je

Analytická HPLC

zmenšena a chvostování vzroste. Bude zegistrováno snížení rozlišení mezi

sousedícími píky.

c) Vysoko položená prahová hodnota signálu (treshold). Integrátor rozezná pík, pokud je

signál výš než základní linie. Treshold by měl být správně nastaven a musí být nad

hodnotou šumu. V každém případě je plocha i výška píku zmenšena, pokud je treshold

nastaven přliš vysoko.

d) Velký šum. Není možné provádět správnou integraci, pokud je malá hodnota podílu

signál/ šumu. Výsledky budou nahodilé dokonce, i když bude použit datový systém

dovolující definovat základní linii až po dokončení analýzy. Pro dobrou integraci píku

by měl byt podíl signál/šum alespoň 10.

e) Drift základní linie. Integrátor obvykle počítá s přímou základní linií. Jestliže je

skutečná základní linie zakřivená, bude vypočtená plocha menší než skutečná.

f) Neúplné rozlišení. Nákres ukazuje pouze dva nejčastější problémy. Je lepší použít

rozdělení tečnami nebo kolmicí? S výjimkou ideálních případů je důsledkem špatného

rozlišení vždy chyba v integraci. Asymetrie píků je dokonce ještě zásadnější.

V řadě případů nejsou chyby v integraci kompenzovatelné nástřikem standardů a určením

kalibračních faktorů, protože roztoky standardů jsou obvykle méně složité než reálné vzorky.

Detekční vlnová délka

Pokud používáme klasický UV detektor, musíme zvolit určitou vlnovou délku pro záznam

chromatogramu (samozřejmě to není potřeba při využití detektoru s diodovým polem – diode

array detector). Je potřeba zohlednit několik skutečností:

a) UV spektra různých složek vzorku, hlavně vlnové délky jejich absorpčních maxim;

b) molární absorpční koeficienty v maximech a při vlnové délce, která nakonec bude

vybrána k záznamu chromatogramu;

c) retenční faktory různých složek. Při izokratické eluci jsou píky postupně širší, a proto i

nižší;

d) důležitost jednotlivých složek vzorku (v některých případech je třeba kvantifikovat

pouze jedinou složku).

Analytická HPLC

Čím jsou píky nižší, tím více je ovlivňuje šum. Tím je zhoršena přesnost a pravděpodobně i

správnost kvantitativní analýzy. Proto by měly být píky důležitých komponent eluovány co

nejdříve a detekovány ve svých absorpčních maximech. Obecně platí, že při detekci na

kratších vlnových délkách je analýza méně robustní, je větší nebezpečí, že se objeví tzv.

systémové píky. Základní linie je při gradientové separaci náchylnější k driftování.

Je nutné vhodnost zvolené vlnové délky ověřit na daném přístroji a provádět pravidelně testy

aparatury, abychom byli schopni zaručit dlouhodobou správnost. Dokonce i malá odchylka od

správné vlnové délky může znamenat zásadní chybu v analytických výsledcích.

V chromatogramech níže by měla být správná vlnová délka pro stanovení nitropenty

(poslední pík) 214 nm, což je absorpční maximum látky. Pokud je vlnová délka změněna na

216 nm důsledkem chyby v nastavení nebo nezaregistrovanou změnou v optice přístroje,

poklesne plocha píku nitropenty na 85% skutečné hodnoty, zatímco ostatní píky tak podstatně

ovlivněny nejsou.

Derivatizace

Detekce je největší problém spojený s HPLC. Pokud nemůžeme použít citlivý detektor (např.

fluorescenční), je detekční limit mnohem vyšší než v plynové chromotografii s plamenovým

ionizačním detektorem. Derivatizační reakce jsou vhodným nástrojem pro zvýšení detekčního

limitu v kapalinové chromatografii.

Analytická HPLC

Derivatizace je definovaná změna analytu pomocí chemické reakce a může být provedena

před nástřikem (předkolonová derivatizace), nebo mezi kolonou a detektorem (pokolonová

derivatizace).

Předkolonová derivatizace

Výhody

a) Mohou být libovolně zvoleny reakční podmínky

b) Reakce může být pomalá

c) Derivatizace může sloužit i jako čistící a procesní krok

d) Přebytek činidla může být odstraněn

Nevýhody

a) Během delší reakční doby se mohou tvořit vedlejší produkty

b) Reakce by měla být kvantitativní

c) Různé složky vzorku získají derivatizací podobné vlastnosti. To může vést ke snížení

chromatografické selektivity.

Pokolonová derivatizace: reakční detektory

V tomto případě je činidlo přidáno do eluentu proudícího z kolony. Obecně by měl mít roztok

činidla vysokou koncentraci, aby bylo ředění omezeno na minimum. Reakční cela je

vyhřívána, protože reakce většinou probíhají rychleji při vyšší teplotě.

Výhody

a) Reakce nemusí proběhnout kvantitativně

b) Může být zařazen jiný detektor před derivatizací, tzn. kolona → UV detektor →

reakce s fluorescenčním činidlem → fluorescenční detektor

c) Může být použit vysoce specifický detektor (např. imunoassay)

d) Je možné analyzovat látky, které dávají po reakci identické produkty (např.

formaldehyd), protože separace je předřazena detekci

Nevýhody

Analytická HPLC

a) Reakce musí probíhat v použité mobilní fázi, což může být omezující

b) Samo činidlo by nemělo být detekovatelné. Postkolonová derivatizace s cílem zlepšit

UV detekci je prakticky vyloučena, protože všechna používaná činidla silně absorbují

v UV oblasti.

Třemi nejvýznamnějšími typy reakčních detektorů jsou:

a) Otevřené kapiláry. Čím je kapilára užší, tím pozorujeme menší rozšiřování píků;

průměr 0,3 mm je vhodný. Obrovskou výhodou je použití specificky prohnuté

(spletené) kapiláry (knitted tube), aby došlo k dobrému promísení, a tím minimalizaci

rozšiřování píků. Kapiláry jsou vhodné k reakcím, které proběhnou do 1 min (pro

knitted tube až 5 min).

b) Plněné (bed) reaktory. V podstatě se jedná o kolony, které jsou plněny neporézním

materiálem (např. skleněné kuličky). Neporézní náplň je zcela nezbytná, protože

umožňuje vznik různých proudů, a tím mísení. Reaktory jsou vhodné pro derivatizace,

které probíhají mezi 0,5 a 5 minutami. Náplně v kolonách mohou být opatřeny vrstvou

katalyzátoru nebo imobilizovaného enzymu, a tím se aktivně účastnit reakce.

c) Segmentované systémy. Tok kapaliny je segmentován, tzn. rozdělen do menších zón,

mezi kterými jsou bubliny nebo nemísitelná kapalina. Reakce probíhají pomalu (až 30

minut) a segmentací je zabráněno rozšiřování píků. Fáze jsou poté separovány před

detektorem, ale může být využito i elektronické potlačení vzniklého šumu.

Neočekávané píky: “host peaks” a systémové píky

Kdykoli je možné, že se v chromatogramu objeví nečekané pozitivní nebo i negativní píky.

Jestliže se tyto píky nedají reprodukovat, říkáme jim tzv. ghost peaks. Je nezbytné je

eliminovat, i když to může být zdlouhavé a časově náročné. Důvodem pro vznik

neočekávaných píků mohou být nejrůznější příčiny: bubliny v detektoru, nečistoty v mobilní

fázi, rozdělení složek mobilní fáze, vymývání stacionární fáze z kolony (column bleeding),

nedosažení rovnováhy během gradientových elucí, zbytky z předchozích nástřiků a mnoho

dalších.

Přesně reprodukované neočekávané píky jsou tzv. systémové píky. Objevují se v případě, že je

mobilní fáze směsí několika složek a použitý detektor reaguje na složky s různou citlivostí,

například máme-li v mobilní fázi stopové množství aromátů a detekce je prováděna při 254

Analytická HPLC

nm. Při nepřímé detekci musíme s objevením systémových píků počítat vždy, dokonce i když

je přechod od přímé na nepřímou detekci plynulý. K neočekávaným píkům můžeme rovněž

dospět, pokud ke snížení limitu detekce použijeme detekce na nižší vlnové délce než obvykle.

Neidentifikované systémové píky významně ovlivňují kvalitativní a kvantitativní analýzu

(identifikace může být obtížná, protože systémové píky mohou být dokonce neviditelné!).

Mohou způsobit zmenšení píků a zdvojení píků. Plochy individuálních píků závisí na jejich

relativní poloze vzhledem k systémovým píkům! Proto v obr. dole nejsou plochy píků

racemické směsi bupivakainu ekvivalentní.