1 Praktikum GL der Biologie II Arbeitsgruppe Werner Institut für Zellbiologie Einleitung Die Haut ist das grösste menschliche Organ. Sie ist das Organ des Tast-, Schmerz- und Wärmesinnes und bildet eine Barriere zwischen dem Organismus und der Umwelt. Sie verhindert das Austrocknen des Körpers und das Eindringen mikrobieller Erreger. Ausserdem reguliert sie die Körpertemperatur und bietet zudem Schutz vor mechanischen und chemischen Einflüssen sowie vor schädigender UV-Strahlung. Die Haut besteht aus zwei Schichten, der Oberhaut (Epidermis), einem mehrschichtigen Plattenepithel, und der darunter liegenden Lederhaut (Dermis), die hauptsächlich aus elastischem Bindegewebe besteht. Haare, Nägel, Talg- und Schweissdrüsen sind Anhangsgebilde der Epidermis, die jedoch tief in der Dermis verankert sind. Die Epidermis ist zum grössten Teil aus Keratinozyten aufgebaut. In der Anzahl zwar deutlich geringer, aber dennoch wichtig sind die zum Immunsystem gehörenden Langerhansschen Zellen, die Merkelschen Tastscheiben und die pigmenthaltigen Melanozyten. Die unterste Schicht der Epidermis (Basalzellschicht) enthält als einzige Schicht proliferierende Keratinozyten. Auf dem Weg von der Basalschicht zur Haut- oberfläche durchlaufen die Zellen eine terminale Differenzierung, die sich in morpho- logischen und biochemischen Veränderungen äussert. Die vollständig ausdifferenzierten Keratinozyten enthalten weder einen Zellkern noch Organellen, so dass sie metabolisch und mitotisch inaktiv sind. Die von der Epidermis durch die Basalmembran getrennte Dermis macht den grössten Teil der Haut aus. Ein dreidimensionales Gerüst, das hauptsächlich aus den Faserproteinen Elastin und Kollagen besteht, aber auch noch andere Matrixbestandteile enthält, hält die Haut stabil und elastisch. Auch Blut- und Lymphgefässe durchziehen dieses Gerüst. Die Blutgefässe versorgen die Dermis und die Epidermis mit Nährstoffen. Neben Fibroblasten, die zur Synthese von Bindegewebsbestandteilen befähigt sind, findet man auch Makrophagen und Mastzellen, sowie Nervenendigungen. Die Dermis ist
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Praktikum GL der Biologie II Arbeitsgruppe Werner Institut für Zellbiologie
Einleitung
Die Haut ist das grösste menschliche Organ. Sie ist das Organ des Tast-, Schmerz- und
Wärmesinnes und bildet eine Barriere zwischen dem Organismus und der Umwelt. Sie
verhindert das Austrocknen des Körpers und das Eindringen mikrobieller Erreger.
Ausserdem reguliert sie die Körpertemperatur und bietet zudem Schutz vor
mechanischen und chemischen Einflüssen sowie vor schädigender UV-Strahlung.
Die Haut besteht aus zwei Schichten, der Oberhaut (Epidermis), einem mehrschichtigen
Plattenepithel, und der darunter liegenden Lederhaut (Dermis), die hauptsächlich aus
elastischem Bindegewebe besteht. Haare, Nägel, Talg- und Schweissdrüsen sind
Anhangsgebilde der Epidermis, die jedoch tief in der Dermis verankert sind.
Die Epidermis ist zum grössten Teil aus Keratinozyten aufgebaut. In der Anzahl zwar
deutlich geringer, aber dennoch wichtig sind die zum Immunsystem gehörenden
Langerhansschen Zellen, die Merkelschen Tastscheiben und die pigmenthaltigen
Melanozyten. Die unterste Schicht der Epidermis (Basalzellschicht) enthält als einzige
Schicht proliferierende Keratinozyten. Auf dem Weg von der Basalschicht zur Haut-
oberfläche durchlaufen die Zellen eine terminale Differenzierung, die sich in morpho-
logischen und biochemischen Veränderungen äussert. Die vollständig ausdifferenzierten
Keratinozyten enthalten weder einen Zellkern noch Organellen, so dass sie metabolisch
und mitotisch inaktiv sind.
Die von der Epidermis durch die Basalmembran getrennte Dermis macht den grössten
Teil der Haut aus. Ein dreidimensionales Gerüst, das hauptsächlich aus den
Faserproteinen Elastin und Kollagen besteht, aber auch noch andere Matrixbestandteile
enthält, hält die Haut stabil und elastisch. Auch Blut- und Lymphgefässe durchziehen
dieses Gerüst. Die Blutgefässe versorgen die Dermis und die Epidermis mit Nährstoffen.
Neben Fibroblasten, die zur Synthese von Bindegewebsbestandteilen befähigt sind,
findet man auch Makrophagen und Mastzellen, sowie Nervenendigungen. Die Dermis ist
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mit dem tieferliegenden Gewebe durch die Unterhaut, einem lockeren Bindegewebe mit
eingelagertem Fettgewebe, verbunden. In der Maus und in vielen anderen Tieren
fungiert eine ausgeprägte Muskelschicht (Panniculus carnosus) als Grenze zwischen
Dermis und Unterhaut. Die Abbildung zeigt den Aufbau der menschlichen Haut.
Wundheilung der Haut
Aufgrund der vielfältigen Funktionen der Haut müssen Verletzungen jeglicher Art
möglichst schnell und effizient behoben werden. Mit der Reparatur setzt eine
koordinierte Kaskade zellulärer und molekularer Prozesse ein, die man allgemein als
Wundheilung bezeichnet. Ihr zeitlicher Verlauf kann grob in drei Phasen eingeteilt
werden, in die inflammatorische, die proliferative und die Umbauphase.
In den meisten Wunden, in denen auch Blutgefässe verletzt wurden, setzt die frühe
inflammatorische Phase der Wundheilung durch Blutgerinnung und Thrombozyten-
aggregation mit der Bildung eines Blutgerinnsels ein. Dieser hauptsächlich aus Fibrin
und Fibronektin bestehende Blutpfropf verhindert nicht nur weiteren Blutverlust, sondern
dient auch als provisorische Matrix für einwandernde Zellen. Infolge der Blutplättchen-
aggregation werden Wachstumsfaktoren und Zytokine freigesetzt, die wiederum
Entzündungszellen anlocken. Die Entzündungszellen sind für die Phagozytose von
Zelltrümmern und für die bakterielle Abwehr nötig.
Unterhaut- fettgewebe
Schweissdrüse
Haarbalgmuskel
Talgdrüse
Lederhaut
Epidermis
Haar Pore
Lederhautpapillen Kälterezeptor
Wärmerezeptor
Blutgefässe
Bindegewebe
Nerv
Fetteinlagerung
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Während der proliferativen Phase wird die Wunde durch Bildung eines neuen Epithels
geschlossen (Reepithelialisierung), indem Keratinozyten von der Epidermis am
Wundrand und von partiell zerstörten Haarfollikeln proliferieren und zungenartig in die
Wunde einwandern. An den Wundrändern entsteht infolge dessen ein stark verdicktes
Epithel, das sog. hyperproliferative Epithel. Das zweite Charakteristikum der
proliferativen Phase besteht in der Bildung eines provisorischen Mesenchyms. Innerhalb
von 3 bis 4 Tagen infiltrieren Fibroblasten den Fibrinpfropf und synthetisieren neues
Bindegewebe. Gleichzeitig beobachtet man am Wundrand die Sprossung von
Kapillaren, was zur Bildung neuer Blutgefässe führt (Angiogenese). Das neue Gewebe
in der Wundmitte weist aufgrund seiner erhöhten Zelldichte eine gekörnte Struktur auf,
die zur Bezeichung Granulationsgewebe führte. Noch während der Bildung des
Granulationsgewebes in der Mitte der Wunde beginnt an den Wundrändern die dritte
Phase der Wundheilung, die Umbauphase. Dieser, sich über mehrere Monate
hinziehende Prozess, beinhaltet die Kontraktion der Wunde durch sog. Myofibroblasten,
die von Fibroblasten abstammen, den Umbau der extrazellulären Matrix und die
Differenzierung der neugebildeten Epidermis, sowie die Verringerung der Zellzahl durch
Apoptose. Das wiederhergestellte Gewebe ist im Gegensatz zu Wundheilungsprozessen
im Embryo weder ästhetisch noch funktionell perfekt. Es bleibt ein Narbengewebe
zurück, das sich durch eine relativ schlecht rekonstruierte Kollagenmatrix (keine
Quervernetzung, sondern nur parallele Bündel) und den vollständigen Verlust von
Hautanhangsgebilden (Haarfollikel, Talgdrüsen, Schweissdrüsen) deutlich von
unverletzter Haut unterscheidet.
Wundheilungsphasen Dauer Merkmale I. Inflammatorische Phase 1.-3. Tag Bildung eines Fibringerinnsels
Freisetzung chemotaktischer Faktoren Einwanderung von Entzündungszellen
II. Proliferative Phase 2.-15. Tag Reepithelialisierung der Wunde Bildung des Granulationsgewebes Angiogenese
III. Umbauphase 10. Tag bis Monate
Kontraktion der Wundränder Umbau der extrazellulären Matrix Differenzierung der neugebildeten Epidermis Reduktion der Zellzahl durch Apoptose
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Die verschiedenen in der Wundheilungsablaufenden Prozesse ähneln denen, die bei der
Entstehung und dem Wachstum bösartiger Tumore beteiligt sind. So stellte vor mehr als
20 Jahren ein amerikanischer Pathologe (Harold Dvorak) die Hypothese auf, dass
Tumore Wunden sind, die nicht heilen. In der Tat findet man sowohl in Tumoren als
auch in Wunden gemeinsame Prozesse, wie vermehrte Zellteilung, Wanderung von
Zellen, Angiogenese, Lymphangiogenese, vermehrte Ablagerung, Abbau und Umbau
von extrazellulärer Matrix, sowie Entzündung. Der Hauptunterschied besteht in dem
unkontrollierten und invasiven Wachstum der Tumorzellen, welches durch Mutationen
und epigenetische Veränderungen in diesen Zellen verursacht wird. Es ist daher von
besonderem Interesse, die molekularen und zellulären Grundlagen von Wundheilung
und Krebserkrankungen aufzuklären und die Gemeinsamkeiten sowie insbesondere die
Unterschiede zu identifizieren.
Proteasen in Wundheilung und Hauttumorigenese
Proteasen spielen eine wichtige Rolle in allen Phasen der Wundheilung, um das
Eindringen von inflammatorischen Zellen, die Migration von Fibroblasten und
Keratinozyten, die Bildung neuer Blutgefässe, die Kontraktion der Wunde und
schliesslich die Ausbildung des Narbengeweges zu ermöglichen. Dabei modifizieren sie
nicht nur die extrazelluläre Matrix, sondern beeinflussen auch Wachstumsfaktoren und
andere Proteasen im Wundmilieu. Durch zahlreiche Studien wurden Proteasen zudem
als Hauptmediatoren pathologischer Prozesse in chronischen Wunden identifiziert, zu
deren Entstehung sie durch aberrante Prozessierung von Wachstumsfaktoren,
Zytokinen und Komponenten der extrazellulären Matrix beitragen. Wie in der
Wundheilung werden Proteasen auch stark in Hauttumoren exprimiert und helfen den
Tumorzellen im Primärtumor zu überleben sowie in andere Gewebe vorzudringen.
Deshalb stellen Proteasen wichtige Angriffspunkte für die Entwicklung neuer
Krebstherapeutika dar.
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Station 1
Histologische Färbung von Wundschnitten und Zellen
mit Mayerʼs Hämalaun und Eosin
Material jeweils 2 Objektträger mit Schnitten von 1-, 5- und 13-Tage Wunden
2 Objektträger mit kultivierten Zellen (Fibroblasten und Keratinozyten)
(insgesamt 8 Objektträger)
Färbeprotokoll
Entparaffinieren der Wundschnitte
Um Wundschnitte mit einer guten Morphologie zu erhalten, wurde das Gewebe zuerst in
Paraffin eingebettet und anschliessend am Mikrotom geschnitten.
Für die Färbungen werden auf Objektträger aufgezogene Paraffinschnitte verwendet, die
vor dem eigentlichen Färbeprotokoll erst nach folgendem Schema entparaffiniert
werden:
2x 5 min Roti-Histol (unter dem Abzug)
2 min 100% Ethanol
absteigende Ethanolreihe (je 10 sec)
95% - 90% - 80% - 70% - 50% 10 sec dH2O
Histologische Färbung der Wundschnitte und der Zellen
Bei dieser Färbung werden die Kerne durch Hämalaun blau und die Zytoplasma-
bestandteile sowie die Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) durch das Eosin
rosa angefärbt.
Färbung mit Mayer’s Hämalaun: 1 min Mayerʼs Hämalaun
3×10 sec dH2O
30 sec Scott-Wasser (80 mM MgSO4, 20 mM NaHCO3)
10 sec dH2O
Färbung mit Eosin: 10 sec 70% Ethanol (v/v)
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30 sec Eosin-Lösung (1% Eosin/ 90% Ethanol)
2×10 sec 80% Ethanol (v/v)
2×10 sec 95% Ethanol (v/v)
2×10 sec 100% Ethanol
2×5 min Roti-Histol
Die Schnitte werden anschliessend mit Eukitt Mounting-Medium eingedeckelt (unter dem
Abzug arbeiten).
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Station 2
Auswertung der histologischen Färbung von Wundschnitten
Betrachten Sie die gefärbten Wundschnitte, die Sie bei Station 2 angefertigt haben,
unter dem Lichtmikroskop. Bearbeiten Sie folgende Aufgaben und Fragen für jedes
Wundstadium (1-, 5- und 13-Tage Wunde):
• Fertigen Sie eine schematische Skizze an. Beachten Sie dabei die
verschiedenen Gewebeschichten und beschriften Sie die Skizze.
• Wie verändert sich die Dicke des Epithels vom Rand (intakte Haut) zur Mitte
(Wunde) des Präparates hin?
• Gibt es Unterschiede in der Zelldichte (Zahl der Zellkerne) innerhalb einer
Wunde?
• Wo findet man Haarfollikel?
• Welche Zellbestandteile werden von Hämalaun, welche von Eosin angefärbt?
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Station 3
Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen Fibronektin und Keratin
Es wurde eine Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Antikörper gegen ein
Markerprotein für Keratinozyten (Keratin) und einem Antikörper gegen ein Markerprotein
(Fibronektin) für Fibroblasten, Zellen des Bindegewebes, durchgeführt. Zur leichteren
Einstellung des Mikroskops wurden die Zellkerne ausserdem mit Hoechst-
Fluoreszenzfarbstoff markiert, der in die DNA interkaliert. Die Immunfluoreszenz wurde
sowohl auf einem 5-Tages Wundschnitt als auch auf einer Co-Kultur aus Fibroblasten
und Keratinozyten durchgeführt.
Betrachten Sie die gefärbten Co-Kulturen und den Wundschnitt unter dem
Fluoreszenzmikroskop. Bearbeiten Sie folgende Aufgaben und Fragen:
• Nehmen Sie folgende Bilder auf und überlagern (nur Zellkulturen) Sie die Bilder:
Cy2
(grün) Cy3
(rot)
Hoechst
(blau)
Übersicht über einen Wundrand
Keratin 6 Färbung - alle Zellkerne
Übersicht über einen Wundrand
- Fibronektin
Färbung alle Zellkerne
Zellkulturen Pan-Keratin
Färbung
Fibronektin
Färbung alle Zellkerne
• Was sind Keratine, was ist Fibronektin?
• Welche Zellen exprimieren Keratin, welche Fibronektin?
• In welchen zellulären Strukturen sind Keratin und Fibronektin lokalisiert?
• Welche Strukturen färbt der Hoechstfarbstoff?
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Station 4
Auswertung H/E-Färbung einer Fibroblasten und Keratinozyten Co-Kultur
Material Fibroblasten und Keratinozyten wurden auf einem Objektträger, der in einer Kulturschale
liegt, kultiviert. Die Zellen wurden auf dem Objektträger fixiert und anschliessend mit
Mayer’s Hämalaun und Eosin gefärbt.
Auswertung Betrachten Sie die gefärbten Co-Kulturen unter dem Lichtmikroskop. Bearbeiten Sie
folgende Aufgaben und Fragen:
• Fertigen Sie eine schematische Skizze von den unterschiedlichen Zelltypen an
und beschriften Sie die Skizze.
• Welche Unterschiede gibt es im Aussehen den Keratinozyten und den
Fibroblasten?
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Station 5
Auswertung der histologischen Färbung von Hauttumoren
Zur Untersuchung der Tumorgenese in der Haut wird häufig das Modell der 2-Stufen
Karzinogenese verwendet. In diesem Modell werden die Mäuse zunächst rasiert und
dann einmal topisch mit dem Mutagen DMBA (Dimethylbenzanthracen) behandelt.
Hierdurch kommt es zu Mutationen in der DNA der Keratinozyten, wobei Mutationen im
ha-ras Protoonkogen von besonderer Bedeutung sind. Anschliessend wird die Haut
einmal pro Woche mit dem Phorbolester TPA behandelt, wodurch es zur
Hyperproliferation der Keratinozyten kommt. Im Laufe von 10-20 Wochen entwickeln
sich dann gutartige Papilloma (Warzen), von denen ein geringer Prozentsatz maligne
entartet. Nach einigen weiteren Wochen kommt es in diesem Fall zur Entwicklung von
bösartigen Plattenepithel-Karzinomen.
Material Gutartige Papillome und bösartige Plattenepithel-Karzinome wurden zuerst fixiert, dann
in Paraffin eingebettet und anschliessend am Mikrotom geschnitten. Anschliessend
wurden die Schnitte mit Mayer’s Hämalaun und Eosin gefärbt.
Auswertung Betrachten Sie die gefärbten Präparate unter dem Lichtmikroskop. Vergleichen Sie die
Histologie des gutartigen Papilloma mit der des bösartigen Karzinoms und bearbeiten
Sie folgende Aufgaben und Fragen:
• Wie ist die Form der Tumore?
• Ist die Differenzierung der Keratinozyten in den Tumoren verändert?
• Welche Unterschiede gibt es im invasiven Wachstum der Zellen zwischen dem
gutartigen Papillom und dem bösartigen Karzinom?
• Fertigen Sie eine schematische Skizze von den beiden Tumoren an und achten
Sie dabei auf die Ausbildung von Blutgefässen und die Anwesenheit von
Entzündungszellen.
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Station 6
Detektion proteolytischer Aktivität in Wunden und Hauttumoren
Erhöhte Proteaseaktivität in Lysaten von Wund- und Tumorgewebe kann mit Hilfe von
fluoreszenz-basierten Substrat-Assays nachgewiesen werden. Dabei schneiden aktive
Proteasen ein Peptid (Substrat) und setzen Fluoreszenz-markierte Fragmente frei, die
im Fluoreszenz-Reader gemessen werden können. Die nach einer bestimmten
Inkubationszeit freigesetzte Fluoreszenz-Intensität ist ein Mass für die Proteaseaktivität
in der Probe.
Material Proben: Kontrolle, normale Haut, Wunde, Tumor
