Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/15.0316

Molekulární markery PCR, RAPD, RFLP, AFLP, mikrosatelity, sekvenace

Genetické markery

Genetické markery jsou definovány jako morfologické, anatomické, fyziologické nebo biochemicko-genetické vlastnosti organismů těsně korelující s jinými, mnohdy složitějšími, vlastnostmi.

Rozdělení genetických

markerů

markery

morfologicko-anatomické

biochemicko-fyziologické

biochemicko-genetické

zásobní a stavební proteiny

izoenzymy

nukleové kyseliny

Základní rozdělení DNA

markerů

detekce variability na základě

délkového polymorfismu fragmentů DNA vzniklých restrikčním štěpením (RFLP)

amplifikace fragmentů DNA v in vitro podmínkách (PCR)

stanovení sekvencí neboli pořadí nukleotidových párů v molekule DNA

různých typů propojení metod RFLP a PCR (AFLP)

polymorfismu repetetivních sekvencí mini- a mikrosatelitů

Oblasti využití genetických

markerů

humánní medicína detekce letálně působících genů

detekce napadení člověka například viry

veterinární medicína

detekce letálně působících genů

detekce napadení zvířat například viry

určení paternity

kriminalistika jednoznačná identifikace osob

šlechtění a plemenářství

selekce s využitím markerů

identifikace odrůdové pravosti a čistoty

určení paternity

evoluční biologie

paleontologie

historie

fytopatologie

Selekce s využitím markerů Selekce s využitím markerů neboli MAS (Marker Assisted Selection) je aktuální trend ve šlechtění rostlin i zvířat.

MAS je založeno na tom, že šlechtitel selektuje potomstvo na základě genetické analýzy s využitím různých typů markerů.

Tímto způsobem eliminuje chybu selekce u znaků, které jsou modifikovány vnějším prostředím.

Použití metody MAS výrazně urychluje a zefektivňuje šlechtění.

Řada genetických markerů vykazuje kodominanci a umožňují tak odlišit homozygoty od heterozygotů.

U kvantitativních znaků jsou pomocí MAS identifikovány takzvané kandidátní geny, které vykazují majoritní efekt na úroveň kvantitativního znaku.

DNA markers can be used to determine whether a seedling carries an allele of interest. Here, the marker for the red-flesh allele is detected as an additional DNA band on an agarose gel. Breeders use information like this to decide which seedlings to grow and which to discard.

http://www.biotechlearn.org.nz/

Biochemicko-genetické

markery

- detekce variability organismů přímo na úrovni jejich genetické informace.

- starší typy markerů (proteiny, izoenzymy) detekovaly variabilitu produktů transkripce a translace.

- současnost: detekce variabilitu nositelů genetické informace – DNA a RNA.

- zpravidla je variabilita detekována a vyhodnocována na základě elektroforetické separace různě velkých molekul obvykle na gelovém nosiči.

Markery založené na

polymorfismu DNA

Základní vlastnosti DNA markerů:

• jsou aplikovatelné u všech organismů, kde je zvládnutá technika izolace DNA

• nejsou závislé na podmínkách prostředí

• jejich počet je téměř neomezený

• často lze DNA markery lze použít na minimálním množství DNA = nedestruktivní metody (části listů, semena)

• pomocí DNA markerů lze charakterizovat i velmi raná ontogenetická stádia organismů

Jsou známy vztahy mezi přítomností určité bílkoviny, lokalizací jejího genu a dalšími vlastnostmi rostliny.

Pomocí těchto markerů je možné predikovat například kvalitu složení obilky, odolnosti k některým chorobám nebo stanovit odrůdovou pravost – vypracovány certifikované metodiky

U skotu je obdobným způsobem provedeno hodnocení proteinů mléka.

Proteinové markery

Příklad využití proteinových markerů při studiu linií pýru (Agropyron elongatum) (potenciální zdroj genů tolerance pšenice vůči salinitě a suchu). Přítomnost specifických bandů u linií s vlastnostmi, které by mohly ovlivňovat vlastnosti těsta.

Isozymy = allozymy

U většiny enzymů existují takzvané izoformy neboli izoenzymy.

Izoenzymy katalyzují stejnou biochemickou reakci, t.j. reagují s jedním substrátem a vytváří shodný produkt.

Izoformy jednoho enzymu se vzájemně odlišují například velikostí molekuly.

Levné, rychlé, dostupné …… ?

•Omezená hodnota informací

•Exprese závislá na prostředí

•Jen čerstvý materiál

Isozymy = allozymy

Isozymy = allozymy

RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů

• U malých genomů nebo malých fragmentů DNA s malým počtem vznikajících fragmentů metoda využívá pouhé elektroforetické separace různě dlouhých fragmentů

• U větších genomů technika využívá DNA-DNA hybridizace na principu Southern blottingu.

gDNA naštěpíme restriktázou fragmenty rozdělíme elektroforeticky z gelu je přesajeme na membránu membránu hybridizujeme se sondou navázanou sondu detekujeme

RFLP

Co jsou to restrikční

fragmenty?

Restrikční fragmenty jsou úseky molekul DNA, které vznikají enzymatickou aktivitou restrikčních endonukleáz, které rozpoznávají specifické sekvence, kde „přestřihnou“ molekulu DNA.

Postup RFLP

Rozpoznávací místo restriktázy EcoRI - 6bp dlouhou sekvencE (GAATTC)

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

Sonda -Ze všech naštípaných fragmentů vybírám pouze určitou část DNA, kterou studujeme (gen)

Postup RFLP

Rozpoznávací místo restriktázy EcoRI - 6bp dlouhou sekvencE (GAATTC)

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

Postup RFLP

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

ATCGTCCAG

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG

AATTCGCCCTTC

Standartní (popř. dominantní) alela po naštěpení

Postup RFLP

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

ATCGTCCAG

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG

AATTCGCCCTTC

Standartní (popř. dominantní) alela po naštěpení

Sonda

Postup RFLP

Mutovaná (popř. recesivní) alela

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC ztráta restrikčního místa

(nezabrání vazbě sondy)

Postup RFLP

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC

Mutovaná (popř. recesivní) alela po naštěpení

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC

ATCGTCCAG

ztráta restrikčního místa (nezabrání vazbě sondy)

Postup RFLP

Po provedení elektroforézy, přesátí a hybridizace (Southern blotting)

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

ATCGTCCAG

AATTCGCCCTTC

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG

ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

ATCGTCCAG

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

Standartní alela Mutovaná alela

Štěpení a elfo

ATCGTCCAG

AATTCGCCCTTC

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG

ATCGTCCAG

AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC

RFLP

Sondou se rozumí úsek jednořetězcové DNA, který má sekvenci jako detekovaný gen.

Sonda je obvykle označena radioizotopem fosforu, který ji umožňuje detekovat.

classes.midlandstech.edu

Genetická interpretace RFLP markerů

RFLP markery představují kodominantní typ markerů.

Umožňují vzájemně odlišit dominantní homozygoty, heterozygoty a recesivní homozygoty.

Uplatňují se například:

1. Pro vyhledávání v genomových knihovnách

2. Pro detekce konkrétních genů

3. Pro detekce bodových mutací

4. Pro tvorbu RFLP map, ….

Segregace RFLP markeru

Letální recesivní alela vznikla mutací a liší se od dominantní alely ztrátou restrikčního místa.

• Případ Colin Pitchfork (1983 a 1986) • Dvě slečny znásilněny a zavražděny v hrabství Leicestershire v

Anglii • Mentálně zaostalý mladík Richard Buckland, který nahlásil

nález druhého těla, se přiznal k zavraždění této dívky • Na základě RFLP vyloučen • 5 000 místních mužů bylo požádáno o vzorek krve nebo

bukální stěr • Pekař exhibicionista Colin Pitchfork za sebe k odběru poslal

(za 200 liber) kamaráda Iana Kellyho, který se tím pochlubil v hospodě

• První omilostnění a první obvinění pomocí DNA důkazů.

Nevýhody RFLP

• Požadavek velkého množství intaktní DNA

(50 ng odpovídá ~ 10 000 buněk)

• Metoda málo robustní (interpretační potíže)

Replikace „in vivo“

www.genetika-biologie.cz

Amplifikace fragmentů DNA v

in vitro podmínkách

Tato metoda detekce genů je označována jako polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction). Je založena na zmnožení hledaného úseku DNA. Který je ohraničen známými sekvencemi – takzvanými primery.

Metoda je tvořena opakováním těchto kroků:

• denaturace analyzované templátové DNA

• nasedání dvojice primerů – annealing

• prodlužováním fragmentů DNA.

Zmnožení fragmentu DNA je prováděno v termocykleru.

tnrtb.wordpress.com

http://www.karymullis.com/

• 1955 - objev DNA polymerázy a první pokusy s umělou syntézou většího množství DNA

(amplifikace DNA)

• 1983 – Karry Mullis pracoval na projektu geneticky podmíněných chorob člověka v

kalifornské firmě Cetus Corporation. Hledal novou metodu analýzy mutací DNA.

Modifikoval Sangerovu metodu sekvenace DNA – přidal zpětný primer pro syntézu

krátkých úseků DNA.

Uvědomil si, že opakováním amplifikace DNA pomocí DNA polymerázy může vést k

řetězovému množení specifického segmentu genomu - PCR.

„Pomocí PCR můžete z jedné molekuly DNA vytvořit 100 biliónů kopií za jedno

odpoledne. Potřebujete jenom zkumavku, několik jednoduchých reagencií a zdroj

tepla“

• 1984 – rozpracování metody s matematikem Fredem Faloonou, patentování (Mullis et al.

1986; Mullis a Faloona 1987)

•

• 1993 – Nobelova cena za chemii

• V devadesátých letech Cetus Corp. prodává patenty „PCR a Taq“ firmě Hoffman–La

Roche za 330 miliónů $

PCR – Polymerase Chain Reaction Polymerázová řetězová reakce

PCR – replikace „in vitro“

Polymerázová řetězová reakce

denaturace „annealing“ prodlužování

cit.vfu.cz

Zvyšování počtu kopií

fragmentu DNA při PCR

DNA

PCR – replikace „in vitro“

• další rozvoj metody s použitím termostabilní polymerázy z termofilní

bakterie Thermus aquaticus = zkratka Taq Pol" nebo "Taq")

PCR – Polymerase Chain Reaction

Jak lze zjistit výsledek

amplifikace

Výsledek amplifikace se stanovuje gelovou elektroforézou.

Elektroforeogram amplifikovaných fragmentů DNA, které umožní identifikovat odrůdy brambor.

www.austincc.edu

Koncentrace dNTPs - stock solution 100mM

- ředění na 20 a 200mol (pro každý dNTP) – vyšší specifičnost a nižší frekvence

zařazení nesprávného nukleotidu

Koncentrace MgCl2 - optimum je 1,5-2mM,

- nad 6mM klesá aktivita Taq Polymerázy

- nízká koncentrace – nízké výtěžky PCR

- příliš vysoké koncentrace – rozmazané proužky na gelu nebo

zmnožení nespecifických produktů

Teplota annealingu – nasednutí primerů

- vyšší teplota = vyšší specifičnost ke komplementární sekvenci = primer nasedá

na komplementární místo s vyšší přesností = přesnější výsledek PCR

- nižší teplota – vhodné pro studie, kdy se používají primery odvozené od

příbuzných druhů; nebezpečí vzniku nespecifických produktů (jiné úseky DNA, než

které jsme chtěli získat)

- zvýšení specifičnosti např. tzv. Touch down PCR – v prvních cyklech vyšší teplota =

specifické produkty, ale v s nižším výtěžkem = v dalších cyklech vyšší teplota

annealingu = zvýší se výtěžek PCR

- Koncentrace templátové DNA – příliš vysoká konc. DNA může bránit PCR, zároveň se

naředí inhibitory PCR ve směsi (např. chemikálie použité při izolaci)

PCR – hlavní faktory ovlivňující průběh reakce

Volba polymerázy – odlišné výsledky PCR od Taq P. od různých firem

- např. pro sekvenace – „proofreading polymerase“ – nižší

procento vložení chybného nukleotidu

Aditiva - pro zvýšení efektivity PCR, stabilizaci enzymu

- v pufru dodávaném s polymerázou:

- detergenty (TRITON X-100, TWEEN, NP-40) -

zpravidla 2 ze tří uvedených

- dimetylsulfoxin nebo glycerol – lepší průběh

denaturace a chlazení

- BSA (bovinní sérový albumin) nebo želatina

- Finální koncentrace aditiv se pohybuje mezi 0,1 a 1,0% celkové reakční

směsi, avšak konkrétní koncentrace je většinou nutno empiricky vyzkoušet.

Kontaminace – nebezpečí zejména u málo koncentrovaných nebo problematických

templátů

- sterilní špičky, vysoce čistá voda pro PCR, pufry, PCR zkumavky, rukavice

(nikdy nesterilizovat dNTPs, primery, polymerázu )

- příprava PCR směsí ve flow boxu v oddělené místnosti od prostor, kde se

pracuje s produkty

- při přecházení z místností měnit rukavice…..

PCR – hlavní faktory ovlivňující průběh reakce

Optimalizace reakčních podmínek PCR - Změny v protokolu vedoucí k odstranění nežádoucích nespecificit a ke zvýšení množství PCR produktu. - počet cyklů - annealingová teplota - koncentrace Mg2+, polymerázy, templátové DNA - aditiv (např. DMSO, formamid)

Příklad optimalizace PCR Podmínky podle literatury PCR po optimalizaci

Marker 1 - produkt 240bp

Ta = 66°C, 30 cyklů 20uM primery

Marker 2 - produkt 460bp

Ta = 62°C, 30 cyklů 20uM primery

Ta = 67°C, 25 cyklů 10uM primery

Ta = 66°C, 25 cyklů 10uM primery

1 1 1 1 2 1 1 B

1 1 1 1 2 1 1 B

1 1 1 1 2 2 1 1

1 1 1 1 2 2 1 1

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Variabilita délek náhodně amplifikované DNA

Random Amplified Polymorphic DNA Variabilita délek náhodně amplifikované DNA

• PCR s jedním primerem

• Primer dosedne na různých místech a v různých směrech amplifikuje DNA fragmenty

RAPD

Identifikace např. kmenů bakterií popř. ověřování homogenity linií

Výhody

- Velmi levné

- Rychlé a snadné = není třeba znát sekvenci primeru, stačí velmi málo DNA, poměrně dost fragmentů…

Nevýhody převažují:

- Omezena hodnota informace (dominantní marker)

- Nereproducibilní

DNES TREND NEUŽÍVAT RAPD MARKERY

RAPD

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism

Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů

Postup – relativně složitý (4 fáze)

1. RESTRIKCE • specifické rozštěpení DNA restrikčními endonukleázami

MseI - rozpoznává 4bp dlouhou sekvenci (TTAA) EcoRI - rozpoznává 6bp dlouhou sekvenci (GAATTC)

(Variabilita je dána mutací v restrikčním místě insercí - delecí mezi restrikčními místy)

• získáme množství fragmentů s „lepivými konci“ = „sticky ends“

AFLP

Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu

• pomocí T4 ligázy k fragmentům přidány adaptory = oligonukleotid, jeho sekvenci známe

• známe sekvence konců všech fragmentů … můžeme je amplifikovat PCR

AFLP – 2. ligace

klasická PCR s primery komplementárními k sekvenci adaptorů, navíc 1 nukleotid směrem dovnitř amplifikovaného úseku = selekce jen ca. 1/4 fragmentů (fragmenty komplementární k primerům + fragmenty EcoRI- MseI)

AFLP – 3. preselektivní amplifikace

AFLP – 3. preselektivní amplifikace

restrikce + ligace

AFLP – 3. preselektivní amplifikace

preamplifikace

restrikce + ligace

-fragmentů je stále mnoho pro objektivní vyhodnocení

-další redukce jejich počtu použitím primerů se 3mi selektivní nukelotidy (s přesahem "dovnitř" amplifikovaných fragmentů)

- tento krok se provádí opakovaně s různými primerovými kombinacemi (primery se liší zařazenými nukleotidy na koncích

-redukce na 1/256 všech fragmentů (1/16 x 1/16)

AFLP – 4. selektivní amplifikace

-primery jsou fluorescenčně značeny sekvenátor

- Primery bez značení PAGE elektroforéza

AFLP – 5. vyhodnocení

AFLP - realizace

1: Restrikce - příprava restrikčního mixu (EcoI, MseI, buffer, voda)

- přidat k DNA - inkubovat 2 hod při 37°C

2: Ligace - příprava ligačního mixu (LIGAZA, BUFF, ADAPTORY, VODA) - přidat k roztoku z předchozího kroku - inkubovat 2,5 hod při 37°C

3: Preamplifikace - klasická PCR - ligační roztok jako matrice

Kroky 1-3 se provedou pouze 1x, dál pracujeme s preamplifikátem

4: Amplifikace - klasická PCR - matrice = preamplifikát - měníme kombinace primerů = detekujeme jiné fragmenty

AFLP – realizace

MIKROSATELITY

krátké tandemové repetice, STR (short tandem repeats) repetice jednoduchých sekvencí, SSR (simple sequence repeats) •krátké, tandemově se opakující jednoduché sekvenční motivy zpravidla o délce 2-6bp •prokaryota a eukaryota •kódující i nekódující oblasti •Vysoká mutační rychlost (u savců 10-3 až 10-4/lokus/generaci) hlavní zdroj vysoké proměnlivosti - sklouznutí nukleotidového řetězce

během replikace (replication slippage) ….

…GTTCTGTCATATATATATATAT…………CGTACTT… …GTTCTGTCATATATATATATATATATATCGTACTT…

•Alely se liší svou délkou…… •Snadná separace pomocí elektroforézy

MIKROSATELITY

– Dokonalé = perfect repeats (jeden nepřerušený motiv): • Jednonukleotidové: …AAAAAAAAAAAAAAAAAA…

• Dinukleotidové: …CACACACACACACACACACA… = (CA)n

• Trinukleotidové: …CGTCGTCGTCGTCGTCGTCGT… = (CGT)n

• Tetranukleotidové: …CAGACAGACAGACAGACAGA… =(CAGA)n

• Pentanukleotidové: …AAATTAAATTAAATTAAATT… =(AAATT)n

• Hexanukleotidové: … CTTTAACTTTAACTTTAACTTTAA… =(CTTTAA)n – Pr: …(AG)32…; …(TAT)25…; …(CAA)7… Cicer

– Nedokonalé = imperfect repeats (motiv je přerusen jedním nebo několika bazemi): • …(TC)6A(TC)13…; …(AG)12GG(AG)3… Cicer

– Složené = compound: (směs dokonalých nebo nedokonalých vzorů několika motivů)

• …(AT)6(GT)42AT(GT)5(GT)10…

• …(AT)14(AG)8…

• …(GAA)21…(TA)23

• Nejčastější motivy: mono a dinukleotidové; 3, 4 a 5ti méně

MIKROSATELITY

celková DNA

PCR – specifický pár primerů

…GTTCTGTCATATATATATATCGTACTT…

MIKROSATELITY

ELFO separace

Výhody - vysoká variabilita - velká početnost a rozmístění po celém genomu - jednoduchost analýzy (mikrosatelity lze poměrně snadno

studovat pomocí PCR)

- robustní a reproducibilní markery

- KODOMINANTNÍ MARKER, IDENTIFIKACE ALEL

MIKROSATELITY

Nevýhody - Musíme znát sekvence primerů

- Pokud neznáme, tak testovat SSR z příbuzných druhů - Optimalicace PCR - Popřípadě vyvíjet nové: EST-SSR

MIKROSATELITY - využití

jaderné mikrosatelity (SSRs) • nejlepší marker pro zhodnocení variability na populační úrovni • jsou potřeba druhově specifické primery, tj. metoda použitelná pouze v případě, že pro

studovaný druh byly primery již publikovány

chloroplastové mikrosatelity (cpDNA SSRs)

• vhodné pro hodnocení variability na úrovni příbuzných druhů, někdy i na vnitrodruhové úrovni

• dostupné jsou univerzální primery

Obecně: • Forenzní genetika: kriminalistika, identifikace jedinců, příbuzenské vztahy

• analýza rodičovství (parentage analysis)

• určení rodičů semen (semenáčků) v populacích

• identifikace klonů

• populačně-genetické studie

• genový tok, migrace

• historie populací

MIKROSATELITY - využití

MIKROSATELITY - využití

SEKVENOVÁNÍ DNA

• zjištění pořadí nukleotidů v řetězci DNA …ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT…

• Zjištění rozdílů mezi jedincemi, geny

• Základní informace pro konstrukci primerů

• využití informace ke zjištění průběhu a rychlosti evoluce

• zjištění podobnosti a příbuznosti taxonů

SEKVENOVÁNÍ DNA - princip

• 1) Předstupeň: PCR s použitím dvojice primerů

• namnožení studovaného úseku DNA

• 2) sekvenační reakce

• použití pouze jednoho primeru

• kromě dNTP jsou ve směsi přítomny i ddNTP

• produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi

• Elektroforetická separace fragmentů na gelu

• automatický sekvenátor

SEKVENOVÁNÍ DNA - princip

Aplikace - Aplikační možnosti:

1. evoluce genů (vznik alel, lokusů,redukce polymorfismu v důsledku selekce atd.)

2. vnitrodruhové (populační) studie (geografická proměnlivost, tok genů, hybridizace,

fylogeografie (př. mitochondriální geny, Y chromozom) 3. mezidruhové studie (studium speciace, biogeografie)

- volba správné sekvence

4. Detekce SNP = identifikace jedinců, taxonů, populací – sekvenace pomáhá nalézt drobné

populačně- i taxonově-specifické rozdíly

Výhoda - Možnost srovnání sekvenčních dat o vašem organismu s údaji v internetových databázích

Př: http://www.ebi.ac.uk/embl/

SEKVENOVÁNÍ DNA

1977: dvě metody zjištění pořadí nukleotidů v DNA

Maxamova-Gilbertova (chemická) metoda je založena na bázově-specifické chemické modifikaci a následném štěpení fragmentů

DNA - dnes se neužívá

SEKVENOVÁNÍ DNA

Krátká sekvenceDNA (ds nebo ss) * na 5' konci radioaktivně označena 32P. * vzorek se rozdělí na pět částí a) Přídavek chemikálí – modifikují vždy jeden nebo dva typy nukleotidů: 1. dimethylsulfát: G 2. kys. mravenčí: A+G 3. hydrazin: C + T 4. 1,5M NaCl: C

b) Přídavkem piperidinu: štěpení DNA v místě modifikace c) Elfo separace

Výsledek ELFO: sekvence DNA: 5´-GTCTGCA-3´ (čte se zespodu)

- narazila na technické problémy s vývojem standartních molekulárních kitů - technicky příliš komplexní a příliš mnoho toxických látek

SEKVENOVÁNÍ DNA

Sangerova metoda terminace řetězce

Sangerova metoda • založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence dideoxynukleozidtrifosfátem (ddNTP)

• na 3’-uhlíku deoxyribózy chybí OH-skupina a proto k nim DNA polymeráza nemůže navázat další nukleotid

•pokud během replikace dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukelotidu (ddA, ddC, ddG, ddT), replikace se zde zastaví

Sangerova (enzymatická) metoda •Vzorek DNA se rozdělí do čtyř zkumavek a do každé se přidá specifický primer, směs všech čtyř standartních nukleotidů a DNA polymeráza

•Do každého ze vzorků je přidán vždy jen jeden značený dideoxynukleotid - v určitém poměru s deoxinukleotidy

•Př: • ddA + dA, dG, dC, dT • ddT + dA, dG, dC, dT….

•Po ukončení amplifikace separace pomocí denaturující PAGE v dlouhém

(sekvenačním) gelu + detekce autoradiograficky

• výsledné pořadí nukleotidů se odečte

SEKVENOVÁNÍ DNA

Sangerova metoda založená na terminace řetězce

• Syntéza DNA je v principu totožná s asymetrickou PCR (tj. s jedním primerem)

v normálním termocykleru, s extenzí řetězce Taq polymerázou.

• k detekci produktů jsou užívány fluorescenčně značené ddNTP = každý

dideoxynukleotid má jinou značku – tzv. „Dye-terminator sequencing“

• Př. ABI PRISM® Big Dye™ Terminator v 3.1. Ready Reaction Cycle Sequencing Kit

• Polymerizační reakce probíhá v jednom vzorku

• během PCR dochází k produkci fragmentů lišících se o jednu bázi

• detekce produktů probíhá během elektroforetické migrace v kapiláře pomocí

laserového detektoru

• sekvence je zaznamenána přímo do paměti počítače

• 500 – 700 bp/run

SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění Sangerovy metody

vývoj kapilárních sekvenátorů

SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění Sangerovy metody

vývoj kapilárních sekvenátorů

Vzorek s fluorescenčně značenými fragmenty po PCR

SEKVENOVÁNÍ DNA

SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění metody

vývoj kapilárních sekvenátorů

Kapiláry - vnitřní průměr 50μm - naplněny gelem s nízkou viskozitou, který nahradil polyakrylamid (dříve kapiláry nešlo opakovaně používat) - kratší časy analýz - plně automatizované systémy

Automatické sekvenátory

Nature Reviews Microbiology 7, 287-296

Celogenomové sekvenování

- paralelně probíhající sekvenační reakce

- produkují tisíce – miliony sekvencí v jednom běhu

- čtení kratších úseků (30-300bp)

- Obecný postup

1. Izolace DNA

2. Příprava DNA knihovny – PCR, klonování

3. Vlastní sekvenace

4. Vyhodnocení surových dat

5. Sestavení konsenzuální sekvence

NGS = Next Generation Sequencing

Nature Reviews Microbiology 7, 287-296

454 - Pyrosekvenace - první nová sekvenační metoda (1998) - princip: detekce aktivity DNA-polymerázy během syntézy DNA

- Výhody: - délka čtených úseků 700bp - rychlost – sekv. cyklus 10 hodin - sekvenace PCR produktů

- Nevýhody - překryvy homopolymerních oblastí - cena

454 sekvenování

úseky 300 bp

- čteno 400 tisíc fragmentů

najednou

Pico-titer plate (sekvenační čip - obsahuje 1,6 mil jamek širokých 44μm - průměr DNA kuličky je 26 μm -přídavek menších kuliček dvou typů – jeden obsahuje chemikálie pro pyrosekvenaci, druhý typ fixuje kuličky s DNA

Fragmentace DNA - 300-800bp

Ligace adaptorů - B adaptor má biotinovou značku pro přichycení na streptavidinem obalenou magnetickou kuličku

Sekvenační reakce - Na destičku se cyklicky nanáší roztok polymerázy a vždy jednoho nukleotidu… viz. pyrosekvenace

Emulzní PCR - DNA kuličky do roztoku oleje a vody - Protřepání = vznik mikroreaktoru okolo kuličky

Záznam a zpracování dat

Pyrosekvenování

1. začlenění nukleotidu (konkrétní typ, ne směs)

2. uvolnění pyrofosfátu (PPi)

3. Vznik ATP

• Enzym ATP sulfuryláza katalyzuje vznik ATP reakcí PPi s adenosinfosfosulfátem (APS)

4. Emise záření:

• enzym luciferáza spotřebuje vzniklý ATP na oxidaci luciferinu – záblesk

5. Detekce záblesku

6. Enzym apyráza odstraní nespotřebované nukleotidy a ATP

7. Promytí systému

8. Změna typu nukleotidu ve směsi – krok č 1.

pico-titer plate from Roche's FLX

Roche 454 sequencing

Illumina Genome Analyzer -metoda sekvenace syntézou (SBS-sequencing by synthesis) - r. 2006; úseky 35-50bp

- 1) Příprava knihovny - fragmentace - na konce dva adaptéry - ELFO: vyříznou se fragmenty 150-200bp - přečištění

- 2) Amplifikace fragmentů (bridge amplification) - na sklíčku jsou oligonukleotidy komplementární k oběma adaptorům - jednovláknové fragmenty se navážou na sklíčko – vytvoří „můstek“ - dosyntetizování komplementárního vlákna - denaturace – dva identické fragmenty navázané na sklíčko blízko sebe - opakování = vznik tisíců kopií těsně vedle sebe v tzv. „clusterech“

Illumina Genome Analyzer - 3) sekvenační reakce

- v každém cyklu NARÁZ všechny nukleotidy - mají fluorescenční značku a modifikovaný 3´konec (brání zařazení více nukleotidů v jednom kroku)

- zařazení nukleotidu provázené emisí světla, charakteristického pro daný nukleotid - detekce - odstranění fluoresc. značky a odblokování 3´konce - opakování postupu - x cyklů - zpracování dat

Illumina sequencing

SOLiD sequencing

Sekvenace pomocí LIGACE krátkých oligo sond,

které jsou fluorescenčně značeny

+ cena

+ vysoká přesnost metody (99,95%)

+ malé množství vzorku

- čtené úseky: 100 bp

- náročnost zpracování dat a rychlost analýzy (týden)

1. Příprava DNA knihovny

• Štěpení templátové DNA na kratší fragmenty

• Připojení adaptorů P1 a P2

• emPCR – amplifikace fragmentů na magn. kuličkách

• modifikace 5´konce – připojení na sekvenační destičku

2. Vlastní sekvenace

SOLiD sequencing

SOLiD sequencing - Sekvenační reakce

• Navázání univ. primeru, ligace sondy

• Připojení univ. primeru k adaptoru P1

• Přidání oktamerních sond s fluoro. značkami

4 barvy, 16 kombinací koncových nukleotidů na 1. a 2. pozici

Pokud je sonda na 1. a 2. pozici komplementární k 1. a 2.

pozici templátu – prodloužení řetězce DNA ligázou

2. Emise a detekce fluoresc. signálu

3. Odštěpení fluoresc. značky (štěpení sondy mezi

5. a 6. nukeotidem)

4. Opakování kroků 1. – 3. x-krát po konec

sekvence

5. Reset primeru – odštěpení nově nasynt. Vlákna

6. Napojení nového univ. primeru k adaptoru P1

- primer je o jeden nukleotid kratší

7. Opakování kroku 1.-6. s primery (n-2) až (n-6)

8. Vyhodnocení dat – dešifrování barevného kódu

8. Vyhodnocení dat – dešifrování barevného kódu - každá báze je určena na základě dvou nezávislých sekvenačních cyklů

SOLiD sequencing

Odvozené metody využívající NGS sekvenace při hledání SNP polymorfismů

Trends in Genetics April 2013, Vol. 29, No. 4

RRL sequencing

RAD-Taq sequencing

- restrikce: DNA je naštípána restriktázami, - ligace: na vzniklé fragmenty je navázán adaptor, - vysokokapacitní NGS sekvenování (tagged fragment amplification) - analýza dat ……. - Hledání SNP – a) anotace k referenčnímu genomu b) pooling vzorků a hledání SNP lokusů (putative RADtaq locus) - Kombinace snížení komplexnosti genomu restrikčním štěpením s NGS sekvenováním.

That´s all folks!