Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie

Miroslav Průcha

Příklady optických technik Atomová absorpční

spektrofotometrie Absorpční

spektrofotometrie Absorpční

spektrofotometrie kinetická

Denzitometrie Fluorimetrie Luminometrie Nefelometrie Nefelometrie laserová

Polarimetrie Refraktometrie Spektrofotometrie

reflexní Spektrofotometrie

infračervená Spektroskopie Turbidimetrie UV spektrometrie

Optické metody Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že disperzní

soustava se při průchodu světla jeví zakalená. Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi se světelné paprsky mohou:

od částic odrážet, mohou částicemi procházet, přičemž index lomu částic je

téměř vždy odlišný od indexu lomu disperzního prostředí, takže paprsek mění směr,

vyvolat oscilaci částice (pokud je částice dostatečně malá tj. je–li průměr částice r< 0,1 l), takže částice sama se stane zdrojem záření o stejné vlnové délce.

Nefelometrie a turbidimetrie

Reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem.

Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti tvorby nebo hustotě zákalu.

Turbidimetrie a nefelometrie – principy metod V důsledku reakce mezi antigenem a protilátkou dochází k

precipitaci a vznikají tři zóny – zóna nadbytku protilátky, zóna ekvivalence a zóna nadbytku protilátky

Precipitační křivka - oblast využitelná pro měření, bezpečnostní oblast, oblast za kritickým bodem

Kritický bod – nejvyšší koncentrace antigenu, který může analyzovaný vzorek obsahovat a nedojde přitom k naměření falešně nízkých koncentrací

Reakce probíhají v tekutém prostředí, v měřící kyvetě (pufr, enhancující látka, antigen a protilátka.

Nefelometrie – zdroje světla – výbojka nebo laser (670 nm) Turbidimetrie – zdroj světla dioda

Turbidimetrie a nefelometrie

Nefelometrie

Turbidimetrie a nefelometrie Systém end point – po smíchání antigenu a protilátky

proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu, možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu

Proto nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky

Systém kinetický - reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje.

Výhoda – možnost vyhodnocování atypických koncentrací měřené látky

Turbidimetrie Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru

s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem

Po průchodu světelného paprsku suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intensity v důsledku rozptylu, absorpce a odrazu.

Pokles intensity paprsku je úměrný množství imunitních komplexů v roztoku.

Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek, je množství vytvořených imunitních komplexů (turbidita analyzovaného vzorku tělní tekutiny) přímo úměrné koncentraci analytu.

Turbidimetrie Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla

zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu) Stupeň zákalu – turbidita Precipitační reakce mezi antigenem(Ag) a protilátkou (Ab) Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a

rozptylující vrstvou. Nutno získat reakční směs dostatečně stálou (ochranný polymér –

polyetylenglykol) Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto je

vhodné měřit při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem (340 nm v blízké UV oblasti

Turbidimetrie Průchod záření nehomogenním prostředím způsobí

absorpci záření, která se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry.

Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto se specifické proteiny stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem tj. při 340 nm.

Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým světlem (435-480 nm)

Turbidimetrie Turbiditu lze měřit na jakémkoli fotometru nebo

spektrofotometru, pokud je suspenze bezbarvá Ruší hemolýza Vztah mezi absorbancí a koncentrací částic je pro malé

částice lineární, tato lineární závislost se může měnit na nelineárné se změnou vlnové délky

It = I0 . Exp (- זL) (I intenzita prošlého záření, I0 intenzita světelného zdroje, ז turbiditní koeficient, L světelná dráha kyvetou

Reprodukovatelnost 5%

Nefelometrie k měření se využívá světelného toku rozptýleného disperzní

soustavou Optická metoda měření intenzity difuzně rozptýleného

světla na dispergovaných částicích Rozptýlené (Tyndallovo) světlo vychází z roztoku všemi

směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření

Světelný zdroj – helium neonového nebo argonového laseru

Nefelometrie

Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou

délkou dopadajícího světla Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu

světla, která je přímo úměrná rychlosti vzniku IK – Ag-Ab

Srovnatelná citlivost s turbidimetrií

Praktické aplikace IgA,G,M, podtřídy, volné řetězce kappa, lambda, reaktanty

akutní fáze (CRP, haptoglobin, orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa 2 makroglobulin)

Léky

Finanční nákladnost

Příklady analyzátorů – Beckman, Olympus