J. MASOPUST, Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta, Ústav klinické biochemie a patobiochemie

„„Život jako dědičné, smrtelné Život jako dědičné, smrtelné onemocnění přenášené onemocnění přenášené

pohlavními buňkami“pohlavními buňkami“ (s různou prognózou a dobou trvání)(s různou prognózou a dobou trvání)

Prodromální stádium

Připravuje se sblížením dvou jedinců odlišného pohlaví a interakcí jejich funkčních pohlavních buněk:

SPERMIE a VAJÍČKA (obsahujících specifickou genetickou informaci)

Transport spermie

Transport vajíčka

3. Spermie v dist.části vejcovodu (pod 50)

2. Spermie v dutině dělohy (100 000)

1. Spermie ve vagině po koitu (250 milionů)

4. Vajíčko mezi ampulou a isthmem (1.-2. den)5. Vajíčko v uterotubulárním spojení (2.-3. den)6. Vajíčko proniká do dutiny dělohy (3.-4.den)7. Implantace blastocysty (7. den)

Zona pelucida(15-25 min)

Perivitelinníprostor (1 sec)

Perivitelinní membrána (1 min)

Mitotické vřeténko1. dělení(24 hod)

Viditelné mužskéa ženské

prvojádro (2-3 hod)

(a) Uvolnění kortikálních granulí(b) Kompletizace 2. meiotického dělení

a tvorba polárních tělísek FERTILIZACE

Plodnost muže

Kupř. Epididymální glykoprotein (EG)Člen rodiny CRISP (cystein-rich secretory protein)

Jeho inhibice aplikací specifické protilátkyzabrání oplodnění

„KLINICKÉ“ STÁDIUM (ontogeneze)

Po fertilizací vzniká

• EMBRYO• FETUS porod

• NOVOROZENEC• DÍTĚ• DOSPĚLÝ JEDINEC

Období prenatální

Obdobípostnatální

Ačkoliv buněčná struktura těla je velmi složitá, je vytvářena omezeným repertoárem buněčných aktivit:

*PROLIFERACE – DIFERENCIACE – APOPTÓZA *ADHERENCE*PŘENOS SIGNÁLU V BUŇCE *REGULACE CELÉHO ORGANISMU

Faktory regulující časnou embryogenezi

• Růstové a diferenciační faktory (GDFs)

• Fibroblastové růstové faktory (FGFs) a jejich receptory (FGFRs)

• Hedgehog proteiny• Wnt proteiny• TGFnadrodina• Oct ¾• Nanog• BMP a další

morula

Časnáblastocysta

Pozdníblastocysta

spermie

oocyt

Oplod.vajíčko

1.dělení 2.dělení

Implantaceblastocysty

Oct 4

BMP 4

Nanoghomeobox

Oct 4POU class homeobox

SOX 2SRY

7. den gestace

SIGNALIZACEv časné fázi embryogeneze

proliferacepřežití

proliferace růst glykogen přežití

Zvýšenísyntézy NO

Signalizcerůstových

faktorů

0 3 6 9 POROD týdny gestace Fetogenesis

Vývoj rizika teratogeneze v prenatálním období

riziko

GENOM

Transkriptom

Kinom

PROTEOM

METABOLOM

GENOM

Transkriptom

PROTEOM

METABOLOM

transdukcesignálu(kinom)

Envirom

Envirom

Envirom Envirom

MATKA OTEC

GENOM

FARMAKOMETABONOM

Vlivy „in utero“ - Životní styl – Choroby

Věk – Léky – Potrava (Envirom)

LIDSKÉ TĚLO(hybridní „superorganismus)

• 10% vlastních buněk (10 trilionů)

• 90% mikrobů (37 druhů) – střevní mikrobionta (90 trilionů)

Bakteriální metabolismus poskytuje některé nezbytné vitaminy a kofaktory:

- vitamin K, foláty. biotin- produje 5 – 30 % metabolické energie (kyselina máselná)- podílí se na regulaci imunitního mechanismu

15tiletá periodizace lidského života (WHO)

Dětství 0 – 14 r

Dospívání 15 – 29 r

30 – 44 r

45 – 59 r

Rané stáří 60 – 74 r

Vlastní stáří 75- 89 r

Dlouhověkost 90 a více

Druhý věk

Období produkční

Třetí věk

Období poprodukční

První věk, Období

předprodukční

Dospělost

Střední věk

STÁRNUTÍ fyziologický vývojový

proces se změnami na celulární, sub-celulární i na úrovni celého organismu, které odpovídají postupujícímu věku

Problém gerontologie:Odlišit geneticky programované změny buněčných struktur a funkcí od projevůmožných chorobných stavů provázejícíchstárnutí

Nahromadění změn zvyšujících riziko smrti

OČEKÁVANÁ DÉLKA ŽIVOTA

Posledních 160 let za každý 1 rok zvýšení o 3 měsíce

V současné době nárůst mírnější a v dalších 50ti letechse bude ještě více zpomalovat (v rozvinutých zemích)

Důvody (Olshansky):

* velký nárůst obezity (civilizační choroby)

* infekční choroby (mikroorganismy rezistentní na antibiotika, globalizace usnadňuje šíření – AIDS, SARS, ptačí chřipka .., snížená imunita: senioři,

chemoterapie)

Pravděpodobná délka dalšího života

Věk 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

zůstává 83 73 63 53 43 34 25 17 10 5,5 let

Dnes člověk ve věku 47 let má velkou pravděpodobnostse dožít dalších 37 let (tj. do věku 84 let)

Za poslední století se délka života zdvojnásobila

„Ženy žijí déle než muži“ (u řady savců)

Vysvětlení je v mitochondriální teorii stárnutí (mitochondrie jsounejvětší zdroj „volných radikálů“)

Mitochodrie ženského pohlaví generují polovinu H2O2

a mají vyšší množství anti-oxidantu, glutathionuEstrogeny se váží na estrogenový receptor, který aktivujesignalizaci MAP-kinasy a NF-B, zvyšující tvorbuanti-oxidantůDále, exprese 16 S mRNA (snižující se stárnutím) zůstávávyšší u žen ve srovnání s mužiOxidační poškození mitochondriální DNA je 4 krát vyšší u mužůOvarektomie odstraňuje tuto „ženskou“ výhodu

Hledají se látky s příznivým účinkem estradiolu, ale bezprojevů feminizace

Proces stárnutí

Úroveň Příčina celý nesouhra organismus v regulacích (nervová, endo- krinní, imunitní) buňka involuce, zánik struktur-funkcí chromosomy “geny stárnutí”

Základní problém je

Mechanismus X Projevy

odlišit

PŘÍČINY

DŮSLEDKY

stárnutí

Mechanismystárnutí

* Změny v DNA (genetické, epigenetické)

* Změny v energe- tickém metabolismu (růstový hormon a IGF-1)

* Oxidační stres

Z hlediska vývojové biologie je stárnutí (ne?)adaptivní proces:

Důsledek redukce energie pro udržování a opravy buněk ve prospěch reprodukce druhu

Identifikovány geny, jejichž mutace pozměňují délku života u různých živočichů; většinou mají vztah k energetickému metabolismu

(kupř. gen pro insulin, IGF 1 a jejich receptory)

Jsou preferovány metabolické dráhy šetřící energii

Stárnutí je strategie navozená přirozenou selekcí šetřit energii spolu s jinými úspornými strategiemi pro zlepšení předprodukčního přežívání potomstva

ZMĚNY na úrovni CHROMOSOMU(alterace DNA)

- Geny (předčasného) zrychleného stárnutí CKN1 ( Cockaynův syndrom typ I) WRN (Wernerův syndrom): potlačuje DNA-replikaci Lamin A (Hutchinson-Gilfordův syndrom -progerie)

Gen KLÓTHÓ (sudička – rozpřádá nit života) Jsou 2 kopie (od matky, od otce), je-li jen 1 > 65 r

- Geny prodlužující život gen ApoA I Milano (reverzní transport cholesterolu)

Mechanismus alterace DNA(ovlivňuje expresi genů)

- Methylace DNA (deoxycytosin→ deoxymethylcytosin

DNA-methyltransferasa

ovlivněny jsou oblasti „CpG-ostrůvky“ – vazebná místa četných transkripčních faktorů na promotorech genů (hlavně „geny ochránci genomu“)

- Demethylace DNA (děje se 2 mechanismy): * inhibice DNA-methylasy (kupř. 5-azacytidinem) * DNA-demethylasová aktivita

+ Methylace snižuje transkripční aktivitu kódujících genů

* Hypomethylace snižuje expresivitu kódujících genů

GERONTOGENY – změna jejich aktivity ovlivňuje stárnutí a dlouhověkost

Tyto geny kódují faktory ovlivňující celé spektrumrůzných buněčných funkcí:• Kontrola metabolismu• Rezistence vůči stresu• Genová dysregulace• Genová stabilita

GENY dlouhověkostiGENY dlouhověkosti u:• Saccharomyces (LAG1, LAC1, RAS1,2, PHB1,2, CDC7, BUD1, RTG2, RPD3, HD1, SIR2,4-42, UTH4, YGL023,SGS1• Caenorhabditis (daf-2, age-1/daf-23, akt-1/akt-2, daf-16,12, ctl-1, old-1, spe-26, clk-1, mev-1) prodloužení života o 30%• Drosophila (sod1, cat1, mth)• Mus (Prop-1, p66)

Geny hrají roli nejen při dlouhověkosti,ale i při udržování zdravíJsou geny predisponující k chorobáma geny chránící zdraví

Gen pro hydroxylaci aromatických sloučenin

(Kuřáci umírající ve 30, bez tohoto genu mohou žít třeba až do 85 let)

Mnohé z „dlouhověkých“ genů řídí hospodaření s energií

Živočichové obvykle mají hlavní úlohu: přivést na svět a vychovatnové pokolení; potom už jejich život nemá valnou cenu pro udržení druhu

Dlouhověcí živočichové bývají zakrslí a neplodní

Hypotéza: Prodloužení života vyvolané úsporou metabolické energie (aktivace „šetřících genů“) a odklonem od rozmnožování může být univerzální mechanismus (platný i pro člověka ?)

Málo živočichů ve volné přírodě se dožije věku, kdy se začnou projevovat známky stárnutí“ (většinou podlehnou dříve přirozeným nepřátelům, úrazům, infekcím, hladu, přírodním zvratům)Pravěcí lidé umírali obvykle na vrcholu svých sil

Teprve s moderní civilizací přišel problém stáří

Replikační stárnutí (mitózové hodiny)určuje kolikrát se buňky mohou dělit (podmíněno krácenímtelomerů (inaktivita telomerázy) → poškození DNA) Hayflickův limit

Známkou jsou ložiska fosforylovaného histonu H2A.X.53BP1 a MRE11.Inhibitory histon-deacetylasy mohou navodit stárnutífibroblastůNadměrná exprese lidské histon-deacetylasy (SIRT1)působí proti stárnutí navozenému PML/p53Závěr: reorganizace struktury chromatinu může být mechanismem provázejícím stárnutí při alteraci expreseurčitých genůMechanismy stárnutí se mohou lišit u různých typů buněk i u různých živočišných druhů

SIGNÁLNÍ DRÁHY vedoucí k STÁRNUTÍ

Dosavadní studie ukazují na směřování k dráze:

* p53-p21(p21CIP21/WAF1) (Exprese p21 je zvýšena při stárnutí sdruženém s replikačním zkracování telomérů) * p16-pRb (Progrese buněčného cyklu je zvětší části kontrolována fosforylací pRb pomocí CDK, což uvolňuje E2F, který navázáním na promotor spouští transkripci genu) Inhibitorem je CIP/KIP (člen p21) a INK4 (člen p16) * Inhibice IGF1 –PI3K/ Akt (pomocí PTEN) (omezuje přežívání, snižuje replikační životnost a brání proliferaci)

ALTERACE PROTEINŮ

Aspartyl-

Asparaginyl-

* deamidace

* isomerizace

* racemizace

poškození proteinů

STÁRNUTÍ

Forma modifikace proteinů(způsobuje změnu biologických vlastností)

• ztráta SH-skupin (vadné poskládání molekuly, funkce, snížení antioxidace, albumin: snížená vazebnost těžkých kovů a sirných aminokyselin)• tvorba dityrosinů (vzniká působením peroxidas hemoproteinů)• adice karbonylových produktů (vazba glyko-oxidovaných postranních řetězců na NH2- lysinu, argininu, prolinu a threoninu)• Fentonova reakce (tvorba hydroxy/ferryl – radikálu)

TVORBA a KUMULACEvedlejších (nežádoucích)produktů metabolismu

Enzymy zajišťují termodynamicky upřednostněné ale kinetickynefavorizované reakce buněčného metabolismu s průvodnítvorbou nežádoucích (toxických) produktů, hromadících se v organismu při stárnutí

A C F

B

D

E AGE (konečnéprodukty pokročilé

glykace)LIPOFUSCIN

VOLNÉ RADIKÁLYEnzymy DNA-oprav

Hlavní teorie stárnutí

•Teorie volných radikálů(reaktivní formy kyslíku) – vedlejší produkt energeticky

výhodnějšího aerobního metabolismu

Stresová teorie stárnutí(selekce genů pro rezistenci vůči stresu umožňujících

maximální využití metabolické energie v období nedostatku)

•Teorie deprivačního syndromu(dostatek příjmu energie dnešního člověka se liší od

podmínek minulých populací – prodlužující se délka života s akumulací genových mutací)

Klasická evoluční teorie stárnutí vysvětluje, proč mortalita stoupá s věkem: jak jedinec stárne, tak klesá jeho fertilitní období (reprodukce); přednost má přežití druhu

Mechanismy (příčiny) stárnutí

Buněčnéstárnutí

Omezená schopnost replikace(vyjma kmenových buněk)

Programovanáztráta genet.mat.(restrikce kodonu)

Ztráta sekvencí DNA pro opa-kované dělení funkčníkapacity vznik inhibitorůproteosyntézy

Nahromaděníběžných omylů

Hromadění běžných mutací běhemtranskripce nebo translace; běžnéchyby v proteosyntéze nakonecporuší funkci buňky

STÁRNUTÍ a OXIDAČNÍ STRES(teorie „volných radikálů“)

Zvýšená zvýšená potřeba energie vícebuněčných organismů si

vynutila přechod anaerobního metabolismu na aerobní

vznik mitochondriíRespirační systém(transport elektronů)

Vedlejší produkt:superoxidy

(ROS)

Antioxidační systém

ROS

EnzymyProteiny

SOD, CAT, GPX, GST, MSH,

RSH-PX GP, Trf,Alb

ferritin

MetabolityVitaminy

A, E, C, KoQbilirubin, urát

Mg, Mn, Zn, Selipoát,karnosin

NAD(P)H

Radiace

ZÁNĚT(neutrofily,makrofágy)

Arginin(NOS)

AutooxidaceElektron

-transport

Polutanty

Oxidasy

(+)

(-) (-)

DNA, RNA

PROTEINYEnzymyLIPIDY

ChybyTranskripce,Translace

Oxid. nukleové kyseliny

AlterovanéPROTEINY (enzymy)

Oxid. modifik.

oxLP

MITOCHONDRIE

Dysfunkcerespiračího řetězce

ROS

ATP2H++ 1/2O2

H2OmtDNA

poškození mtDNA

podjednotky kódovanépoškozenou DNA

podjednotkykódované mtDNA

NAD+

NADH

Podjednotky kódovanénukleární DNA

FADFADH2

Chybný cyklus

EXHALOVANÉ NANOČÁSTICE

Oxidační stres a zánětlivá reakce

ATHEROM ENDOTEL TROMBOCYTY MYOKARD

Progreseaterogeneze

Vaskulárnídysfunkce

Dysfunkcefibrinolýzy

AktivaceAgregace

Poruchyrytmu

Ruptura plátu Vazokonstrice Trombogeneze

Ischemie myokadu a infarkt Arytmie

KARDIOVASKULÁRN Í úmrtí

ROS, RNS

Respirace

Aktivity katalyzovanéoxidací(oxidace v neutrofilech a makrofázích;autooxidace red. NAD/NADP-dehydrogenas flavoproteinů a cytochromů P450)

MODIFIKACE:

DNA, RNA

LIPIDU

PROTEINU- přímá oxidace

- konverze na karbonyl-derivátytj. reakce postr.řetězcůs produkty lipoperoxidace (malondialdehyd) a s pro-dukty oxidované glykace//glykoxidace – dikarbonyly

ALTERACEbuněčných funkcí

Ženy- menopauza (vyhasínání funkce vaječníků)

Muži (po 40 r.)- andropauza (testosteron) – 20 % 60-80 let psycholog. problémy, únavnost, slabost, úbytek svaloviny a kostní hmoty, porucha hematopoeze, oligospermie, sexuální dysfunkce, podrážděnost, úzkost, nespavost, porucha paměti, snížení

kognitivních funkcí - adrenopauza (dehydroepiandrosteron DHEA)

- somatopauza (GH/IGF-1, melatonin)

Klinické projevy stárnutí

SARKOPENIE (úbytek svalové hmoty)

- za každou dekádu o 2,5 až 5,0 kg (úbytek aktivní tělesné hmoty)- zvyšuje se hmota neaktivní

- úbytek o 10 % snížení imunity- snížení výdeje energie (základ rozvoje obezity)- pohybová inaktivita vede k atrofii svalových vláken (znamená to „šlápnutí na klouzačku, z níž je nesnadné vystoupit“)- k oslabování svalu dochází, není-li pravidelně zatěžován na hladině 70 - 90% maxima

OSTEOPORÓZA (úbytek kostního minerálu) Postmenopauzová (nedostatek estrogenů potlačení životnosti osteocytů, nedostetečná odpověď osteoblastů na mechanické podněty a opravy mikropoškození při stárnutí)

• Senilní (převaha osteoresorpce nad osteoprodukcí) Potenciace osteoklastogeneze (změna v interakci mezi RANKL-RANK-osteoprotegerin) Tvorba kosti vyžaduje: (1) osteoinduktivní signály, (2) schopnost buněk reagovat na signály Morfogenní proteiny a nadrodina TGF Osteoresorpci potlačuje: kalcitonin (inhibuje osteoklasty, ale nepotlačuje tvorbu kolagenu osteoblasty)

aminobisfosfonáty snižují kostní remodelaci potlačením a apoptózou osteoklastů

raloxifen (agonista estrogenů)

Stárnutí EPIDERMIS (POKOŽKA)Morfologie: oploštění dermis-epidermálních spojeníFAS/FASL-apoptóza: ztenčování epidermis, poklesproliferace a nárůst apoptózy buněk pod granulární vrstvou

Stárnutí vlasůCyklická rekonstrukce intaktní jednotky pigmentového vlasového váčku je shodná na celé vlasové pokrývce, a to v prvních 10ti vlasových cyklech tj. asi do 40 let věku

Pak se nastává geneticky regulované vyčerpávání pigmentové potence jednotlivých foliklů a tvorba šedivých až bílých vlasů; ůbytek pigmentu navozuje nejprve snížení aktivity tyrosinasy v melanocytech vlasového bulbu, po té suboptimální interakce mezi kortikálními keratocyty a melanocyty a defektní migrace melanocytů z rezervoárů v horních vrstvách kořínků do pigmentovaných oblastí rozruší normální funkci

celé vlasové jednotky. Významnou roli hraje zvýšení ROS a snížení anti-ROS potenciálu s poškozováním nukleární a mitochondriální DNA

Stáří není nemoc

(ale nebývá bez nemocí)

Choroby přibývající s věkem* Alzheimer. ch.* Ateroskleróza ICHS, AMI,mrtvice nefropatie

* Nádory* Katarakty* Diabetes typ 2* Osteoporóza* Parkinson

*Hyperparatyreóza*Hypotyreóza*Poruchy imunity*Monoklonální gamapatie*Mnohočetný myelom*Degenerace makuly

Jejich přítomnost ovlivňuje hodnoty biochemických testů

Alzheimerova chorobaneurodegenerativní onemocněnístarších jedinců s progresivní ztrátoupaměti a demencí

Depozity peptidu amyloidu (A) v senilních plátech a mozkových cévách tvorbaneurofibrilárních smotků a zánik neuronůMutace: APP-gen (chromosom 21) Presenilin 1 (PS-1) gen, presenilin 2 (PS-2)Riziko: 4 ApoE, LDL-receptor related protein, CYP2D6

Proteinový prekursor -amyloidu-sekretasa-sekretasa

(770 aminokyselin)(17 a,k.-sign.peptid)

Alzheimerova choroba

sAPP sAPP + +

C83 C99

sekretasa

A

A

Proteinový prekursor -amyloidu

-sekretasa-sekretasa-sekretasa

(695 aminokyselin)

A(40) A(42/43)(normální) (senilní pláty)

Mechanismus poškození neuronůu Alzheimerovy choroby

ROS

NO

TNFTGFbFGFcytokin

astrocyt

nervová buňkazaniklá buňka

apoptóza

mikroglie/makrofág(v klidu)

fibrilárníA

aktiv. mikroglie

SR-RAGE

GluTrans

Glutamát(exotoxi-cita)

GENETICKÉ MARKERY Alzheim. chor. (prokázány pouze u 1% pacientů s předčasným výskytem, mezi 40. - 50. roky)

* PRESENILIN 1 - gen (na chromosomu 14) Produkt genu: Protein PS-1 nalezen u rodin s časným výskytem; nejméně 35 mutací* PRESENILIN 2 - gen (zatím 2 mutace) PS-1 a PS-2 jsou homologní polytopní membránové proteiny endoplasmat. retikula* APP - gen (na chromosomu 21) Mutace genu pro prekurzorový protein B-amyloidu,

exprese též u Downova syndromu

Parkinsonova choroba

Neurodegenerativní onemocnění (motorický neuron; neuro-melanin obsahujicí neurony mozkového kmene; pars compacta substancia nigra; 80 % ztrátastriátového dopaminu) klin. projevyakineze, rigidita, klidový třes

Multifaktoriální příčina s genetickou predispozicí,toxiny okolní i endogenní (1-methyl-4-fenyl-1,2,3.6

-tetrahydropyridin, -synuklein) a faktory stárnutí,deplece GDNF (neurotrofní faktor z gliových buněk)

(oxidační stres; substancia nigra má málo antioxidantů, hlavně glutathionu) apoptóza dopaminergních neuronů)

MPTP

MPP+

dopamin5-OHDA

Jiné toxiny:synuklein

(1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetra-hydropteridin)

(1-methyl-4-fenyl-pyridinium)

toxin

Respiračnířetězec

Inhibicekomplexu I

Vzestup ROS/pokles ATP

Vzestupaktivity Cy C

Vzestupintracel. Ca2+

APOPTÓZA

Zvýšení ROS

Oxidační stres

LipoperoxidacePoškození DNA

MAOO2

*- H2O2

mitochonfrie

ZDRAVÉ STÁRNUTÍ(anti-aging)

HORMESIS

Bifázická odpověď na velikost dávky určitého agens

- Nízká dávka působí stimulačně (příznivý efekt)

- Vysoká dávka je toxická, inhibiční (nepříznivý efekt)

Hormesis – základní princip evoluční teorie

Navozuje rezistenci živých organismů vůči škodlivinám

„Co tě nezabije, to tě posílí“

dávka

účinek

příznivý

nepříznivý

HORMETICKÉFAKTORY

BUNĚČNÝ STRES,SIGNALIZACE

HORMETICKÉEFEKTY

AntioxidantySuperoxiddismutasa

KatalasaGlutathionperoxidasa

Životní stylPohybRestrikce energieStravaMentální cvičení

Expozice zevních škodlivintoxiny, radiaceteplotavoda

Expozice vnitřníchfaktorůIschemieEndokrinní faktoryneurotransmitery

Volné radikályTok iontů

Deplece energie

ReceptoryKinázy, fosfatázy

deacetylázy

Transkripční faktoryNrf-2

FOXO, CREBNF-B

Proteinové chaperonyHSP-70GRP-78

Růstové faktoryBDNF, VEGF

bFGFMitochodr.proteiny

Ca-reg. faktory

Mírný krátkodobýstres

Stresová odpověď

Aktivace HSF

Exprese genů prostresovou odpověď

Tvorba proteinů teplotníhoŠoku (HSP)

Signalizace mechanismů údržbya opravy buněk

Mírný stres(přechodný)

Gymnastikacév

Gymnastikamozku

Přiměřená, chutnávýživa (antioxidanty)

Přiměřenýpohyb

Exprese genů prorezistenci stresuRůstové faktory

Antioxidační enzymyFaktory proti

stárnutí

Rezistence:Kardiovaskulární choroby

NeurodegeneraceIDefekty imunity

Insuficience pohybovéhoaparátu

RezistenceDiabetes,

Ateroskleróza,Předčasné

StárnutíChoroby spojené

se stářím

„Těšit se ze života,ale neškodit

jinému životu“

Děkuji za pozornosta

Vaši účast na tomto setkání

jaromasopust@seznam.cz