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 ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

 APLICACIONESS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

 Presentado a la cátedra de Ato!at"#ac"$n e Instr!entac"$n en el La%orator"o Cl&n"co ' Anato!&a

Presentado a la cátedra de *"olo(&a General 

 Docente+ L"c) Ed(ar C'%a!%a Pere# 

 Presentado ,or+

 MOS-UERA *ERROSPI. Jessa Selene)

 Se!estre+ IV  Trno+ Tarde

 /anca'o 0 Per1

2344

5A6o delCentenar"o de Mac7 P"cc7 ,ara el Mndo)8 

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

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INTRODUCCIÓN

En el presente trabajo monográfico se habla sobre el tema de Citometría de flujo,

en primer lugar su concepto, seguido de la instrumentación y por ultimo su

aplicación en el laboratorio clínico.

La Citometría de flujo es método de análisis por el cual podremos saber 

características tanto físicas como químicas de una célula o partícula.

OBJETIVOS

o eterminar subpoblaciones linfocitarias

o !nmunofenotipicacion de leucemias y linfomas

1. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

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La utilidad de la citometría de flujo se fundamenta en que en relación con

otras metodologías, aporta una gran sensibilidad, objeti"idad, rapide# y

"ersatilidad analítica al estudio de la célula, lo que permite su aplicación en

áreas di"ersas como la detección y cuantificación de células tumorales, la

monitori#ación de diferentes procedimientos terapéuticos, la cuantificación de

ácidos nucleicos, el análisis de cromosomas, la detección y cuantificación de

antígenos, el estudio del contenido protéico, de la producción celular de

radicales de o$ígeno, del potencial de membrana, de las mitocondrias, el

análisis de los cambios intracitoplasmáticos de determinados iones como el

Ca%% y del p&, la separación física de células y cromosomas, entre otros. 'or 

todo ello, en su desarrollo la citometría de flujo ha "enido a proporcionar una

información objeti"a que complementa la obtenida con otras técnicas

diagnósticas en áreas tan diferentes de la (edicina como la !nmunología, la

&ematología, la )enética (édica, la *ioquímica Clínica, la +isiología, la

 natomía 'atológica, la -ncología, la (icrobiología o la propia (edicina

!nterna.

  continuación re"isaremos las aplicaciones más utili#adas de la citometría de

flujo en el diagnóstico clínico como son la determinación de antígenos

celulares y la cuantificación de ácidos nucleicos. o obstante, comentaremos

también otras aplicaciones que aunque por el momento son e$perimentales,

como el cariotipo de flujo, son prometedoras de cara a su utili#ación futura en

esta área de la (edicina.

1.1. RESUMEN DE APLICACIONES DE LA CITOMETRO DE FLUJO !(/-L-)!

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'0-L-)! 0&1'L0E1 +&(C-L-)! *!-L-)! 2E(0-L-)! 0-3!C-L-)! (!C&-*!-L-)! '&1!0-L-)! C!0-)EE0!C 4!&-L-)!

• 2E(0-L-)5 6 tipificación y conteo de células , reticulocitos y

análisis de medula ósea .

• +&(C-L-)5 6estudios de cinética celular 

• !(/-L-)5 6subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular 

• -C-L-)5 6iagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos

• (!C&-*!-L-)5 6diagnostico bacteriano y "írico ,estudios de

sensibilidad a los antibióticos

• )E70!C6 Cariotipo y diagnóstico de portador y diagnóstico

prenatal.

2. PARAMETROS SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO

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8. 'L!CC!-E1 E L C!0-(E0&! E +L/9-:'L!CC!-E1

)EE≤ iagnostico basado en el análisis celular 'ronostico basado en el análisis celular 

E"aluación y monitori#ación de tratamiento  nálisis de la lesión y muerte celular 

4.  'L!CC! C&C0E&!?C!- E CEL/L1 -&(LE1

@ '&(E0&-1 E10&/C0/&LE16

@ 0amaAo

 @ Complejidad

B. 0!)E-1 E 1/'E&+!C!E6El propósito del sistema de fluidos es transportar las partículas en una

corriente fluida hasta el rayo láser para su interrogación.

El sistema de fluidos posee un capilar a tra"és del cual se hace pasar unlíquido isotónico, a manera de una funda, con una "elocidad y presión

constante estas características son necesarias para la formación de un flujo

laminar :sin turbulencia;. La presión de muestra y la muestra del fluido de la

funda son diferentes. La presión de la muestra es mayor que la presión del

fluido de la funda.

Este enfoque hidrodinámico se asegura de que las células permane#can

centradas y "iajen una tras otra en el chorro de inyección. Este confinamiento

es necesario para hacer mediciones precisas, es decir para el análisis

indi"idual de las células.

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D. 1istema ópticoD.. 'ropiedades de la lu# dispersada

El desparramamiento ligero ocurre cuando una partícula des"ía lu# del

láser de incidente. La e$tensión para la cual esto ocurre depende de

las propiedades físicas de una partícula,a saber su tamaAo y su

complejidad interna.Los factores que hacen que la lu# se disperse son

la membrana de la célula,el nFcleo,y cualquier material granular dentro

de la célula.La forma de la célula y la topografía de la superficie

también contribuyen a la dispersión ligera total.

La lu# de dispersión acometedora :+1C; es proporcional para el área

de la superficie de la célula o el tamaAo.+1C es una medida que en su

mayor parte es lu# difractada :menor de GH; y es detectado por un

sensor. +1C pro"ee un método adecuado de partículas que detecta

mayores que un tamaAo dado independiente de su fluorescencia.1ideIscatter :11C; es proporcional a la granularidad de la célula o

complejidad interna. 11C es una medida de en su mayor parte es lu#

refractada y reflejada y ocurre en cualquier interfa# dentro de la célula

donde hay un cambio en índice refracti"o.11C es cobrado en

apro$imadamente JG grados perpendicular al rayo láser por una lente

de colección.

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D.K. +luorescencia

/n compuesto fluorescente amortigua energía ligera sobre un rango de

longitudes de onda que es característica para ese compuesto.Esta

absorción de lu# causa que un electrón en el compuesto fluorescente

sea le"antado en un ni"el de energía superior.El electrón e$citado

rápidamente se corrompe para su condición esmerilada,emitiendo la

energía e$cedente como un fotón de lu#.Esta transición de energía es

llamada fluorescencia. 'ara que se de la fluorescencia se tiene que

unir con anticuerpos a las células con fluorocromos.

El rango sobre el cual un compuesto fluorescente puede estar e$citado

es llamado su espectro de absorción. medida que más la energía es

consumida en la absorción este efectFa una transición que es emitido

en transiciones fluorescentes,las longitudes de onda emitidas serán

más largas que esas amortiguadas.El rango de longitudes de onda

emitidas para un compuesto particular es llamado su espectro de la

emisión.

El láser del ion del argón es comFnmente usado en Citometría de flujo

porque la lu# es de MMInm. El nanómetro que emite e$cita más al

fluorocromo./no de estos fluorocromos es !sotiocianato de

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fluorescencia:+!0C;.En el espectro de absorción de +!0C la línea MMI

nm está pró$ima al má$imo de absorción +!0C. La e$citación con esta

longitud de onda resultará en una emisión alta +!0C. 1i el fluorocromo

estu"iera e$citado por otra longitud de onda dentro de su espectro de

absorción, la emisión luminosa del mismo espectro ocurriría sino no

sería de la misma intensidad.

(ás que un fluorocromo pueden ser usados simultáneamente si cada

uno le entusiasma en MM nm y si las longitudes de onda culminantes

de la emisión no están sumamente pró$imas a cada quien.La

combinación de +!0C y +icoeritrina :'E; satisface estos

criterios.unque la absorción má$ima de 'E no está en casa de MM

nm,el fluorocromo es lo suficientemente e$citado en esta longitud de

onda para pro"eer emisión adecuada de la fluorescencia para la

detección.(ás importantes,la longitud de onda culminante de la

emisión son =8G nm para +!0C y =DG nm para 'E.

Estas longitudes de onda culminantes de la emisión son lo

suficientemente lejanas aparte a fin de que cada seAal pueda ser 

detectada por un detector separado.La cantidad de seAal fluorescente

detectada es proporcional para el nFmero de moléculas del fluorocromo

en la partícula

7.3. 1istema ópt!"

La fluorescencia y la lu# dispersada se producen cuando una célula

contenida en el líquido inyectado pasa por el rayo enfocado de un láser.

La lu# dispersada hacia el frente es colectada por un detector que

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capta la lu# difractada entre y GH arriba o abajo del punto de

incidencia del láser. La lu# dispersada lateralmente y la fluorescencia

son colectadas por un lente que está a JGH del eje de incidencia del

láser. Esta lu# lateral y la fluorescencia son di"ididas por un

NbeamsplitterO :i"isor del rayo; para separar entre la lu# difractada y la

fluorescencia. La fluorescencia es a su "e# di"idida por un espejo

dicróicoque permite distinguir entre diferentes longitudes de onda.

Cada detector de fluorescencia tiene otros filtros ópticos para e$cluir la

lu# del láser dispersada y para dejar pasar la lu# con la longitud de

onda deseada para ese detector.

+!L0&-1 -'0!C-16 1on aquellos que seleccionan las longitudes de

onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser6

E !0E&+E&EC! :icroicos que reflejan las long de onda no

deseadas;

 E *1-&C!- :absorben las long de ondas no deseadas;. e

éstos hay tres tipos6

P+iltros *and 'ass6 ejan pasar un rango de longitudes de onda :'or 

ej6 BKG Q BG nm;

P+iltros 1hort 'ass6 ejan pasar por debajo de una longitud de onda

determinada :'or ej6 R =D= nm;

P+iltros Long 'ass6 ejan pasar por encima de una longitud de onda

determinada :'or6 ej6 S =KG nm;

7.4. L# $%t%!!ó& $% '# (%)#'

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Las seAales ligeras son generadas cuando las partículas atra"iesen el

rayo láser en una corriente fluida.

  estas seAales ligeras les es con"ertido a seAales electrónicas :los"oltajes; por fotodetectores y entonces asignado un nFmero del canal

en un complot de datos.2ay dos tipos de fotodetectores en un

citometro de flujo6Los tubos fotomultiplicador :'(0s; y los fotodiodos.El

fotodiodo es menos sensiti"o para iluminar seAales que los '(0s y así

se usa para detectar al más fuerte el +1C.Los '(0s se usan para

detectar las seAales más débiles generadas por 11C y

fluorescencia./n pulso de "oltaje es creado cuando una partícula entra

en el rayo láser y principios dispersar con poco equipaje o ser 

fluorescente./na "e# que la lu# hace seAales,o fotones,golpeen un

lado del '(0 o el fotodiodo,se con"ierten en un nFmero proporcional

de electrones que son multiplicados,creando una corriente eléctrica

mayor.La corriente eléctrica "iaja para el amplificador y es con"ertida a

un pulso de "oltaje

El tamaAo del pulso de "oltaje depende del nFmero de fotones

detectados, la ganancia '(0 de "oltaje o del preamplificador, yla

ganancia del amplificador. Las seAales pueden ser amplificadas

ejerciendo un "oltaje para los '(0s,así creando una corriente eléctrica

mayor,o aumentando la ganancia de amplificación.Los trasfondos del

amplificador pueden ser lineales o logarítmicos :Lin o Log;.La

amplificación del leAo se usa a menudo para separar negati"a

deseAales positi"as oscuras (ientras que la amplificación lineal se use

a menudo para amplificar dispersión y parámetros fluorescentes.

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7.*. L# %'%!t+ó&!#

/na "e# las seAales ligeras han sido con"ertidas a pulsos electrónicos

una computadora adquiere los datos proporcionados y hace un

representación grafica. La computadora produce un histograma o un

despliegue de dos parámetros :dotplot o contourplot; a partir de la lu#

dispersada por las células o a partir de la fluorescencia. El análisis de

los datos generalmente se complica porque el "olumen de la muestrapuede ser "ariable y por la complejidad de ésta, por lo que es esencial

que la forma de interpretación se diseAe específicamente para

contestar a las preguntas que se formularon en la in"estigación.

,.  'L!CC!

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-ncología6 diagnóstico y pronostico, monitores de tratamiento (icrobiología6 diagnostico bacteriano y "írico, estudios de sensibilidad a

los antibióticos. )enética6 cariotipo y diagnóstico de portador y diagnostico preInatal

CONCLUSIONES-

• La Citometría de flujo es método multiparametrico por el cual

sabremos características de una célula o partícula• La Citometría de flujo es usada en "arios campos de laboratorio por 

su gran utilidad

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BIBLIORAFÍA

&e"ista del instituto nacional de enfermedades respiratorias6

 rticulo Citometría de flujo6 "ínculo entre la in"estigación básica y la aplicación

clínica

4olumen D Q numero I eneroImar#o KGG

I&t+"$/!t"& t" F'"0 Ct"%t+-  Learning )uide I (anual 'art umber6

IG8KIG

 pril, KGGG

/!4E&1! C!-L /0