SPECIÁLNÍ METODY PŘI ZPRACOVÁNÍ A BARVENÍ

TVRDÝCH TKÁNÍ

Nezhybová E., Kašpárková E., Machalová B., Wagner F.

Ústav histologie a embryologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci

Úvod

tvrdé tkáně představují pro běžná histologická vyšetření komplikaci s ohledem na nutnost demineralizace tkáně

k tomuto účelu slouží zředěné kyseliny, které přeměňují nerozpustné soli v soli rozpustné ve vodě

k zachování struktury a použitelnosti tkáně je nutné přesně dodržovat správné postupy

Cíle práce

cílem naší práce bylo srovnat některé demineralizační postupy, poskytnout přehled speciálních barvení využitelných pro tvrdé tkáně a stanovit možnosti imunohistochemických vyšetření na tvrdých tkáních, které byly demineralizovány

Materiál a metodika jako materiálu jsme použili dospělých lidských

zubů a kostí k dekalcifikaci jsme používali:

• elektrolytické odvápňování

• chelaton III

• Löwyho roztok jako barvících postupů jsme používali H.E.,

Schmorlovu reakci, azan, zelený trichrom, PAS a Saturnovou červeň

dále jsme prováděli imunohistochemické reakce

Dekalcifikace (1)

doba se řídí velikostí bločku a typem dekalcifikační tekutiny

stupeň odvápnění určujeme vbodnutím jehly nebo chemicky /k 5 ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápňované tkáně se přidá 5 ml 5% roztoku hydroxidu amonného a 5 ml 5% roztoku šťavelanu vápenatého/

Základní pravidla demineralizace

tkáň musí být dobře fixována, jinak dochází k poškození tkáně (bobtnání)

důkladné vyprání tkáně po fixaci ve vodě nebo etanolu

odvápnění musí být rychlé /dostatečné množství dekalcifikační tekutiny, pravidelné vyměňování/

po odvápnění nutné dokonale vyprat tkáň od dekalcifikační tekutiny /nikdy nesmí ovšem přijít tkáň z dekalcifikačního roztoku do vody/

Dekalcifikace (2)

elektrolytické odvápnění• kyselina mravenčí, kyselina chlorovodíková,

destilovaná voda

chelaton III• kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA)

Löwyho roztok• 40% formaldehyd, chlorid rtuťnatý, ledová kyselina

octová, destilovaná voda

Barvení tkáně

hematoxylin – eosin (HE) Schmorlova reakce Saturnová červeň zelený trichrom azan PAS

substrát (DAB)

I. protilátka

buněčný antigen

II. protilátka SA-P

Nepřímá třístupňová imunohistochemická reakce, při které jsme použili primární protilátky proti kolagenu a Ab-1 (na makrofágy)

Imunohistochemie

Výsledky - dekalcifikace

nejkratší dobu trvání má dekalcifikace v Löwyho roztoku (cca 20 hodin), který je současně fixační tekutinou a výsledná barvení neovlivňuje, současně je vhodný i pro imunohistochemické zpracování tvrdé tkáně

elektrolytické odvápnění je rovněž účinné, trvá několik dní a není k tvrdé tkáni příliš šetrné

EDTA trvá několik měsíců, ale je nejšetrnější, dosáhnout zkrácení doby odvápnění lze přidáním 2% kyseliny mravenčí, poté je nutné tkáň vyprat v 5% roztoku formaldehydu

Zub – hematoxylin/eosin

Zub – Schmorlova reakce

Zub - azan

Zub – Goldnerův zelený trichrom

Zub - PAS

Zub – Saturnová červeň

Zub – ukázka imunohistochemie

Závěry (1)

použití různých typů dekalcifikačních tekutin ovlivňuje délku demineralizace

Löwyho tekutina usnadňuje postup, protože je současně i tekutinou fixační, jde o postup z hlediska odvápnění nejkratší a dostatečně šetrný

chelaton III (EDTA) je postup dlouhý a pro rutinní laboratoř nevhodný

Závěry (2)

při barvení tvrdých tkání lze použít různých speciálních postupů, které poskytují specifické výsledky a umožňují zobrazit potřebné jednotlivé struktury

při šetrné dekalcifikaci lze na odvápněné tkáni úspěšně provádět imunohistochemická vyšetření, je ale třeba zvolit vhodný dekalcifikační prostředek

Děkujeme za pozornost