Světelná a fluorescenční mikroskopie

Teorie: Světelný mikroskop Základem optického mikroskopu jsou dvě soustavy čoček objektiv a okulár

(mechanická část spojující objektiv s okulárem se nazývá tubus).

Z hlediska kvality zobrazení je nejvýznamnější čočkou optické soustavy mikroskopu

objektiv , vytvářející skutečný, zvětšený a převrácený obraz. Obraz vytvořený objektivem

je pak pozorován okulárem jako lupou a výsledkem je zvětšený, převrácený a neskutečný

obraz. Mikroskop tedy zobrazuje dvoustupňově. Nejprve objektiv vytvoří obraz předmětu

v horní ohniskové rovině objektivu a následně tento obraz zvětšuje okulár. Zvětšený obraz je

pak registrován oční sítnicí (nebo kamerou).

Dokonalé osvětlení zorného pole mikroskopu je umožněno další optickou soustavou,

kondenzorem, který soustřeďuje světelné paprsky do místa, kde se nachází pozorovaný

objekt.

objektivy

Mechanická konstrukce uspořádání mikroskopu je ovlivněna především typem vzorku,

pro který je mikroskop určen a způsobem jeho osvětlení. Kromě klasických typů mikroskopů,

jak je naznačeno na obrázku 1 vlevo se vyrábějí také invertované typy mikroskopů, viz

obrázek 1 vpravo, který mají revolverový stolek s objektivy pod vzorkem. Využívá se jich

hlavně k pozorování biologických vzorků, především buněčných kultur, které jsou

adherované na dně kultiva ční misky.

Kvalitu zobrazení mikroskopických objektů charakterizují tyto parametry: zvětšení,

rozlišovací schopnost mikroskopu a obrazový kontrast.

Zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru. Maximální

zvětšení dosažitelné nejlepšími objektivy, které by bylo užitečné při vizuálním pozorování,

je 500x až 1000x. Zvětšíme-li pomocí silnějšího okuláru obraz nad tuto mez, získáme jen

prázdné zvětšení – to jest větší obraz bez jakýchkoli nových detailů.

Důležitým pojmem je rozlišovací schopnost, která má v mikroskopii větší význam

než zvětšení. Jedná se o vzdálenost dvou ještě rozlišitelných bodů. Potřebné výpočty pro

rozlišovací mez mikroskopu provedl a prakticky uplatnil průkopník mikroskopie – německý

fyzik Ernst Karl Abbe (1840 – 1905). Dospěl k výrazu: µ

λδsin⋅

=n

, kde λ je vlnová délka

použitého světla, n je index lomu prostředí mezi objektivem a krycím sklíčkem preparátu a µ

je poloviční otvorový úhel (polovina úhlu 2µ, který svírají protilehlé krajní paprsky

vycházející z předmětového bodu na optické ose mikroskopu a vstupují ještě do objektivu),

viz obr. Otvorový úhel objektivu.

objektivy

okulár

Otvorový úhel objektivu

Charakteristická hodnota numerické apertury daná konstrukcí objektivu

Rozlišovací schopnost objektivu je vyjádřena jeho numerickou (číselnou)

aperturou (NA), jejíž výpočet byl uveden výše ve jmenovateli Abbeho vztahu

(NA = n ⋅ sinµ).

Číselná apertura objektivu má velký praktický význam. Určuje rozlišovací

schopnost a hranice užitečného zvětšení, ovlivňuje světelnost mikroskopického obrazu

a hloubku ostrosti (snížením NA se zvětšuje tloušťka zobrazené vrstvy preparátu). Hloubkou

ostrosti se rozumí tloušťka vrstvy preparátu (výška předmětového pole), ve které se nalézají

zobrazené objekty. Ty objekty, které leží nad a pod touto vrstvou, jsou zobrazeny neostře

nebo vůbec. S rostoucí aperturou objektivu se hloubka ostrosti zmenšuje. Pokud chceme

zobrazit detaily a nečistoty ležící nad a pod objektem, zvětšíme hloubku ostrosti přicloněním,

dojde ale ke snížení kvality obrazu.

Při vizuálním pozorování a s nejkvalitnějšími objektivy je rozlišovací schopnost optických

mikroskopů mírně lepší než polovina vlnové délky použitého světla. Samotná vynikající

rozlišovací schopnost objektivu však ještě nezaručuje, že teoreticky rozlišitelné strukturní

detaily v mikroskopickém obrazu skutečně uvidíme. Můžeme je spatřit jen tehdy, existuje-

li dostatečný rozdíl jasu mezi nimi a jejich okolím.

Proč fázový kontrast?

Běžným světelným mikroskopem se zobrazují struktury, které se liší absorbcí

viditelného světla. Jestliže světlo procházející objektem mění svou vlnovou délku

a amplitudu, rozeznáváme to jako rozdíly v barvě objektu a v intenzitě světla. Takové

vlastnosti mají zabarvené objekty (např. histologické preparáty) a označují se jako

amplitudové objekty.

Druhým typem jsou fázové objekty, které jsou bezbarvé a nemění amplitudu světla.

Absorpce světla pozorované struktury se od svého okolí (růstového média) liší jen v místech

s rozdílnou optickou hustotou - nepatrnou změnou indexu lomu. Při průchodu světla

biologickými objekty nastane pouze posunutí fáze světelné vlny a proto struktury nemají

dostatečný kontrast pro zobrazení v běžném světelném mikroskopu. Malé fázové rozdíly

však naše oko nerozezná, je citlivé jen na barvy viditelného spektra nebo na změnu

intenzity (amplitudy) světla a proto se nám tyto objekty jeví průhledné a bezstrukturní.

Aby došlo ke změně amplitudy procházejícího vlnění skrz vzorek a tím ke zvýšení

kontrastu, můžeme ho obarvit. Mnoho biologických objektů patří právě mezi fázové objekty

a bez barvení jsou v běžném optickém mikroskopu špatně pozorovatelné. Přítomnost barviva

přitom představuje mnohdy vážný zásah do činnosti buňky, která může být takto i usmrcena.

Fázově kontrastní mikroskopy umožňují pozorování bezbarvých živých objektů v nativním

stavu bez jakéhokoliv barvení .

Fázový kontrast je tedy vhodnou metodou pro pozorování živých buněčných linií.

Přeměňuje neviditelné fázové rozdíly vlnění, vzniklé po průchodu fázovým objektem,

na změnu intenzity světla, které rozeznáváme.

Obr. : A) zobrazení fibroblastu ve světlém poli (běžným optickým mikroskopem),

B) zobrazení fibroblastu optickým mikroskopem s fázovým kontrastem

Činnost fázově kontrastního mikroskopu si můžeme představit takto:

Mikroskop s fázovým kontrastem je vybaven fázovým objektivem a fázovým

kondenzorem, v nichž se vyskytují prstenčité clony, které si velikostí odpovídají. Obě clony

se seřídí, aby se jejich obrazy v zorném poli přesně překrývaly.

Objektiv modifikovaný pro fázový kontrast

Do optického systému kondenzoru (do místa jeho přední ohniskové roviny) je

umístěna kruhová clona se zatemněným středem – světlo prochází jen úzkým mezikružím.

Vzniká dutý kužel přímého světla, oddělený od světla difraktovaného – dochází k separaci

vlnění.

Následně světelné paprsky projdou vzorkem. Na fázových objektech nastane

odchýlení a zpomalení některých paprsků z původního směru (ohybem, rozptylem či lomem),

což je způsobeno indexem lomu a tloušťkou preparátu.

fázová destička

Schéma optické soustavy mikroskopu pro fázový kontrast

Kontrast amplitudových objektů je způsoben interferencí přímého

a difraktovaného světla posunutého o ½ vlnové délky. Při pozorování fázového objektu

dochází ke zpomalení pouze o ¼ vlnové délky a po interferenci s přímým světlem

nedochází ke snížení intenzity světla - ke vzniku dostatečného kontrastu. To znamená,

že při zobrazování fázových objektů musíme posunout přímé světlo o ¼ , abychom dosáhli

rozdílu vlnových délek ½, jako je tomu při pozorování amplitudových objektů. K tomuto

posunu slouží fázové destičky (jedna v objektivu, druhá v kondenzoru). Obraz je nakonec

vytvořen interferencí paprsků fázově posunutých (o ½ vlnové délky) a světla

průchozího.

Jsou-li fázově posunuty paprsky se změněným směrem šíření (difraktované),

dojde k destruktivní interferenci a fázové objekty se jeví jako tmavší vůči svému pozadí -

hovoříme o pozitivním fázovém kontrastu. Jsou-li posunuty paprsky nevychýlené

(průchozí) ze svého směru, vznikne konstruktivní interference, detaily vzorku jsou světlé

na tmavém pozadí a hovoříme o negativním fázovém kontrastu.

Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie využívají schopnosti některých látek emitovat viditelné

světlo po ozáření světlem o kratší vlnové délce. Většinou se využívá ultrafialového záření

a přilehlé oblasti viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami, rtuťovými

výbojkami, lasery, nebo LED diodami. Ze světelného zdroje (např. rtuťové výbojky) je

tedy emitováno světlo o krátké vlnové délce (UV), excitační filtr propustí paprsky jen

s vybranou vlnovou délkou, které pokračují na dichroické zrcadlo a z něho jsou odraženy

směrem ke vzorku. Po interakci světla s barvivem se emituje záření o delší vlnové délce,

než byla vlnová délka dopadajícího záření, excitovaného ze světelného zdroje. Toto

záření zachytí objektiv a následně bariérový filtr, který zajistí výstup záření jen

o určité vlnové délce.

Schéma - dopad světla na vzorek a vznik fluorescenčního zářeni

Konstrukce fluorescenčního mikroskopu

Excitace elektronu v molekule barviva a následná fluorescence

Příklad:

Máme bezbarvý vzorek (adherované buňky) a potřebuji zjistit jejich počet a viabilitu (zda

jsou živé). Obarvím buňky barvivem (např. kalceinem, který zabarví pouze živé buňky).

Abychom viděli fluorescenční obraz (viz. snímek), musíme vědět, jakým světlem (vln.

délkou) musíme na vzorek posvítit – to je vždy uvedené na příbalovém letáku zakoupené

barvičky. Pro kalcein je to světlo o vlnové délce 494 nm (tj. excitační vlnová délka).

Ze zdroje vyjde záření o všech vln. délkách, ale excitační filtr na vzorek propustí jen

paprsky námi požadované vlnové délky (494 nm). Toto záření interaguje se vzorkem

(excitují se elektrony molekuly barviva (kalceinu) a při návratu elektronů

na základní energetickou hladinu dojde k vyzáření (k emitaci) světla o delší vlnové délce

(princip fluorescence)). Vlnová délka emitovaného záření je u kalceinu 517 nm (zelená oblast

spektra). Aby do okuláru vstupovaly pouze tyto paprsky a už žádné zbytkové UV záření,

které se vzorkem neinteragovalo, je mikroskop vybaven ještě bariérovým filtrem, který

propustí jen zelenou barvu.

Zeleně svítící kalcein, který obarvil buněčnou membránu živých buněk Některé složky živé hmoty vykazují autofluorescenci, například aminokyselina

tryptofan i jiné látky s aromatickým jádrem či heterocyklem. Většinou jsou však k preparátům

přidávána speciální fluorescenční barviva schopná specifické interakce s různými buněčnými

strukturami. V některých případech je fluorescenční barvivo (fluorochrom) navázáno na

protilátku specifickou pro některou z bílkovin přítomných v cytoplasmě. V takovém případě

lze selektivně zviditelnit například složky cytoskeletu, chromatin, membránové bílkoviny

apod.

Laboratorní část: A) Pasážování buněk 1) Zahřejte zmražený trypsin na 37°C 2) Vyndejte kultivační destičku z inkubátoru a po otření desinfekcí umístněte do flow boxu 3) Z jamek určených pro pasážování buněk odeberte všechno médium (500 µl) a jamku promyjte PBS (300 µl) 4) Do všech jamek, které pasážujete, napipetujte nejprve prvních 70 µl trypsinu a následně druhých 70 µl. Zavřete kultivační destičku a nechte ve flow boxu 8 min v klidu (vhodné občasné míchání – plynulým pohybem destičky rukou) 5) Do každé jamky přidejte 350 µl média, pomalu rozsuspenzujte a napipetujte všechen objem do připravené ependorfky 6) Centrifugujte 3 min na 6000 otáček 7) Zkontrolujte množství vzniklého peletu a nařeďte na vhodný objem (po konzultaci s asistentem praktik) 8) Rozpasážujte objem do odpovídajících nových jamek a vložte do inkubátoru

Buňka, která se začíná adherovat na dno kultivační jamky

Buňka, která není přichycená ke dnu, má zakulacený tvar

Buňky 3 hod po tryspinizaci Buňky adherované, 100% konfluence

Mrtvé buňky – kulaté, protože se

deadherovaly ode dna

B) Značení buněk fluorochromem 1) Z jamky odeberte všechno médium a napipetujte tam 200 µl nového. Přidejte 2 µl zásobního roztoku kalceinu a opětovným nasátím do pipety rozmíchejte. Vložte do inkubátoru na 10 minut. 2) Odeberte všechno médium obsahující kalcein, promyjte v 500 µl nového média a přidejte opět nových 500 µl, ve kterých vzorek budete pozorovat 3) Půl hodiny po této výměně vzorek pozorujte na světelném mikroskopu ve fluorescenčním módu Do protokolu vysvětlete pojmy: kmenová buňka; k čemu jste používali trypsin a proč musel mít teplotu 37°C a čím se zastavila jeho reakce; buněčná terapie v regenerativní medicíně; proč se buňky značí nanočásticemi; co je to nanočástice Mikroskopická část: 1) Najděte ostrý obraz buněčné kultury pro každé zvětšení a nasnímejte. Vyzkoušejte si všechny možné nastavitelné kontrasty a zapište, při kterém kontrastu jste obraz viděli nejostřeji (v každém zvětšení (4x, 10x, 20x, 40x)). 2) Nasnímejte obraz ve fázovém kontrastu při zvětšení objektivu 20 a totéž místo nasnímejte ve fluorescenčním módu 3) Oba snímky složte a do výsledného obrazu vložte měřítko podle použitého zvětšení 4) Každý z vás spočítejte množství buněk z 10ti různých zorných polí z jednotlivých jamek a do protokolu vytvořte společnou tabulku. Stanovte zde průměr počtu buněk/zorné pole a jamky mezi sebou porovnejte. Do protokolu vysvětlete, co znamenají: jednotlivé značky na objektivu, princip fázového kontrastu a fluorescenčního zobrazení, fluorochrom, numerická apertura, rozlišovací schopnost a hloubka ostrosti a popište výhody/nevýhody pozorování vzorku ve fluorescenčním režimu Doporučené zdroje: http://www.olympusmicro.com/ http://www.mesenchymal-stem-cells.com/