Když se řekne molekula DNA, každý sivětšinou představí její dvouřetězcovouformu stočenou do dobře známé dvou-šroubovice. To ale není jediná forma DNA,která může existovat. Pokud se zaměřímepouze na počty řetězců, počet rovný dvě-ma není zdaleka konečný. Jsou známytriplexy tvořené třemi řetězci a skupinastruktur tvořených čtyřmi řetězci. Ty seoznačují jako kvadruplexy (též tetraplexy,G4 DNA), často s přívlastkem guaninové,protože guanin je pro ně nepostradatelný.A právě s těmito molekulami, které jsoune obvyklé nejen svou strukturou, ale i vlast -nostmi a možným způsobem využití, senyní seznámíme.

Struktura kvadruplexuZákladní stavební jednotkou kvadruplexuje guaninová tetráda (obr. 1), označovanátéž jako kvartet. Jde o planární útvar, kte-rý tvoří čtyři cyklicky uspořádané guani-ny, které jsou navzájem propojeny vodí-kovými vazbami. Struktura guaninovétetrády byla poprvé identifikována v r. 1962jako základní stavební jednotka hydro -gelů tvořených 5′-GTP. Pomocí difrakčníanalýzy vláken M. Gellert a spolupracov-níci zjistili, že guaniny planárně uspořá-dané v tetrádě jsou navzájem propojenypomocí 8 vodíkových vazeb spojujícíchWatsonův-Crickův a Hoogsteenův konecsousedních bází. Ve středu každé tetrádyje pak volný prostor, který je v důsledkuorientace karbonylové skupiny do této ob -lasti záporně nabitý. V prostorovém uspo-řádání, kdy jsou jednotlivé tetrády navrst-veny nad sebou, tvoří tento volný prostorkanál, obvykle zaplněný jednomocnýmiionty. Většina guaninových kvadruplexů,jejichž strukturu známe, obsahuje buď

sodné ionty, které se nacházejí v rovinětetrády, nebo draselné ionty, které jsouvšak příliš velké, aby mohly zaujímat po -zici v rovině tetrády, a nacházejí se protov prostoru mezi jednotlivými tetrádami.

Kvadruplexy jsou velmi variabilní struk-tury a existuje mnoho kritérií, podle nichžje lze dělit. Jedním z nich je počet mole-kul DNA (tedy jednotlivých vláken), kte-ré kvadruplex tvoří. Známe kvadruplexyunimolekulární (tvořené jednou molekulou– např. obr. 2a) a bimolekulární (tvoře nédvěma molekulami – např. obr. 2b, c). Tytotypy kvadruplexů musí obsaho vat spojovacísegmenty, označované jako smyč ky, ježumožňují zapojení další sekvence guani-nů do struktury kvadruplexu. Pak jsou zdeještě kvadruplexy označované jako lineár -ní (obr. 2d), tvořené čtyřmi ne zá vis lýmivlákny DNA. Kvadruplexy se mo hou lišiti vzájemnou orien tací jedno tli vých řetěz-ců. Ta je buď pa ralelní (což je typické prolineární kvadruplexy), nebo antiparalelní.Rozdíly panují také v orientaci glykozi-dické vazby u jednotlivých guaninů v ře -tězci. Kvadruplexy se mohou dále lišitpočtem guaninových tetrád, které je tvoří.U kvadruplexů, jejichž strukturu známe,se počet tetrád pohybuje od dvou do čtyř.

Ačkoli jsou kvadruplexy tvořeny pře-devším guaninovými tetrádami, existujíi struktury, které z tohoto schématu vybo-čují. Jsou známy kvadruplexy obsahujícísmíšené tetrády G.C.G.C či A.T.A.T, nebokvadruplexy s tetrádami typu A.A.A.A,T.T.T.T či C.C.C.C. Tyto neobvyklé tetrá-dy mohou být začleněny do strukturykvadruplexu, jejich úloha je však doposudnejasná. Protože však obsahují redukova-ný počet vodíkových vazeb, které jedno -tlivé komponenty propojují, jejich stabi-

lita je mnohem nižší než u klasické guani -nové tetrády. Kvadruplex také může ob -sahovat guaninové analogy, jako je např.inozin nebo thioguanin. Obecně zde aleplatí stejné tvrzení, že tyto substituentyjsou tole ro vány, avšak stabilitu kvadruple-xů většinou neposilují.

Vraťme se ještě ke smyčkám, které jsounedílnou součástí unimolekulárních a bi -molekulárních kvadruplexů. Tyto smyčkyjsou tvořeny převážně thyminy, ale vysky-tují se zde i jiné báze nukleových kyselin,např. adenin. Také délka smyček může býtvelmi rozdílná. Rozlišujeme tři základnítypy – diagonální, laterální (edge) a ex ter -ní (groove) smyčky. Dia gonální (obr. 2b)spojuje dva protilehlé řetězce, jejichžorientace je antiparalelní, a přechází přesoblast ústí centrálního kanálu. Laterálnísmyčka (obr. 2c) spojuje dva sousednířetězce, které jsou taktéž antiparalelní, zatvorby struktury známé jako vlásenka.Externí smyčka (obr. 2a) spojuje také dvasousední řetězce, jejich vzájemná orien -tace je však paralelní a smyčka je vedenapřes boční část molekuly v oblasti žlábku(obr. 6). Tento typ se vyskytuje předevšímv unimolekulárních kvadruplexech.

Je tedy zřejmé, že kvadruplexy mohouexistovat v širokém spektru různých topo-logií. I přes tuto variabilitu je základ jejichstruktury pořád stejný – tedy několik gua-ninových tetrád navrstvených nad sebea centrální kanál obsazený ionty (obr. 3).

Klíčová vlastnost – neobvyklá stabilitaJednou z významných vlastností guanino-vých kvadruplexů je jejich neobvyklá sta-bilita. Míru této stability ovlivňuje řadafaktorů, jako např. počet tetrád, vzájemnáorientace řetězců či délka a typ smyček.Obecně lze říci, že většina kvadruplexů jestabilní za fyziologických podmínek (je -jich teplota tání je vyšší než 37 °C), a tře-ba paralelní kvadruplex tvořený čtyřmitetrádami je natolik stabilní, že vydržíi několikaminutovou inkubaci při teplotě

ziva.avcr.cz 98 živa 3/2009

Naděžda Špačková

Tři jsou málo, pět je mocaneb seznamte se s kvadruplexy

Kvadruplexy, přesněji řečeno guaninové kvadruplexy, patří bezesporu mezinejzajímavější molekuly DNA. I když jsou známy od 60. let 20. stol., zájem o něvzrostl převážně v uplynulých 10 letech. Předpokládá se, že kvadruplexy bymohly hrát důležitou úlohu v klíčových biologických procesech, jakými jsounapř. replikace a transkripce. Tuto hypotézu podporuje i skutečnost, že se jižpodařilo potvrdit jejich existenci in vivo. Kvadruplexy nabízejí svůj potenciálnejen v medicíně, představují také slibný materiál v oblasti nanotechno logií.

2

1

2 Schematické znázornění vybranýchkvadruplexů: a) unimolekulárníparalelní kvadruplex se třemi externímismyčkami, b) bimolekulární antipara -lelní kvadruplex se dvěma diagonál nímismyčkami, c) bimolekulární antipara -lelní kvadruplex se dvěma laterálnímismyčkami, d) lineární paralelní kvadru-plex.

1 Schéma guaninové tetrády, kteroutvoří čtyři guaniny spojené vodíkovýmivazbami. Volný prostor uprostřed tetrádyje obsazen iontem (většinou Na+ nebo K+).

a b c d

100 °C. Co jsme zde ale ještě nezdůraznili,je skutečnost, že zcela zásadní pro stabili-tu kvadruplexů je přítomnost iontů v cen -trálním kanálu. Studie provedené pomocípočítačových simulací metodou moleku-lové dynamiky ukázaly, že kvadruplex do -bře toleruje přítomnost menšího počtuiontů v kanálu, aniž by došlo k narušeníjeho struktury. To je také důležitý před-poklad pro plynulou výměnu iontů mezikanálem kvadruplexu a okolním rozto-kem, k níž dochází na časové škále stovekmikrosekund až milisekund.

Položme si otázku, jak by se choval„prázdný“ kvadruplex. Mohli bychom hovšak těžko pozorovat experimentálně, pro-tože ionty tvoří nedílnou součást těchtostruktur a bez nich ne mohou existovat.Zde nám mohou opět pomoci počítačovésimulace, které ukázaly, že prázdný cen -trální kanál v nepřítomnosti iontů okamži -tě za plní molekuly vody. Voda ale nedo-káže kvadruplex dostatečně stabilizovat,a proto dochází k výrazným změnám jehostruktury (obr. 4a) – lze je charakterizovatjako vzájemné posouvání řetězců. Struk-tury s posunutými řetězci je možné ná -sledně stabilizovat umístěním iontů doka nálu (obr. 4b). Předpokládá se, že tytostruktury s posunutými řetězci by mohlypředstavovat možné mezistavy při procesuformování kvadruplexu. Prázdný kvadru-plex je též schopen spontánně zachytitiont z okolí a nasát ho do kanálu, což jespo jeno s jeho okamžitou stabilizací.

Vraťme se však ještě k iontům. Vezme-me-li v úvahu existenci mnoha typů topo-lo gií kvadruplexu, lze cílenou volbou ion-tů ovlivnit, jaký kvadruplex se vytvoří?U ně kterých sek vencí DNA se zdá, že ano.Příkladem může být lidská telomerní (vizdále) sek vence AG3(T2AG3)3, která tvoříunimolekulární kvadruplex. V přítomnos-ti iontů Na+ byl pomocí spektroskopie nu -kleární magnetické rezonance (dále jenNMR spektroskopie) pozorován antipa -ralelní kvadruplex s jednou dia gonálnía dvěma laterálními smyčkami (obr. 5),zatímco v krystalu v přítomnosti iontů K+

jsou všechny řetězce paralelní, propojenétřemi externími smyčkami (obr. 6). V sou-časné době se však ukazuje, že lidská telo-merní sekvence je schopna tvořit v roztokuantiparalelní kvadruplex jak v přítomnos-ti Na+, tak K+. Patrně zde hrají svou rolii další faktory, které zatím neznáme, aledá se říci, že tato možnost zde existujea jistě by našla praktické využití.

Kvadruplex ve své podstatě představu-je strukturu se zcela jedinečnými vlast-nostmi. Na jedné straně je zde jádro tvo-řené guaninovými tetrádami a centrálním

kanálem s ionty. Tato část molekuly je ne -obyčejně stabilní a rigidní. Na druhé stra-ně většina kvadruplexů obsahuje naopakvelmi flexibilní smyčky, které mohou za -ujímat řadu rozdílných geometrií a budoumít rozhodující vliv na inter akce kvadru-plexu s okolím.

Využití kvadruplexů – od léčiva po elektronickou součástkuKvadruplexy jsou známy především vespojitosti s telomerami, které se nacházejína koncích chromozomů (Živa 2002, 6:245–248). Telomery jsou repetitivní nekó-dující sekvence, za normálních podmínekmají ochraňovat chromozom před nežá-doucími interakcemi s ostatními chromo-zomy. V lidských buňkách mají obvykledélku 5–8 kilobází a jsou tvořeny tan -demově se opakující sekvencí TTAGGG,bo hatou na guanin. Jde o dvouřetězcovéútvary s jednořetězcovým přesahem v dél-ce 100–200 bází, který je nezbytný při pro-cesu replikace DNA. S každým dělenímbuňky dochází ke zkracování telomero 50–200 párů bází. Pokud délka telomerklesne pod kritickou mez, přestává se buň-ka dělit a umírá. Toto bohužel neplatí pronádorové buňky, kde ke zkracování telo-mer nedochází a které jsou tím pádemnesmrtelné. Hlavní podíl na udržování dél -ky telomer má enzym telomeráza. V nor-málních somatických buňkách je ne ak -tivní, ale vykazuje aktivitu v 85–90 %ná dorových buněk. Je tedy zřejmé, že telo-mery a telomeráza představují vysoceatraktivní cíl pro vývoj nových protirako-vinných preparátů.

Enzym telomeráza, umožňující přidávatdalší opakující se sekvence na konec te -lomer, vyžaduje pro svou funkci jedno -řetězcový telomerní konec. Protože jsoutelomerní sekvence bohaté na guanin, jezřejmé, že vytvoření kvadruplexu na kon-ci telomery by zabránilo telomeráze v dal-ším prodlužování telomer. Pomocí malýchmolekul, které specificky interagují s kva -druplexy, by bylo možné tyto útvary dálestabilizovat a tím účinně inhibovat telo-

živa 3/2009 99 ziva.avcr.cz

43

65

3 Bimolekulární kvadruplex d(G4T4G4)2tvořený telomerní sekvencí nálevníkaOxytricha nova. Guaniny z jednotlivýchmolekul jsou barevně rozlišeny pomocísvětle a tmavě modré barvy. Thyminy,které tvoří diagonální smyčky, jsou ozna-čeny červeně. Draselné ionty v centrál-ním kanálu jsou oranžově. Vlevo pohledzepředu, vpravo pohled shora (pro pře-hlednost jsou odstraněny smyčky).4 Výsledky molekulových simulací prolineární kvadruplex: a) kvadruplexs neobsazeným centrálním kanálem jenestabilní a řetězce se vzájemně posou-vají, b) přidáním iontů do centrálníhokanálu dochází k obnovení strukturykvadruplexu, i když jeden řetězec zůstává vůči ostatním posunutý.5 Unimolekulární kvadruplex tvořenýlidskou telomerní sekvencí AG3(T2AG3)3pozorovaný pomocí spektroskopie nu kleární magnetické rezonance v pří-tomnosti sodných iontů. Kvadruplex senachází ve formě označované jako basket(košík) a obsahuje dvě laterální a jednudiagonální smyčku. Vlevo schéma, vpravo reálný pohled na molekulu.6 Unimolekulární kvadruplex tvořenýlidskou telomerní sekvencí AG3(T2AG3)3pozorovaný pomocí rentgenostrukturníanalýzy v přítomnosti draselných iontů.Molekula tvoří paralelní kvadruplex setřemi externími smyčkami a svým tva-rem připomíná vrtuli. Vlevo pohledzepředu, vpravo pohled shora

a b

merázu. Tyto malé molekuly (označovanéjako ligandy) jsou obvykle polyaromatickéheterocyklické sloučeniny, jejichž tvarumožňuje interakci s guaninovou tetrádou.Z mnoha sloučenin můžeme jmenovatnapř. antrachinony, akridiny, triaziny atd.Za zmínku stojí i přírodní telomerázovýinhibitor telomestatin (obr. 7) izolovanýz aktinobakterie Streptomyces anulatuss velkým potenciálem využití. Te lome s ta -tin se specificky váže na unimolekulárníkvadruplex lidské telomerní sekvence,a co je velmi neobvyklé, dokonce induku-je tvorbu kvadruplexu v nepřítomnostijednomocných iontů. Přednostně se vážena určitý typ geometrie (tzv. basket – ko -šík, obr. 5) a dokáže provést konverzi kva -druplexu do tohoto tvaru z jiné geometrie.

Všimněme si nyní způsobu, jakým seligand může na kvadruplex vázat. Pro tutointerakci se nabízejí dvě možnosti (obr. 8).Jednou je interkalace – vmezeření – mezidvě tetrády, druhou pak verti kální inter-akce (stacking) ligandu s krajní tetrádou.Žádné experimenty dosud ne podpořily in -terakci ligandu pomocí interkalace mezitetrády, jež by si vyžádala vzájemné oddá-lení tetrád a přerozdělení iontů, které senacházejí v kanálu. Splnění těchto pod-mínek by bylo energeticky velmi nároč-né, a proto je zřejmé, že interakce ligandus koncovou tetrádou (která tento problémřešit nemusí) představuje základní způsobvazby pro tento typ interakcí.

Většina kvadruplexů obsahuje na svýchkoncích smyčky, které fungují jako flexi-bilní rozpoznávací elementy a vazbu li -gan dů významně ovlivňují. Rozhodujícívliv zde mají faktory jako délka, sekvencea geometrie smyček.

Zmínili jsme kvadruplexy v souvislostis telomerami, ale v genomu se vyskytujístovky až tisíce sekvencí bohatých naguanin, jež by mohly tvořit kvadruplexy.Na rozdíl od telomer však tyto sekvencetvoří klasickou dvouřetězcovou DNA, kte-rá je sama o sobě dosti stabilní a nemásnahu kvadruplexy tvořit. Existují ale situ-a ce, kdy se i tato dvouřetězcová DNA musírozplést – a to v průběhu replikace a tran-skripce – a zde pak dojde ke vzniku pod-mínek pro možnou tvorbu kvadruplexů.Protože kvadruplexy jsou velmi stabilní,je energeticky velmi náročné vrátit taktomodifikovanou DNA do původního stavu.Pokud bychom tedy dokázali cíleně indu-kovat vytvoření kvadruplexu v určitémmístě genomu, mohli bychom takto selek-tivně vypínat či zapínat vybrané geny.

Až čtvrtinu celého genomu eukaryotic-kých organismů (kam patří i člověk) tvořítandemově se opakující sekvence DNA.Dříve se soudilo, že tato repetitivní DNAnemá žádnou biologickou funkci, ale v sou -časné době je zřejmé, že svůj význam má.

Tandemové repetice se často nacházejív regulačních oblastech genu a pokud sez nějakého důvodu výrazně prodlouží, do -jde k abnormální expresi daného genu.Změny v délce tandemových repeticí jsouspojeny s více než 40 lidskými chorobami,jako je např. syndrom fragilního chromo-zomu X. Tento syndrom je spojen s dědič-nou mentální retardací a souvisí s expanzítrinukleotidové sekvence d(CGG) v oblas-ti genu FMR1. Za normálních okolnostímá tato repetice délku 2–52 opakování, aleu po stižených jedinců může dosahovat200 až 2 000 opakování. Tato sekvencevšak může tvořit kvadruplex, který bymohl zamezit dalšímu šíření syndromu.Kvadruplexy tvořené sekvencí d(CGG)byly pozorovány in vitro, ale pro jejichexistenci in vivo hovoří objev proteinů,jež mají schopnost stabilizovat či destabi-lizovat tyto formy kvadruplexu a tím při-spívat k regulaci genové exprese.

Proteinů, které specificky rozpoznávajíkvadruplexy, existuje hned několik. Jsouto např. enzymy helikázy, DNA polyme-ráza nebo telomeráza. Skutečnost, že se -lektivně rozpoznávají tento ne standardnístrukturní motiv, lze po važovat za jedenz důkazů existence (nebo možnosti exis -tence) kvadruplexů in vivo.

Otázkou zůstává, jakou biologickou rolityto sekvence, které mohou tvořit kvadru -plex, hrají – odpověď je však velmi složi-tá, protože zatím jde o nepříliš prozkou-manou oblast. Jednou z možností, kteroujsme zde již zmínili, je regulace genovéexprese, kdy kvadruplex (nebo další látka,která se na něj naváže) vytvoří blok, a tímzabrání procesu replikace či transkripce.

Kvadruplexy však nacházejí uplatněníi v oblasti techniky. Mohou např. sloužitjako předlohy pro syntézu nanostruktura biomateriálů (např. hydrogely). Mohoutaké fungovat jako vysoce selektivní no -siče iontů (ionofory) pro cílené vychytá-vání ne bezpečných kationtů ohrožujícíchživotní prostředí, jako je např. radioak-tivní 226Ra2+ způsobující rakovinu. Kvad-ruplexy na bázi guaninu a izoguaninu jsouschopny vychytávat tento iont dokoncei v přítomnosti alkalických iontů (Na+, K+).

Vysoký potenciál mají kvadruplexy takév oblasti biosenzorů. Zde může jako pří-klad posloužit Thrombin Binding Ap -tamer (TBA), tedy krátký řetězec DNAv délce 15 nukleotidů, který se s vysokouafi nitou a selektivitou váže na enzym pro-teázu trombin. V přítomnosti iontů K+ tvo-ří TBA unimolekulární kvadruplex obsa-hující dvě tetrády a tři laterální smyčky.Mezi tetrádami se pak nachází jediný iontK+, který je naprosto nezbytný pro stabili-tu tohoto kvadruplexu. Bylo zjištěno, žeTBA kvadruplex selektivně upřednostňu-je K+ dokonce i při vysoké koncentraci

iontů Na+ v jeho okolí. Této skutečnosti lzevyužít při konstrukci optických a elektro-nických biosenzorů. Např. jednořetězcovévlákno TBA, modifikované na obou kon-cích fluorescenční látkou, vytvoří v pří-tomnosti iontů K+ kvadruplex, který budeposkytovat specifický fluorescenční sig-nál, odlišný od signálu původního vlák-na TBA. Tento signál můžeme detekovat,a tím měřit obsah K+ v daném vzorku.

Oligonukleotidy s převahou gua ninu –např. d(GGGGTTGGGG) – jsou schopnyv prostředí monovalentních iontů tvořitdlouhá vlákna složená z kvadruplexů.Tato vlákna se označují jako G-dráty (G- -wires). V současné době lze připravitkvadruplexové vlákno dokonce i z jedi-ného řetězce obsahujícího tisíce guanino-vých bází. Taková vlákna mají délku asidesetiny mikrometru a jsou viditelná po -mocí AFM (Atomic Force Microscopy),což je mikroskopická technika využíva jícípřitažlivé síly mezi atomy vzorku a detek-toru k trojrozměrnému zobrazování po -vrchu. Vyznačují se vysokou stabilitoua protože obsahují kanál, v němž se mo -hou pohybovat kationty coby nositelé ná -boje, představují velmi perspektivní kom-ponenty elektronických nanozařízení.

Kvadruplexy mohou také fungovat jakotzv. nanostroje či nanomotory. Zde můžeopět jako příklad posloužit kvadruplexTBA. Tato sekvence je schopna tvořit jakotevřenou formu molekuly – du plex, takuzavřenou formu molekuly – kvadruplex.Cyklus nanostroje pak spočívá v přepíná-ní mezi otevřenou a uzavřenou formou zaúčasti paliva, které rozplétá kvadruplex zavzniku duplexu (C-palivo), nebo odeberejeden řetězec z duplexu, aby zbývajícímohl opět utvořit unimolekulární kvadru-plex (G-palivo).

V současné době máme velké množstvíinformací o struktuře, chování či interak-cích kvadruplexů s ligandy, ale mnohemméně toho víme např. o tom, jakým způ-sobem dochází k jejich formování. A cose týče jejich funkce v živých buňkách,existuje spíše více otázek než odpovědí.Doufejme, že tyto zajímavé ne obvykléstruktury časem najdou široké uplatněnív řadě oborů lidské činnosti, lékařstvímpočínaje a technikou konče.

ziva.avcr.cz 100 živa 3/2009

7

7 Struktura ligandu telomestatinu –přírodního inhibitoru telomerázy8 Interakce kvadruplexu s ligandy:a) schéma dvou možných způsobů inter-akce: A – interkalace (vmezeření) mezite trády, B – vertikální interakce (stac-king) s krajní tetrádou, b) příklad inter -akce lineárního kvadruplexu se třemimolekulami cytostatika daunomycinu(modře). Všechny orig. N. Špačkové

8

A

B

a b