transgenoze a transgenoze a klonování živočichůklonování živočichů

základní metody transformace základní metody transformace živočišných buněkživočišných buněk

• MiMikroinjekcekroinjekce – cizorodá DNA se přenáší do oplodněného vajíčka pomocí tenké skleněné kapiláry pod mikroskopem

– mikroinjekce spermioidů

• Injekce rekombinantními kmenovými buňkamiInjekce rekombinantními kmenovými buňkami

• LipofekceLipofekce

• ElektroporaceElektroporace

• Retrovirální infekceRetrovirální infekce – viz přednáška genové terapie

lipofekcelipofekce• DNA se zabalí umělými lipidovými vezikuly (lipozomy) a přirozenou

cestou je dopravená až do jádra• DNA je záporně nabitá• lipidové monomery jsou nabité kladně

3-dimethylamino-1,2-propanediol

oleyl-toluensulfonát

dioleyloxy(propyl)-N,N,N- trimetylamonium chlorid

lipofekcelipofekce

DNADNA

lipofekce lipofekce (snímky z elektronového (snímky z elektronového

mikroskopu)mikroskopu)

liposomliposom

komplexkomplex

liposomy mohou sloužit jako liposomy mohou sloužit jako tkáňově (tumor) specifické tkáňově (tumor) specifické

transportery DNAtransportery DNA

nové přístupy: zacílení na specifické buňky, do struktury liposomů se zabudují protilátky specifické na dané buňky

mmiikroinjekcekroinjekce

mmiikroinjekcekroinjekce•transgen je vložen do vhodného vektorutransgen je vložen do vhodného vektoru

a) rekombinační vektor (virový vektor)a) rekombinační vektor (virový vektor)

b) transgen je vyštěpenb) transgen je vyštěpen

•oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samičí pronucleus je lépe viditelný)a samičí pronucleus je lépe viditelný)..

•mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroskopempod mikroskopem

•implantace vajíčka do náhradní matkyimplantace vajíčka do náhradní matky. .

•embryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porodembryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porod. .

•detekce potomka vykazující fenotyp transgenudetekce potomka vykazující fenotyp transgenu

•stále nejpoužívanější metoda, stále nejpoužívanější metoda, účinnost 1-5% účinnost 1-5%

elektroporace – vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s elektroporace – vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidůDNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidů

mmiikroinjekcekroinjekceaaa aaa

modelový organismus – modelový organismus – Xenopus laevisXenopus laevis (drápatka (drápatka

vodní)vodní)• obrovská vajíčka umožňují velice snadnou mikroinjekci• zárodky (pulci) se vyvíjejí mimo tělo matky – velice snadné

pozorování a manipulace• studium vývoje zárodku a zakládání orgánů

(embryogeneze)• nevýhody: pomalý životní cyklus, tetraploidní genomdruh X. laevis   X. tropicalis

ploidie  allotetraploidní diploidní

N 18 chromozomů 10 chromozomů

velikost genomu 3.1 x 10 9 bp 1.7 x 10 9 bp

teplotní optimum 16-22o C  25-30o C 

velikost dospělce 10 cm 4-5 cm

velikost vajíčka 1-1.3 mm 0.7-0.8 mm

počet vajíček 300-1000 1000-3000

životní cyklus 1-2 roky 4 měsíce

 

příkladpříklad

m miikroinjekcekroinjekce

• krysí gen pro růstový hormon byl mikroinjekcí vpraven do myši

• pod myším promotorem pro metallothionein, který je aktivován těžkými kovy

• homozygotní linie byla vyselektována na potravě bohaté na těžké kovy

• 10 týdnů staří sourozenci laboratorní myši (49 versus 29 gramů živé váhy)

metallothionein promoter regulovaný těžkými kovy

příkladpříklad

m miikroinjekcekroinjekcetransgenní losostransgenní losos

• gen pro růstový hormon z většího lososa mořského byl pod specifickým antifreeze promotorem vložen do menšího říčního lososa

• fenotyp – ryba roste daleko rychleji a dosahuje dospělosti za polovinu doby než wild-typová ryba.

• nebezpečí: transgenní ryba unikne ze sádek do volné přírody?

• transgenní ryby mají výhodu při páření ale jsou méně zdatnější – evolučně velice nebezpečné – může zdecimovat veškerou populaci

• řešení: sterilní ryby, nebo pěstování ve vnitrozemských sádkách

pstruh

injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněkkmenové buňkykmenové buňky

– nediferenciované buňky, které se mohou diferenciovat v jakoukoliv jinou buňku (totipotentnítotipotentní)

- mohou se kultivovat in vitro v nediferenciovaném stavu a snadno geneticky manipulovat, jsou nesmrtelné

multipotentnímultipotentní

EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYodvozeny z vnitřních buněk embrya ve stavu blastocysty - jsou pluripotentnípluripotentní

injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněk

velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovatdiferenciovat

in vitro již byly připravena většina ze zhruba 250 typů savčích buněk (neurony, ganglia etc.)pro speciální účely mohou být kmenové pro speciální účely mohou být kmenové buňky odvozeny i z dospělého jedincebuňky odvozeny i z dospělého jedince

např. kmenové buňky z lidské kostní dřeně např. kmenové buňky z lidské kostní dřeně lze diferenciovat lze diferenciovat in vitroin vitro na prekurzorové na prekurzorové buňky mozkové, jaterní či svalové), lze je buňky mozkové, jaterní či svalové), lze je však velmi těžce vyselektovat (u 40-letého však velmi těžce vyselektovat (u 40-letého jedince je to jedna buňka z 10 miliard)jedince je to jedna buňka z 10 miliard)

2002 – kmenové buňky byly získány z 2002 – kmenové buňky byly získány z odsátého tuku po liposukci, za 1500 dolarů odsátého tuku po liposukci, za 1500 dolarů navíc, je lze najít a uchovat do budoucna.navíc, je lze najít a uchovat do budoucna.

2004 – byly připraveny pluripotentní buňky 2004 – byly připraveny pluripotentní buňky ze zubní dřeně mléčných zubůze zubní dřeně mléčných zubů

2005 – in vitro množené buňky obsahují 2005 – in vitro množené buňky obsahují množství letálních mutacímnožství letálních mutací

signál

1998 – zjištěno, jak se dají nekonečně dlouho množit in vitro a získat z abortovaných lidských embryí při umělém oplodnění (aktivní telomerasy)

za prsní implantáty a Viagru se utrácí podstatně více peněz, než za výzkum Alzheimera. To znamená, že kolem roku 2030 zde bude široká důchodcovská populace s krásnými ňadry a obrovskými

erekcemi, která si ale ani za boha nevzpomene, co s tím má dělat…

selekceselekceinjekce injekce

kmenových kmenových buněkbuněk

-vznik chimerické -vznik chimerické myšimyši

transformactransformacee

injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněk-vznik chimerické myši-vznik chimerické myši

ICMICM (inner cell mass) (inner cell mass)

normální normální blastocystablastocysta

embryonální kmenové buňkyembryonální kmenové buňky

injekce

vzniká chimerická myš tzn. že vzniká chimerická myš tzn. že má část těla z buněk svých a má část těla z buněk svých a část těla z buněk kmenovýchčást těla z buněk kmenových

mikrochimerismus u člověkamikrochimerismus u člověka

transformace kmenových transformace kmenových buněkbuněk

pozitivní selekce na neomycin (gen M)

inserční vektor substituční vektor

Křížení – selekce transgenní Křížení – selekce transgenní myšimyši

Xchimerický myšák normální myška

barva srsti:

genotyp:

gamety:

ES blast

agouti black black

AABB aaBB aaBB

tm/+ES +B6 /+B6 +B6 /+B6

tm a +ES +B6 +B6

potomstvo F1:

tm/+B6+ES/+B6 +B6/+B6

agoutiagouti blackAaBBAaBB aaBB

AB aB aB

tm = mutace (nebo nový gen)

A – dominantní pro agouti srst

pokud je recesivní – bez projevupokud je dominantní – část potomstva s projevem

Křížení – selekce transgenní Křížení – selekce transgenní myšimyši

tm = mutace (nebo nový gen)

tm/+B6 tm/+B6

X

tm/tm tm/+B6 +B6/+B6

25% 50% 25%

transgenní homozygottransgenní homozygot

potomstvo F2:

knockoutovaná myšknockoutovaná myš • gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do

inzertního vektoru• gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k

neomycinu) do jeho ORF• transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na

neomycinu• vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do

hostitelské matky• selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu)

gen v genomu EKBExon 1Exon 2Exon 3Exon 4

homologní rekombinace a přerušení genu

inzerční vektor

knockoutovaná myšknockoutovaná myš • PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ

REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen)

• možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci• do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus

thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také tento gen

• selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk

• náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají

NeoR HSVtk

Gen

e se

gmen

t 1Gen

e se

gmen

t 2

linearizovaný substituční vektorhomologní rekombinace

NeoR

NeoR+/ HSVtk-

náhodná integrace

NeoR+/ HSVtk+

knockoutovaná myšknockoutovaná myš -důležitý model pro ůležitý model pro

testování funkce testování funkce jednotlivých genů u jednotlivých genů u

obratlovcůobratlovcůPROBLÉMY: 1) knockout zabíjí časné fáze embrya i když by neměl letální vliv na

dospělého jedince.2) nedostatečnost transgenní placenty – přenesení embrya do

netransformované matky (část placenty vzniká z embrya)

ŘEŠENÍ: PODMÍNĚNÝ KNOCKOUTPODMÍNĚNÝ KNOCKOUT

Nobelova cena za medicínu 2007

podmíněný knockout• využívá rekombinasový systém P1 fága Cre –lox,• Cre-rekombinasa je specificky fungující enzym pro lox sekvence

(34bp, sekvence mezi je tzv. floxovaná)• standardně jsou připraveny dvě linie transgenní myši pomocí

kmenových buněk• první) je připravená homologní rekombinaci tak že má do sebe

vložený požadovaný transgen (je stále funkční) floxovaný lox místy a geny pro selekci

• druhá) je připravená náhodnou rekombinací a je do ní vložen gen pro Cre rekombinasu pod specifickým promotorem

a) tkáňově specifickýb) indukovatelný tetracyklinem

• z obou linií se vyselektují homozygoti• ti se zkříží• gen je knockoutován pouze ve specifické tkáni

(místně)• nebo časově po indukci tetracyklinem

problémy práce s problémy práce s embryonálními kmenovými embryonálními kmenovými

buňkamibuňkami• etickéetické – v některých zemích je zákaz odvozovat a pracovat s EKBúplný zákaz: Německo, Rakousko, Francie, Švýcarsko, Norsko, Irsko,

Polsko, Brazíliečástečný: USA pouze linie odvozené do roku 2001, nesmí se derivovat

novévolná manipulace: Japonsko, Kanada, Španělsko, Itálie, Finsko,

Švédsko, Izrael, Singapur, Austrálie, ČR

• imunologická inkompaktibilita imunologická inkompaktibilita vytvořené linie nejsou imunologicky kompatibilní s většinou pacientů kteří potřebují transplantaci

• teratomy teratomy nediferenciované EKB tvoří často po implantaci do těla pacienta teratomy, pokusy s diferenciaci in vitro a až poté implantace

• kmenové buňky dospělé kmenové buňky dospělé špatná diferenciace, ale 100% imunologická kompaktibilita pokud jsou ze stejného jedince

řešení – řešení – vlastní embryonální buňkyvlastní embryonální buňkyterapeutické klonování aneb přenos

jader somatických buněk

květen 2005 SCIENCE

první úspěšné terapeutické klonování člověka ??

Woo-suk HWANG

leden 2006 - skandál

využití kmenových buňekvyužití kmenových buňekkmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do

postižené tkáně (např. infarkt myokardu)postižené tkáně (např. infarkt myokardu)

• pokusy na myši u které byl uměle vyvolán infarkt prokazovaly, že kmenové buňky nejsou schopny diferenciovat po implantaci v srdeční buňky.

• u některých myši se však funkce srdce zlepšila

• kmenové buňky byly označeny GFP a sledovány po implantaci do myšího srdce, bylo zjištěno, že u některých myší se transformují v nové cévy a zlepšují tak prokrvení nemocného srdce.

2003 v Praze první pacient, kterému byly po 2003 v Praze první pacient, kterému byly po těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní

kmenové buňky z kostní dřeněkmenové buňky z kostní dřeněpo zlepšení následovali další pacienti, u člověka po zlepšení následovali další pacienti, u člověka se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u

myší.myší.zatím však lidské kmenové buňky nemohou být zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak upravovány či značeny a tak se neví zda nijak upravovány či značeny a tak se neví zda

regenerace srdečního svalu pomocí kmenových regenerace srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje jinak než u myšíbuněk u lidí funguje jinak než u myší

podobné pokusy probíhají v Německu a podobné pokusy probíhají v Německu a HolandskuHolandsku

využití transgenních využití transgenních zvířatzvířat

jako bioreaktory:jako bioreaktory: domácí zvířata produkující mléko, do kterého je vylučován produkt

transgenu.

• gen je včleněn do genomu zvířete pod specifickým promotorem β-laktoglobulínu exprimujícím se v prsních žlázách

• produkt transgenu neovlivňuje život transgenního zvířete

• produkce lidských proteinu: inzulín, erytropoetin atd.

• pavoučí mléko: fa NEXIA začala produkovat transgenní kozy exprimující geny pro produkci pavoučího proteinu, ze kterého pavouk vyrábí sítě do mléka

• pavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se na výrobu neprůstřelných vest

SPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILKSPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILK

využití transgenních využití transgenních zvířatzvířat

xenotransplantace:xenotransplantace: • prasata jsou nejvhodnější dárce, podobná velikost, podobný imunitní

systém• v současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitní

systém, nebo modifikované povrchové proteiny buňky, tak aby je neodmítal lidský imunitní systém

• např. inaktivace 1,3-galaktosyl transferasy, která přenáší galaktosu na povrch prasečích buněk a kterou rozpoznává lidský imunitní systém jako antigen

• odstranění receptorů, které jsou důležité pro imunitní odpověď z prasečích buněk

• 2003 - první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházející z prasete

• první úspěšný pokus: transplantace prasečích ostrůvkovitých buněk slinivky břišní, produkující lidský inzulín diabetikovi

PROBLÉMY: etické, přenos prasečích virových onemocnění na lidipřenos prasečích virových onemocnění na lidi (endogenní retroviry), spousta „odpadních“ selat při selekci vhodného dárce

využití transgenních využití transgenních zvířatzvířat

produkce „zdravých“ zvířat: produkce „zdravých“ zvířat: • produkce drůbeže z masem, které má nižší obsah tuku• produkce vajec se sníženým obsahem cholesterolu atd.

zvyšování odolnosti hospodářských zvířat proti zvyšování odolnosti hospodářských zvířat proti nemocemnemocem

buněčné klonováníbuněčné klonovánízaškrcení embryazaškrcení embrya

transplantace jádratransplantace jádra• hlavní technika v současnosti

používaná

partenogenezepartenogeneze• zárodek se vyvíjí z neoplodněného vajíčka vzniká pouze samičí

potomstvo (haploidní jedinec)• zdařilé pokusy (i přirozeně u nižších živočichů, typické pro

mravence) u savců se zatím nezdařila bez deformací embrya

• nejstarší metoda klonování • i přirozeně (jednovaječná dvojčata, normální způsob u

pásovců, vždy vznikají 4 stejné klony)• u člověka docházelo k deformaci jednoho embrya

polyembryonie

transplantace jádratransplantace jádra

1. denukleace hostitelské buňkychromozomy jsou jemně nasáty ostrou mikropipetou ze zralého neoplodněného vajíčka v metafázi II

2. přenos jádra

A. elektrofokusace – celá donorová (somatická) buňka dárce je elektroporována za zónu peliculu (vnější membrána oocytu) a fúzována s cytoplasmou hostitelského denukleovaného oocytu

jádro z jedince který je klonován do bezjaderného vajíčka

B. jaderná injekce – jádro somatické donorové buňky je mikroinjektováno do cytoplastu (honolulská metoda)

oocyt cytoplast

denukleace

transplantace jádratransplantace jádraelekroporaceelekroporace

somatická buňka (kmenová buňka, tuková buňka, buňky pohlavních žláz, fibroblast, neuron)

cytoplast

transplantace jádratransplantace jádrajaderná injekcejaderná injekcetuková buňka z vaječníku cytoplast

a) disperzované tukové buňkyb) jádra (šipky) nasáté do mikropipetyc) propíchnutí zóny pelikulyd) zasunutí mikropipety až k ooleměe) aplikace piezo impulsu, který

prolomí oolemuf) injekce jádra tukové buňky do

ooplastu

transplantace jádratransplantace jádragenetické přeprogramovánígenetické přeprogramování

“přeprogramování” – aktivace genomu dárcovské buňky k obnovení jeho totipotence tak, aby mohla nově vzniklá buňka se dělit a diferenciovat ve všechny další typy buněk celého organismu

je nutné pokud je jádro klonu vzato ze somatické buňky dospělého jedince

nejlépe k němu dochází právě v cytoplasmě denukleovaného oocytu

přeprogramovánípřeprogramování

transplantace jádratransplantace jádra

vývoj embrya z buňky obsahující cizí jádrovývoj embrya z buňky obsahující cizí jádro

buňky po transformaci jsou pěstovány v médiuindukce embryogeneze chemicky: chlorid

strontnatý

implantace embryaimplantace embrya

embryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohy vhodné náhradní matky

vždy je vloženo několik embryí současně (malá pravděpodobnost uchycení)

buněčné klonováníbuněčné klonování19581958 – první pokusy o klonování, vědci dokázali poprvé totipotenci buňěk

buněčné klonováníbuněčné klonování19861986 první klonovaný první klonovaný savecsavec kráva byla naklonována z buněk časného stádia embryogeneze (nemá svůj jinak starý klon!)

19931993 – telata byla získána jaderným přenosem z embryonálních kmenových buněk pěstovaných in vitro

19951995 – dvě ovce Megan & Morag byly naklonovány z embryonálních buněk

příběh ovečky Dollypříběh ovečky Dolly19961996 - první savec naklonovaný ze somatické

buňky.

• byly odebrány somatické buňky z prsní žlázy (vemeno) 6-leté ovce (genetická matka Dolly, plemeno Finn Dorset)

• buňky byly přeneseny na vhodné médium in vitro a pěstovány

• buňky pak byly na 5 dní přeneseny na médium bez živin aby přestaly růst (dostaly se do G0 fáze a zbavily se naprogramování na prsní žlázu)

• každá z buněk pak byla elektroporačně zfúzována s denukleovaným ovčím oocytem ve stádiu metafáze II

• zfúzovaná buňka byla přenesená zpět do živného média a chemicky bylo indukováno dělení a embryogeneze (SrCl2)

• v 16-buněčném stádiu bylo embryo chirurgicky přeneseno do dělohy náhradní matky (plemeno Scotish blackface, skotská černohubka).

• Dolly se narodila 5.6.1996 v Roslinově institutu ve Skotsku

• Dolly má v podstatě tři matky – genetickou, tu co poskytla denukleované vajíčko a tu co ji donosila.

rodokmen Dollyiny rodinyrodokmen Dollyiny rodiny

z Dollyina fotoalbaz Dollyina fotoalba

Dolly a její náhradní matka

Dolly a její „otec“ Ian Wilmut

manžel Dolly beran David plemeno velšské horské

Dolly s prvorozeným jehnětem Bonnie (13.4.1998)Dolly s třemi dalšími jehňaty (2xM a 1xŽ) 24.3.1999)

úspěšnost klonování:úspěšnost klonování: • na přípravu Dolly bylo zfúzováno 277 denukleovaných jader s 277

somatickými buňkami• 29 embryií přežilo• 13 se úspěšně usadilo v dělohách náhradních matek• pouze jedna donosila živé jehně

Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 letlet (průměrný věk ovce je 12)

problémproblém: ZKRÁCENÉ TELOMERYZKRÁCENÉ TELOMERY

- bylo statisticky potvrzeno u Dolly

příběh ovečky Dollypříběh ovečky Dolly

mitochondriální DNA:mitochondriální DNA: obsahuje 37 genů většinouodpovědných za regulaci energetického metabolismu (dědí se v mateřské linii).Dolly mtDNA zdědila od druhé matky, která darovala vajíčkopři přenosu somatické buňky dochází i k přenosu mtDNA první matky, ta je však ve vajíčku zničena, stejně jako mtDNA spermiíu člověka je dědičně vrozená hluchota spojená s mutacemi na mtDNA

vědci se přou o to zda Dolly vznikla opravdu ze somatické buňky nebo pouze z kmenové buňky přítomné ve vemeni

1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen

- - narodila se také v Roslinově institutu ve Skotsku

- byla naklonována z fibroblastu ovčího plodu, který byl in vitro geneticky modifikován

- byl do něj vložen lidský gen pro alpha-1-antitrypsin pod promotorem s expresí do mléka

- je to protein používaný pro terapii cystické fibrózy

- ovce produkující další terapeuticky významné proteiny jsou na světě

- jejích produktů se zatím nevyužívá protože je obava, že mohou mít chorobu svědivku, která může mít podobný základ jako BSE a u lidí vyvolávat Jacobs-Creutzveldovu chorobu

příběh ovečky Pollypříběh ovečky Polly

myš Cumulina a její sestrymyš Cumulina a její sestry1999 první klonovaná myš z dospělé buňky na Honolulské Univerzitě na Hawaiiz několika náhradních matek vzniklo 22 samičích klonů první generace, první myš byla pojmenována Cumulinaz myší první generace byly odebrány somatické buňky a bylo vytvořeno 28 klonů druhé generacemyši byly klonovány z tukové buňky vaječníkubuňky nebyly fúzovány elektroporačněale tzv. honolulskou technikou pomocíspeciální mikropipetyúspěšnost 2-4%tým se také pokoušel o naklonovánímyši z neuronua poprvé se také pokusily vytvořitmužské klony ze Sertoliho buněk varlat - neúspěšně

XENA – první klonované seleXENA – první klonované sele2000 v Roslinově ústavu se narodilo černé sele Xena bílé prasnicimetoda použitá při klonování Dolly selhala a sele bylo získáno honolulskou technikou z buňky odebrané z měsíčního ploduúspěšnost: Xena vzešla ze 110 klonovaných vajíček, které byly implantovány do 4 náhradních matek

Embryos clonally derived by microinjecting the nuclei of Meishan x Meishan breed (black coat) fetal fibroblasts into Landrace breed (white coat) enucleated oocytes. These embryos are at the four-cell stage after 40 hours of culture in vitro.

první klonované prase s první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitoulidskou imunokompaktibilitou

2002 opět v Roslinově ústavu ve spolupráci s japonskou firmou PPL Therapeutics se narodilo prvních pět selat s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu (nejsou to klony)

1,3- galaktosa na povrchu prasečích buněk způsobuje „hyperacute rejection“ –HAR při xenotransplantacích, což je rychlá humorálně imunitní odpověď lidského těla na prasečí buňky

2003 byly připraveny prasata s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu a vloženým lidským genem pro alfa- 1,2- fukosyltransferasu, která se podílí na tvorbě univerzálně akceptovaného antigenu HT na povrchu buněk

2005 plánovány první transplantace prasečích srdcí, ledvin,slinivek, jater, kůží a krevních buněk z 1,3-GT knock-outHT transgeních prasat do lidí.

první klonované prase s první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitoulidskou imunokompaktibilitou

standardně byly připraveny selata overexprimující lidský gen pro alfa- 1,2- fukosylosyltransferasu a pomocí PCR byly vyselektováni z vrhu dva heterozygoti (samec a samice) a ti spáření dohromadysamice byla ve 30 dnů těhotenství zabita a z jejího těla bylo odebráno 12 plodů, ze všech byla odstraněna hlava, končetiny a vnitřnosti a zbylá tkáň byla rozsekaná a kultivována na jednotlivé buňkybuňky byly elektroporovány s linearizovaným vektorem nesoucí knock-outovaný gen pro 1,3 galaktosyl transferasu a dvojitě transgenní linie vyselektovány na neomycinutyto buňky pak byly použity na přenos do denukleovaných oocytů honolulskou metodou

HT+ HT-

první klonované kotě CCprvní klonované kotě CC

se narodilo 22 prosince 2001 v texaské firmě A&M na získání CC bylo použito 188 embryíCC není stejná jako Rainbow, barva srstí a její textura je částečně ovlivněna prostředím dělohy (fenomén inaktivace X-chromozomu)první pokus: byly použitý kožní buňky, jediná těhotná kočka nesoucí klon potratila ve 44 dnuCC byla připravena nakonec stejně jako Cumulina z tukové buňky vaječníkuRainbow

genetická matka

CopyCat

náhradní matka

z katalogu firmy:z katalogu firmy:

genetický dárce klony

gizmo malý gizmo

tahini baba nanusch a tabouli

nicky malý nicky

používají novou metodu klonování:chromatinový transfer

cena za jeden klon:32 000 $

cena za uložení buněk z

mrtvého či živého zvířete

do banky :850 $

klonování psů komplikovanější:

- nepravidelná a velmi řídká ovulace (nutnost udržovat velkou populaci náhradních matek)

- vajíčka nedozrávají ve vaječnících ale až ve vejcovodech a proto je nelze jako u jiných savců získávat při sterilizaci zvířat (nutno operativně – drahé)

- psí vajíčka jsou zakalené spoustou tuku a lze je těžko mikroskopicky denukleovat

nedostatky klonování savcůnedostatky klonování savců• velmi malá klonovací úspěšnost, většinou pod 1%• vysoká úmrtnost čerstvě narozených klonů • „oversize offspring syndrome“ – zatím nevysvětlen• časté jsou také fyzické deformace narozených plodů – časté u

metody zaškrcování embrya • artritida, srdeční arytmie, respirační problémy či totální selhání

imunity klonů• problém se stářím klonů - telomery

druh počet použitých oocytů počet narozených klonů

zemřeli po porodu

myš 2468 31 (1.3%) -

kráva 440 6 (1.4%) 2

ovce 417 14 (3.4%) 11 po 6 měsících

prase 977 5 (0.5%) -

koza 285 3 (1.1%) -

počítají se pouze klony vzniknuvší z dospělé somatické buňky, do konce roku 2002

třetí metoda klonování savcůtřetí metoda klonování savců

•nejlevnější a nejúčinnější

•upravené embryonální buňky do tetraploidních embryí

•u vyšších savců tetraploidie neslučitelná se životem

•tetraploidní buňky se podílí pouze na tvorbě plodových obalů a placenty

•v současnosti nejpoužívanější metoda klonování

•úspěšně funguje u myší

první klonovaný primát – opice první klonovaný primát – opice TetraTetra2002 byla připravená metodou zaškrcování embrya, která do té doby u primátů, ani u člověka nefungovalaz jednoho přirozenou cestou získaného embrya (ve stavu 8-buněk) makaka rhesus byly připraveny in vitro 4 klony (dvoubuněčné embrya) 2 odumřely ještě ve zkumavce, třetí abortoval v děloze náhradní matky. Pouze Tetra se „dožila“ porodu a těší se dobrému zdraví Tetra v podstatě není klon,

protože neexistuje jí totožný jedinecpokusy naklonovat makaka metodou jaderného přenosu selhávají

všechna embrya získána z cizího jádra abortovala nejpozději ve stádiu blastulybylo zjištěno že při dělení buněk dochází k náhodným přesunům chromozomů mezi buňkami

klonování primátu jaderným klonování primátu jaderným přenosempřenosem2002 firma CLONAID řízená sektou Reliánů podává spekulativní informace o klonováných lidských embryiích a dokonce i o narození prvních klonovaných dětí.

leden 2004 Dr. Zavos v Londýně oznámil, že implantoval 35-leté ženě první naklonované lidské embryo z buńky jejího manžela. U ženy nedošlo k těhotenství. Nepodal žádné bližší informace.

únor 2004 tým z národní jihokorejské univerzity poprvé připravil naklonována lidská embrya(do stádia blastuly) jaderným přenosem z dospělé buňky. Pokus o implantaci embrya do náhradní matky neproběhl.

prosinec 2004 tým z Pittsburgu ve spolupráci s jihokorejci připravil první nedegenerovaná embrya nukleárním přenosem makaka rhesuse. 188 těchto embryií bylo přeneseno do 25 náhradních matek. Ani u jedné však nebylo zjištěno pokročilé těhotenství.

obě skupiny z embryí připravili stabilní linie kmenových buněk

úspěchu dosáhli až poté co zdokonalili metodu použitou u Dolly, kdy denukleaci oocytu provedli pomocí pórů v buněčné stěně. neodstranili tak společně s jádrem esenciální bílkoviny z cytoplasmy důležité pro dělení nového jádra.

klonování primátu jaderným klonování primátu jaderným přenosempřenosem

VYUŽITÍ KLONOVANÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK

TERAPEUTICKÉ KLONOVÁNÍ přenos jader somatických buněk• nejsou velké etické zábrany veřejnosti pro výzkum v této oblasti.

• embryonální kmenové buňky jsou nejvíce prozkoumány a zdají se být na rozdíl od ostatních kmenových buněk nejvhodnější pro terapii.

• odpadá imunologická inkompatibilita

• stejné genetické stáři buňky jako buněk jejích příjemce

• začíná se s prvními výzkumy v oblasti léčby nemocí, kde je specifická tkáň degenerována a může být nahrazena těmito buňkami: diabetes, osteoartritida, Parkinsonova a Altzheimerova choroba.

VYUŽITÍ OPIČÍCH KLONů PRO TESTOVÁNÍ NOVÝCH LÉČIV

klonování primátu jaderným klonování primátu jaderným přenosempřenosem

ETIKAETIKA

celosvětový zákaz reproduktivního klonování byl schválen a vydán OSN v roce 2005

• většina vyspělých zemí má reproduktivní klonování zakázáno vlastní legislativou

• USA povolená manipulace s klonovanými lidskými embryi do stáři dvou týdnů

• EVROPA – povolená manipulace s embryonálními kmenovými buňkami – Holandsko, Švedsko, Řecko a Finsko, pouze s těmi vznikající jako odpad při umělých oplodněních

• VÉLKÁ BRITÁNIE jediná země, kde je povoleno záměrně vytvářet lidská embrya pro zisk kmenových buněk

KONZERVAČNÍ BIOLOGIEKONZERVAČNÍ BIOLOGIE• se zabývá zachováním ohrožených druhů živočichů na Zemi• The Center for Reproduction of Endangered Wilidlife (CREW) v

Cincinnati ZOO se začal zabývat klonováním ohrožených druhů• prvním klonovaným živočichem byl sameček divokého malajského

gaura, kteří žijí již pouze v zajetí v ZOO. Tito živočichové pěstovaní v zajetí se však často odmítají vzájemně pářit.

• jejich klonování je důležité proto, aby byla zachována genetická diverzita v málo početné populaci.

• sameček Noah byl také prvním vytvořeným samčím savčím klonem, který se dožil porodu

• jeho chromatin byl vložen do denukleovaného oocytu krávy plemena Holstein, která ho také porodila

• Noah bohužel zemřel dva dny po porodu na infekci

KONZERVAČNÍ BIOLOGIEKONZERVAČNÍ BIOLOGIE• dalším ohroženým druhem „úspěšně“ naklonovaným byla

antilopa bongo• zvažuje se klonování velkých červených pand. Neexistuje však

vhodná náhradní matka. Vědci nechtějí použít vlastní samice pand, protože již tak málo jedinců by bylo vystaveno velkému nebezpečí. Nejbližším vhodným příbuzným je mýval.• v Austrálii chtějí klonovat Tasmánského tygra, který byl vyhuben v roce 1930. (jediný exemplář je mládě ve zkumavce, jeho DNA už však začíná být částečně fragmentovaná)

• 1999 příběh španělské kozy Celie (bucardo) jak se bude klon rozmnožovat?

• má smysl tyto živočichy oživovat, když stejně nebudeme schopni jim zaručit genetickou diverzitu v rámci druhu?

• mamut – zatím nebyl nalezen vhodný vzorek DNA (daleká budoucnost)

• dinosauři - utopie maximální životnost DNA je 10.000 let