Fakulta potravinářské a biochemické technologie
Ústav analýzy potravin a výživy
UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková,
Marta Václavíková, Milena Zachariášová
Stanovení mykotoxinů v semeni máku
Praha, červenec 2012
Dedikace:
Uplatněná certifikovaná metodika vznikla za finanční
podpory Ministerstva zemědělství České republiky v rámci
řešení projektu č. QH 92106.
© Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková, Marta Václavíková, Milena
Zachariášová, 2012
ISBN 978-80-7080-827-6
OBSAH
1. CÍL METODIKY .......................................................................................................................................... 4
2. TEORETICKÝ ÚVOD ................................................................................................................................... 5
3. VLASTNÍ POPIS METODIKY ....................................................................................................................... 6
3.1. Použitelnost metody .............................................................................................................................. 6
3.2. Princip metody ....................................................................................................................................... 7
3.3. Bezpečnost práce ................................................................................................................................... 7
3.4. Chemikálie a spotřební materiál ............................................................................................................ 8
3.5. Přístroje a zařízení ................................................................................................................................. 9
3.6. Pracovní postup ..................................................................................................................................... 9
3.6.1. Příprava zásobních roztoků standardů ......................................................................................... 9
3.6.2. Příprava kalibračních roztoků matričních standardů .................................................................. 10
3.6.3. Homogenizace vzorků ................................................................................................................. 11
3.6.4. Extrakce a přečištění vzorků ....................................................................................................... 11
3.7. Identifikace a kvantifikace ................................................................................................................... 11
3.7.1. Kapalinová chromatografie ......................................................................................................... 12
3.7.2. Hmotnostní spektrometrie ......................................................................................................... 15
3.7.3. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení analytů ....................................................................... 17
3.7.4. Výpočet koncentrace analytů ve vzorku ..................................................................................... 17
3.8. Pracovní charakteristiky metody ......................................................................................................... 18
3.8.1. Správnost metody ....................................................................................................................... 18
3.8.2. Rozsah metody a linearita........................................................................................................... 18
3.8.3. Mez stanovitelnosti (LOQ) .......................................................................................................... 18
3.8.4. Opakovatelnost metody ............................................................................................................. 19
4. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU .............................................................................................................. 21
5. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY ...................................................................................... 22
6. EKONOMICKÉ ASPEKTY .......................................................................................................................... 23
7. SEZNAM SOUVISEJÍCÍ POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................................... 24
8. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELI METODICE ............................................................................ 25
9. AUTOŘI A OPONENTI ............................................................................................................................. 26
4
1. CÍL METODIKY
Dílčím cílem projektu QH 92106 podporovaného Ministerstvem zemědělství České
republiky bylo vyvinout, optimalizovat a validovat novou analytickou metodu pracující na
základě citlivého moderního systému UHPLC-MS/MS, která je vhodná pro stanovení
širokého spektra mykotoxinů v semeni máku.
Vypracovaná metodika bude dále předána pracovníkům laboratoří Státní zemědělské a
potravinářské inspekce (SZPI), která bude tento laboratorní postup dále používat při analýze a
kontrole komerčních vzorků semen máku.
5
2. TEORETICKÝ ÚVOD
Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity vláknitých hub (plísní). Jedná se o
široké spektrum látek, jejichž nejčastějšími producenty v klimatických podmínkách České
republiky jsou plísně rodu Fusarium, Alternaria, Penicillium a Aspergillus. Tyto přírodní
kontaminanty významnou měrou ovlivňují hygienicko-toxikologickou, ale i technologickou
kvalitu potravin rostlinného původu a to zejména cereálií, ovoce a jejich potravinářských
produktů. V posledních letech byla pozornost zemědělců zaměřena na produkci máku, který
se stal významným vývozním artiklem. Zatímco pro některé mykotoxiny jsou legislativně
stanoveny jejich maximální limity ve vybraných potravinářských komoditách jako jsou
obiloviny, jablka, oříšky, káva (např. „COMMISSION REGULATION EC No 1881/2006 of
19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs“), pro mák
žádné hygienické limity stanoveny nejsou. Hlavním důvodem, je nedostatek dat podávajících
informaci o míře mykotoxinové kontaminace máku, na základě kterých by mohl být obsah
mykotoxinů v máku legislativně stanoven. S tím také souvisí problém dostupnosti vhodných
metod pro stanovení těchto přírodních toxinů s co nejvyšší citlivostí. V České republice se
vzhledem k absenci hygienických limitů mykotoxiny v máku dosud rutinně nesledovaly. Co
se týče kontaminace máku mykotoxiny, nejsou v současné době dostupné žádné relevantní
publikace týkající se této problematiky.
Obecně lze konstatovat, že problematika výskytu mykotoxinů v potravinách je pro EU
jednou z priorit z pohledu chemické bezpečnosti potravin. Dokumenty EU zabývající se
danou problematikou zdůrazňují nutnost zavedení citlivých analytických metod pro
monitoring a kontrolu celé řady mykotoxinů v různých potravinářských komoditách.
V posledních letech získaly popularitu různé multimykotoxinové metody, které spočívají
v jednoduché přípravě vzorku a následné identifikaci a kvantifikaci za pomoci sofistikované
instrumentace jako je např. spojení ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou
hmotnostní spektrometrií UHPLC-MS/MS. Takto je možné stanovit široké spektrum analytů
v rámci jedné analýzy.
6
3. VLASTNÍ POPIS METODIKY
3.1. Použitelnost metody
Analytická metoda je určena pro stanovení širokého spektra mykotoxinů (trichotheceny,
altertoxiny, aflatoxiny, enniatiny, námelové alkaloidy a ostatní jako zearalenon a jeho
metabolity, ochratoxin A) v semeni máku. Souhrnný seznam analytů je uveden v Tabulce I..
Tabulka I: Přehled stanovovaných analytů
7
3.2. Princip metody
Mykotoxiny uvedené v Tabulce I mají velmi široké rozmezí fyzikálně-chemických
vlastností. Proto je pro jejich extrakci / purifikaci využívána metoda QuEChERS (Quick,
Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), která umožňuje snadné, efektivní a rychlé
stanovení všech uvedených látek najednou v rámci jedné analýzy a přípravy vzorku.
Extrakčním činidlem je směs acetonitrilu a 0,1% kyseliny mravenčí. Po extrakčním kroku
následuje vysolení analytů do acetonitrilové fáze intenzivním třepáním vzorku s NaCl a
MgSO4 a centrifugace. S ohledem na vyšší obsah tuku v matrici byl zařazen purifikační krok
disperzní SPE zajišťující oddělení nepolárních látek z acetonitrilového extraktu matrice.
Alikvotní podíl organické fáze – acetonitrilu je přečištěn sorbentem – Bondesil (modifikovaný
C18 silikagel). Vzorek je následně centrifugován a pomocí vysoko-účinné kapalinové
chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrí (UHPLC-MS/MS)
analyzován.
3.3. Bezpečnost práce
S kontaminovanými vzorky a standardy mykotoxinů je třeba pracovat jako s toxickými
látkami (tj. látkami, které po vdechnutí, požití nebo proniknutí kůží mohou i v malém
množství způsobit akutní nebo chronické poškození zdraví nebo smrt). Od přípravy vzorků až
po UHPLC-MS/MS stanovení je nutno pracovat v gumových rukavicích. Všechny pracovní
pomůcky včetně skla, které přišly do styku se standardy nebo roztoky mykotoxinů musí být
dekontaminovány v roztoku chlornanu sodného. Zbytky standardních roztoků a vzorků po
analýze jsou ukládány samostatně a po dekontaminaci roztokem chlornanu sodného
likvidovány.
Pozn.: Při přípravě vzorků (až po stanovení kapalinovou chromatografií)) je třeba pracovat
v gumových rukavicích. Zbytky standardních roztoků a vzorků (vyextrahované původní vzorky
i roztoky vzorků po HPLC analýze) jsou dekontaminovány v roztoku chlornanu sodného
(0,25% NaClO / 0,025 M NaOH).
8
3.4. Chemikálie a spotřební materiál1
acetonitril, HPLC gradient, Sigma-Aldrich (USA)
deionizovaná voda (přečištěná z destilované vody pomocí zařízení Milli-Q, Millipore,
Německo)
aceton (p.a., Lachema Brno, Česká republika, čerstvě redestilovaný)
methanol (Lichrosolv, gradient grade, for chromatography, Merck, Německo)
octan amonný, 99,99%, Sigma-Aldrich (USA)
kyselina mravenčí 85%, Penta, Crudim (ČR)
mravenčan amonný 99%, Sigma Aldrich (USA)
chlornan sodný, Penta, Chrudim, (ČR)
chlorid sodný (NaCl) 99,5%, Sigma Aldrich (USA)
síran hořečnatý (MgSO4) 98%, Sigma-Aldrich (USA)
Bondesil, C-18 sorbent, 40 µm, Agilent Technologies (USA)
mikrofiltry 0,2µm, Alltech (USA)
dusík (99.994 %) - Technoplyn (ČR)
dávkovač Finnpipette Dispenser 5,0-30,0ml (USA)
automatická mikropipeta, 0,5-5 ml, TreffLab (Švýcarsko)
automatické mikropipety, 100 – 1000 a 20-200 µl, 10 ml, Biohit (Německo)
mikrostříkačky o objemu 10, 100, 250 a 500 l, Hamilton (USA)
běžné laboratorní sklo a vybavení
plastové (PTFE) odměrné baňky
plastové vialky (PTFE) s konickým dnem, víčka, septa
plastové (PTFE) kyvety o objemu 50 ml a 15 ml
certifikované standardy analytů uvedených v Tabulce I, Biopure (Rakousko, dodavatel
Dynex s.r.o.), Sigma Aldrich (USA)
1 Validace metody byla provedena s uvedenými chemikáliemi; lze však použít i jiného dodavatele za
předpokladu, že kvalita bude odpovídající.
9
3.5. Přístroje a zařízení
mlýnek na mák Jihokov (Česká republika)
laboratorní třepačka, model HS 250 basic, IKA Laboratortechnik (Německo)
elektronické váhy, model HF-1200G, A&D Instruments LTD (Japonsko)
analytické váhy, model GR-202, A&D Instruments LTD (Japonsko)
centrifuga Rotina 35R, Hettich (Německo)
přístroj pro přípravu deionizované vody Milli-Q, Millipore (Německo)
LC-MS instrumentace
- vysokoúčinný kapalinový chromatograf ACQUITY UPLC™, Waters (USA)
- kolona Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm i.d., 1,8 μm), Waters (USA)
- hmotnostní spektrometr QTRAP®
5500 Systems, AB SCIEXTM
(USA)
3.6. Pracovní postup
3.6.1. Příprava zásobních roztoků standardů
Standardy jsou od výrobců dodávány buď v roztoku acetonitrilu, nebo jako pevné látky
viz. Tabulka I. Pevné standardy jsou před použitím rozpuštěny v acetonitrilu či methanolu a
spolu s kapalnými standardy jsou skladovány při teplotě -18 °C. Základní roztoky standardů
a jejich koncentrace jsou uvedeny v Tabulce II. Z těchto základních roztoků standardů jsou
připraveny tři základní pracovní směsi standardů „A“-„C“ v acetonitrilu, jejich koncentrace
jsou uvedeny také v Tabulce II. Z uvedených tří pracovních směsí standardů je připraven
pracovní roztok „D“ o koncentraci 1000 ng/ml, který je dále použit k přípravě kalibračních
řad matričních a rozpouštědlových standardů a pro cílenou kontaminaci vzorků za účelem
zjištění validačních charakteristik využitých metod. Pro přípravu 25 ml pracovního standardu
je do odměrné baňky odebráno 2,5 ml směsi standardu „A“, 5 ml směsi „B“ a 12,5 ml směsi
„C“ a doplněno acetonitrilem po rysku.
10
Tabulka II: Přehled zásobních standardů analytů a jejich ředění pro přípravu pracovních
standardů.
Mykotoxin
koncentrace
standardu
[µg/ml]
pracovní směs A
(10 µg/ml)
přídavek zás. std
[µl]
pracovní směs B
(5 µg/ml)
přídavek zás. std
[µl]
pracovní směs C
(2 µg/ml)
přídavek zás. std
[µl]
aflatoxin B1 1000 100 x x
aflatoxin G1 1000 100 x x
aflatoxin B2 1000 100 x x
aflatoxin G2 1000 100 x x
nivalenol 500 200 x x
deoxynivalenol 1000 100 x x
DON-3-Glukosid 50 2000 x x
3-acetyldeoxynivalenol 1000 100 x x
fusarenon X 1000 100 x x
HT-2 toxin 100 1000 x x
T-2 toxin 1000 100 x x
neosolaniol 1000 100 x x
diacetoxyscirpenol 100 1000 x x
ochratoxin A 1000 100 x x
zearalenon 1000 100 x x
alfa-zearalenol 1000 100 x x
beta-zearalenol 1000 100 x x
sterigmatocystin 1000 100 x x
alternariol 1000 100 x x
alternariol-methylether 500 200 x x
altenuen 200 500 x x
enniatin A 100 x 500 x
enniatin B 100 x 500 x
enniatin A1 100 x 500 x
enniatin B1 100 x 500 x
ergosin 100 x x 500
ergokristin 100 x x 500
ergokristinin 25 x x 2000
ergokornin 100 x x 500
ergokorninin 25 x x 2000
ergokryptin 100 x x 500
ergokryptinin 25 x x 2000
ergotamin 100 x x 500
agroklavin 100 x x 500
3.6.2. Příprava kalibračních roztoků matričních standardů
Matriční směsné standardy sledovaných analytů (body kalibrační křivky) o
koncentracích 0 až 500 ng/ml jsou připraveny odebráním vypočítaných objemů z pracovního
standardu D obsahujícího všechny mykotoxiny do vialek, odfoukáním acetonitrilu jemným
proudem dusíku a rozpuštěním v 1 ml „blankového“ extraktu (tj. extraktu vzorku, který
neobsahuje mykotoxiny).
Kalibrační roztoky čistých i matričních standardů byly uchovány v mrazáku při teplotě
-18 °C.
11
3.6.3. Homogenizace vzorků
Laboratorní vzorek semen máku je homogenizován elektrickým mlýnkem na mák a
před odběrem navážky důkladně promíchán.
3.6.4. Extrakce a přečištění vzorků
Postup spočívá v navážení 2 g homogenizovaného vzorku semen máku, které jsou
extrahovány směsí 10 ml 0,1% HCOOH a 10 ml acetonitrilu po dobu 30 minut na třepačce při
240 rpm. Následně je přidán 1 g NaCl a 4 g MgSO4. Tato směs je třepána 3 min v ruce (díky
exotermní reakci solí s vodou se vzorek samovolně zahřívá) a poté centrifugována po dobu 10
min při 15000 x g, díky čemuž dojde k oddělení jednotlivých fází extraktu. Cílové analyty
jsou vysoleny do horní acetonitrilové vrstvy, zatímco polární matriční koextrakty (např. cukry
nebo aminokyseliny) zůstanou ve fázi vodné. Alikvotní podíl 2 ml organické fáze –
acetonitrilu je převeden do nové kyvety a následně je k němu přidáno 100 mg sorbentu –
Bondesil (modifikovaný C18 silikagel) a 300 mg síranu hořečnatého. Tato směs je třepána po
dobu 1 min a následně centrifugována po dobu 2 min při 7435 x g. Alikvotní podíl 1 ml je
filtrován přes mikrofiltr a odebrán do vialky. 1 ml finálního vzorku připraveného tímto
způsobem obsahuje 0,2 g původní matrice. Takto připravený vzorek je připraven k analýze.
Vzorky ve vialkách jsou před analýzou skladovány v mrazícím boxu při -18 C.
3.7. Identifikace a kvantifikace
Pro kvantitativní stanovení sledovaných analytů je použita metoda vysokoúčinné
kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí (UPLC-MS/MS) s
využitím kapalinového chromatografu Acquity UPLC (Waters) a hmotnostního spektrometru
QTRAP 5500 (AB SCIEXTM
).
Díky širokému rozmezí fyzikálně-chemických vlastností mykotoxinů jsou analyty
rozděleny do dvou skupin (pozitivní a negativní ESI ionizace) na základě jejich optimálních
parametrů pro MS/MS stanovení. Každý vzorek je tedy analyzován paralelně dvakrát, jednou
v ESI+ a ESI- módu s využitím různých podmínek nastavení kapalinové chromatografie i
hmotnostní detekce.
12
3.7.1. Kapalinová chromatografie
Separace analytů je prováděna za podmínek dále popsané kapalinové chromatografie na
koloně Acquity UPLC HSS T3 (Waters). Pro analyty ionizující v ESI+ a ESI- módu je
použito jiné složení mobilní fáze i jiné nastavení gradientu.
Mobilní fáze
Příprava mobilní fáze:
i) pro analyty měřené v negativním módu
- redestilovaná voda je získána přečištěním z destilované vody pomocí zařízení Milli-Q
- 5 mM vodný roztok octanu amonného se získá rozpuštěním 0,3854 g octanu amonného v
1 l redestilované vody
- čistý methanol je do systému čerpán přímo z originální láhve od výrobce
ii) pro analyty měřené v pozitivním módu
- 5 mM kyselý roztok mravenčanu amonného se získá rozpuštěním 0,3125 g mravenčanu
amonného v 1 l 0,2% kyseliny mravenčí
- kyselý methanol (0,2%) je připravován smícháním 2 ml kyseliny mravenčí a doplnění
odměrné nádoby o objemu 1 l methanolem
Stabilizace systému
- promytí kolony po dosažení nastavené teploty startovacím poměrem mobilní fáze
alespoň 15 minut
Pozn.: První dva až tří nástřiky standardu v sekvenci jsou pouze orientační a používají se k
verifikaci systému, zejména k ověření stability retenčních časů.
13
Kapalinová chromatografie pro analyty stanovované UPLC-(ESI-)-MS/MS
Parametry UPLC
Přístroj Acquity UPLC
Kolona Acquity UPLC HSS T3, (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm)
Teplota kolony 40 °C
Objem nástřiku 2 μl
Složení mobilní fáze A: 5 mM octan amonný ve vodě
B: 100 % methanol
Teplota autosampleru 10 °C
Doba analýzy 10,5 min
Gradient mobilní fáze Tabulka III
Tabulka III: Gradient mobilní fáze UPLC-(ESI-)-MS/MS
Čas (min) Průtok (ml/min) Složení mobilní fáze
A (%) B (%)
0 0,350 90 10
1 0,350 50 50
6 0,400 20 80
6,5 0,500 0 100
8,5 0,700 0 100
10,5 0,450 90 10
14
Kapalinová chromatografie pro analyty stanovované UPLC-(ESI+)-MS/MS
Parametry UPLC
Přístroj Acquity UPLCTM
Kolona Acquity UPLC HSS T3, (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm)
Teplota kolony 40 °C
Objem nástřiku 2 μl
Složení mobilní fáze A: 5 mM mravenčan amonný v 0,2% kyselině mravenčí
B: methanol, 0,2 % mravenčí kyselina
Teplota autosampleru 10 °C
Doba analýzy 13 min
Gradient mobilní fáze Tabulka IV
Tabulka IV: Gradient mobilní fáze UPLC-(ESI+)-MS/MS
Čas (min) Průtok (ml/min) Složení mobilní fáze
A (%) B (%)
0 0,350 90 10
1 0,350 50 50
9 0,500 0 100
11 0,700 0 100
13 0,450 90 10
15
3.7.2. Hmotnostní spektrometrie
Použitá technika MS/MS je spojení dvou hmotnostně-spektrometrických principů -
kvadrupólu a iontové pasti - QTRAP. Sledované analyty jsou identifikovány na základě
charakteristických fragmentačních přechodů mateřských iontů na ionty dceřiné (jednotlivé
MS přechody byly při vývoji metody naladěny pomocí základních standardů mykotoxinů).
Jednotlivé MS přechody spolu s optimálními detekčními podmínkami v Tabulce V. Pro
každou sloučeninu byl sledován jeden kvantifikační a jeden konfirmační iont.
Parametry UPLC-(ESI-)-MS/MS a UPLC-(ESI+)-MS/MS
Hmotnostní analyzátor
Přístroj QTRAP 5500
Typ tandemová MS, kvadrupól/iontová past
UPLC-(ESI-)-MS/MS
Iontový zdroj
Ionizace ESI-
Detekční mód MRM
MRM detekce 60 sec
Target scan time 0,55 sec
Needle voltage -4500 V
Source temperature 600 °C
CAD medium
UPLC-(ESI+)-MS/MS
Iontový zdroj
Ionizace ESI+
Detekční mód MRM
MRM detekce 60 sec
Target scan time 0,55 sec
Needle voltage +4500 V
Source temperature 500 °C
CAD medium
16
Tabulka V: Sledované fragmentační přechody iontů a optimální podmínky při MS/MS
Analyt tR
a
(min)
Prekursorový iont
(m/z)
DPb
(V)
Produktový
iont
kvantifikační /
konfirmační
iont (m/z)
CEc (V)
CXPd
(V)
Fusarenon X 1,9 413,10 [M+CH3COO]- -50 353,1/263,0 -14/-20 -17/-17
Nivalenol 1,5 402,0 [M+CH3COO]- -50 311,1/281 -14/-20 -15/-17
Deoxynivalenol 1,8 355,1 [M+CH3COO]- -45 295,1/265,1 -14/-20 -15/-15
α-Zearalenol 4,8 319,1 [M-H]- -110 275,0/174,0 -30/-36 -5/-9
β-Zearalenol 4,2 319,1 [M-H]- -110 275,0/175,0 -30/-37 -5/-9
Zearalenon 5,3 317,1 [M-H]- -85 175,1/131,0 -10/-10 -11/-9
3-Acetyldeoxynivalenol 2,3 397,1 [M+CH3COO]- -55 336,9/306,9 -12/-20 -17/-17
Alternariol 4,0 257,0 [M-H]- -130 214,9/213,0 -34/-31 -13/-11
Alternariol-methylether 5,6 271,0 [M-H]- -176 255,9/228,0 -71/-63 -14/-14
DON-3-Glu 1,7 517,1 [M+CH3COO]- -60 456,9/426,9 -20/-28 -23/-11
Enniatin A 8,1 699,3 [M+NH4]+ 76 228,2/210,1 59/35 16/14
Enniatin A1 8,1 685,3 [M+NH4]+ 66 214,1/210,1 59/37 10/8
Enniatin B 7,9 657,3 [M+NH4]+ 51 213,9/196,1 59/39 20/4
Enniatin B1 7,9 671,2 [M+NH4]+ 66 228,1/214,1 57/61 12/10
Ergokornin 3,1 562,1 [M+H]+ 86 223,2/268,2 57/39 10/12
Ergokorninin 3,7 562,1 [M+H]+ 86 223,2/268,2 57/39 10/12
Ergotamin 2,9 582,1 [M+H]+ 86 208,2/223,2 39/57 12/10
Ergokristin 3,8 610,1 [M+H]+ 86 223,1/208,1 57/75 10/10
Ergokristinin 4,4 610,1 [M+H]+ 86 223,1/208,1 57/75 10/10
Ergokryptin 3,7 576,1 [M+H]+ 86 268,1/223,1 37/49 8/10
Ergokryptinin 4,3 576,1 [M+H]+ 86 268,1/223,1 37/49 8/10
Ergosin 2,7 548,1 [M+H]+ 86 223,1/208,0 67/65 8/10
Neosolaniol 2,0 340,0 [M+NH4]+ 66 305,1/215,1 17/23 36/24
Diacetoxyscirpenol 3,4 384,0 [M+NH4]+ 66 307,2/105,0 15/63 16/12
Altenuen 3,3 291,1 [M-H]- -76 202,9/247,9 -13/-21 -24/-30
Aflatoxin B1 3,3 313,0 [M+H]+ 136 285,0/241,0 33/51 20/20
Aflatoxin B2 3,0 315,0 [M+H]+ 141 287,1/259,0 37/41 20/24
Aflatoxin G1 2,7 331,1 [M+H]+ 136 313,0/189,0 35/57 18/12
Aflatoxin G2 2,5 329,0 [M+H]+ 138 243,0 / 200 34/51 20/18
HT-2 toxin 4,8 442,2 [M+NH4]+ 61 263,0/215,1 17/19 30/28
T-2 toxin 5,7 484,2 [M+NH4]+ 76 305,2/215,1 19/25 20/26
Sterigmatocystin 6,3 325,0 [M+H]+ 106 310,0/281,0 35/51 20/18
Ochratoxin A 6,2 402,0 [M-H]- -91 358,1/166,8 -35/-97 -22/-12
Beauvericin 7,9 801,3 [M+NH4]+ 116 784,1/262,2 27/43 28/8
a Retenční čas
b Deklastrační potenciál
c Kolizní energie
d Napětí na výstupu z cely
17
3.7.3. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení analytů
Identifikace sledovaných analytů se provádí na základě sledování hmot (m/z)
specifických přechodů mateřského iontu na dceřiné ionty a také porovnáním retenčních časů
analytů ve vzorku s příslušnými standardy, viz. Tabulka V.
Kvantitativní vyhodnocení je založeno na metodě vnějšího standardu porovnáním
odezvových charakteristik kvantifikačních iontů analytů s příslušnými standardy pomocí
kalibrační závislosti. K vyhodnocení chromatogramů se používá program Analyst (Applied
Biosystem).
Kalibrační postup LC-MS/MS
Kvantifikace je prováděna metodou vnější kalibrace pomocí matričních kalibračních
standardů v koncentračním rozsahu 0,5 až 500 ng/ml. V případě velkých sérií vzorků je řada
kalibračních standardů analyzována opakovaně vždy po nástřiku 15-20 reálných vzorků.
Kalibrace je zpracovávána v programu Micorsoft Excel; linearity kalibračních závislostí jsou
kontrolovány pomocí regresního koeficientu (R2). Při sestavování kalibračních závislostí pro
jednotlivé analyty je nutno používat takové koncentrace standardů, aby odezvy analytů ve
vzorcích ležely v rozsahu kalibrace (mezi odezvou nejnižšího a nejvyššího bodu kalibrační
závislosti). V případě, že odezva není v rozsahu kalibrace, je nutné vzorek naředit.
3.7.4. Výpočet koncentrace analytů ve vzorku
Cvz = (Cvz1-Csl) k____
m r (Valiq / Vext)
Cvz ….…… koncentrace analytu ve vzorku (g/kg)
Cvz1 ….….. koncentrace analytu vypočítaná z kalibrační závislosti (ng)
Csl ….……. koncentrace slepého pokusu vypočítaná z kalibrační závislosti (ng)
m ………… navážka vzorku (g)
Valiq ……… objem alikvotu po přečištění (ml)
Vext ………. objem extraktu (ml)
k …………. korekce na skutečný obsah analytu ve standardu (deklarovaná čistota (%/100))
r …………. zpětná výtěžnost postupu (%/100)
18
3.8. Pracovní charakteristiky metody
3.8.1. Správnost metody
V současné době není komerčně dostupný certifikovaný referenční materiál obsahující
celé spektrum sledovaných analytů. Správnost metody je pravidelně ověřována opakovanou
analýzou uměle kontaminovaného materiálu (směsný standard přidaný ke vzorkům semen
máku bez přítomnosti nebo s minimální přítomností analyzovaných mykotoxinů). Po
přídavku roztoku se vzorek promíchá a nechá minimálně 60 min stát při laboratorní teplotě.
Následně se extrahuje příslušným extrakčním postupem. Výtěžnosti jednotlivých analytů
v semeni máku jsou uvedeny v Tabulce VI.
3.8.2. Rozsah metody a linearita
Vzhledem k tomu, že se analyzované kontaminanty mohou vyskytovat ve vzorcích v
širokém rozsahu koncentrací, je nutné volit kalibrační rozsah koncentrací standardů
v dostatečně širokém rozmezí.
V používaném kalibračním rozsahu 0,5 – 500 ng/ml pro jednotlivé analyty je odezva
detektoru za podmínek metody lineární. Linearita kalibrace se kontroluje vynesením odezev
jednotlivých analytů vůči koncentraci do grafu a pomocí regresního koeficientu (R2).
3.8.3. Mez stanovitelnosti (LOQ)
Mez stanovitelnosti je nejmenší množství stanovované látky (analytu) ve vzorku, které
může být kvantitativně stanoveno s předem definovanou přesností. Většinou se stanovuje jako
trojnásobek meze detekce. Pro uvažované aplikace je mez stanovitelnosti (LOQ = limit of
quantification) zpravidla brána jako nejnižší hladina kalibrační křivky (použitého standardu o
nejnižší koncentraci). LOQ všech analyzovaných mykotoxinů jsou uvedeny v Tabulce VI.
Meze stanovitelnosti, při stanovení metodou UHPLC-MS/MS, pro jednotlivé analyty byly
zjištěny pomocí nástřiku kalibrační řady standardů.
19
3.8.4. Opakovatelnost metody
Opakovatelnost metody lze charakterizovat relativní směrodatnou odchylkou (RSDr,
CVr), která se získá z opakovaných analýz vzorku. Pro koncentrace nižší než 5 g/kg nesmí
být RSDr > 20 %; pro koncentrace v rozmezí 5-100 g/kg musí být hodnota RSDr < 15 %;
při koncentracích nad 150 g/kg musí být hodnota RSDr < 11 %. Uvedené hodnoty jsou
stanoveny interními předpisy Metrologické a zkušební laboratoře 1316.2 a jsou přísnější než
výkonnostní kriteria metod, jak jsou uvedeny v Nařízení komise (ES) č. 401/2006. Hodnoty
RSDr (%), které byly získány pro validované matrice, jsou uvedeny v Tabulce VI.
20
Tabulka VI: Pracovní charakteristiky metody UHPLC-MS/MS pro stanovení mykotoxinů
v semeni máku (přídavek standardu do semen máku neobsahujících mykotoxiny na hladině
100 ng/g, n=6).
Mykotoxin Výtěžnost (%) LOQ (ng/g)
RSDr (%) Semena máku
3-acetyldeoxynivalenol 101 25 2,9
Aflatoxin B1 91 2,5 2,6
Aflatoxin B2 90 2,5 1,5
Aflatoxin G1 88 2,5 2,0
Aflatoxin G2 84 2,5 5,9
Alternariol 137 2,5 2,7
Alternariol-methylether 124 2,5 2,6
Altenuen 127 5,0 8,1
Deoxynivalenol 126 25 7,2
Diacetoxyscirpenol 116 25 6,6
DON-3-Glukosid 51 25 10,9
Enniatin A 72 2,5 10,3
Enniatin A1 75 2,5 9,8
Enniatin |B 74 2,5 11,4
Enniatin B1 77 2,5 11,2
Ergokornin 149 25 8,6
Ergokorninin 64 2,5 12,9
Ergokristin 90 2,5 14,9
Ergokristinin 64 2,5 14,7
Ergokryptin 126 25 6,4
Ergokryptinin 66 25 14,9
Ergosin 77 5,0 11,1
Ergotamin 74 2,5 10,8
Agroklavin 115 5 7,0
Fusarenon-X 96 2,5 10,2
HT-2 toxin 122 25 6,3
Neosolaniol 132 25 5,5
Nivalenol 86 50 9,6
Ochratoxin A 119 25 6,5
Sterigmatocystin 88 2,5 8,1
T-2 toxin 113 5 6,3
Zearalenon 128 2,5 3,5
α-zearalenol 126 2,5 4,5
β-zearalenol 138 2,5 3,0
21
4. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU
Pro stanovení mykotoxinů v semeni máku nebyl v praxi dosud zaveden žádný
analytický postup, díky kterému by bylo možné v krátkém čase stanovit 34 mykotoxinů.
Izolace analytů z matrice semen máku vychází z inovativní metody QuEChERS (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged, Safe), která je již delší dobu používána v laboratořích Ústavu
analýzy potravin a výživy pro multimykotoxinové stanovení cereálií a krmiv. Tato metoda
byla z důvodu vysokého obsahu lipidických látek v semeni máku modifikována a pro tuto
matrici je používáno přečištění extraktu pomocí modifikované disperzní extrakce na tuhou
fázi (Bondesil- modifikovaný C18 silikagel), které slouží k vyvázání nepolárních koextraktů.
Výhoda výše uvedené metodiky spočívá v použití neselektivní extrakce vzorků,
umožňující získání širokého spektra analytů s různými chemickými vlastnotmi a odstranění
složek matrice rušící následující analytické stanovení. Je zde použita citlivá instrumentace
pracující na principu ultraúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou
hmotnostní detekcí UHPLC-MS/MS. Použité přístroje umožňují separaci a detekci 34 analytů
s nízkými detekčními limity. Uvedená metoda může zajistit velmi operativní a rychlé analýzy
vzorků v rámci nezbytné kontroly potravin, ale také širší monitoring výše uvedených toxinů.
Získané výsledky mohou dále přispívat k rozšíření znalostí o výskytu mykotoxinů v semeni
máku na území ČR.
22
5. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY
Multimykotoxinová metoda na principu UHPLC-MS/MS je vhodná ke stanovení
mykotoxinů ve vzorcích semen máku a dalších matric na podobné bázi, které obsahují vyšší
obsah lipidických látek. Metodika je výsledkem řešení výzkumného projektu č. QH92106
Pěstitelské systémy u máku se zaměřením na kvalitu a bezpečnost ekologické a
integrované produkce. Metoda může být využita pro rutinní analýzy jak ve státních, tak
v soukromých laboratořích a výzkumných centrech, díky její jednoduché a rychlé aplikaci.
Vzhledem k tomu, že obsah mykotoxinů v máku není dosud legislativně regulován,
popisovaná metoda by významně přispěla k získání dostatečného množství relevantních dat.
Na základě výsledků by mohlo být posouzeno potenciální zdravotní riziko pro populaci a
zavedeny příslušné legislativní opatření.
23
6. EKONOMICKÉ ASPEKTY
Při bilanci ekonomických aspektů bylo předpokládáno, že laboratoř, která chce
uvedenou metodu zavést, již má zkušenosti s analýzou na systémech LC-MS a vlastní tak
kapalinový chromatograf s tandemovým hmotnostním spektrometrem. Ultraúčinný
kapalinový chromatograf (UHPLC) umožní laboratoři úsporu jak času, tak i použitých
chemikálií a rozpouštědel, náklady na jeho pořízení se pohybují kolem 1100 tis. Kč. Dále je k
samotnému provedení analýzy potřebné běžné vybavení laboratoře, viz kapitola 3.4 a 3.5,
další investice proto nejsou zapotřebí.
Implementace metody zahrnuje zjištění aktuálních pracovních charakteristik, zejména
zjištění limitů kvantifikace, linearity, ale také verifikaci metody pomocí přídavku mykotoxinů
na předem známou hladinu (např. 100 µg/kg) a zjištění výtěžnosti, případně i opakovatelnosti
metody (např. n=6). Za předpokladu, že by bylo provedeno 20 verifikačních a kontrolních
analýz, přičemž provozní náklady na jednu analýzu by byly 2405 Kč, celkové náklady na
implementaci by se rovnaly 48,7 tis. Kč. Pokud laboratoř UHPLC-MS/MS zařízení nevlastní
pohybují se celkové náklady na zavedení výše uvedené metody ve výši 8903 tis. Kč.
24
7. SEZNAM SOUVISEJÍCÍ POUŽITÉ LITERATURY
Nařízení komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální
limity některých kontaminujících látek v potravinách.
Nařížení komise (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února 2006, kterým se stanoví metody odběru
vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách.
Anastassiades M, Lehotay S, Stajnbaher D, Schenck F, Fast and easy multiresidue method
employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the
determination of pesticide residues in produce, Journal of AOAC, 2003, 86, 412-431.
Beltran E., Ibanez M., Sancho J. V., Hernandez F.: Determination of mycotoxins in different
food commodities by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to triple quadrupole
mass spectrometry; Rapid Commun. Mass Spectrometry, 2009, 23, 1801–1809.
Lehotay, S. J.; Mastovska, K.; Yun, S. J. Evaluation of two fast and easy methods for
pesticides residue analysis in fatty food matrixes. Journal of AOAC International 2005, 88,
630-638.
Sulyok M., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R.: A liquid chromatography/tandem mass
spectrometric multi-mycotoxin method for the quantification of 87 analytes and its application
to semi-quantitative screening of moldy food samples; Analytical and Bioanalytical
Chemistry, 2007, 389, 1505–1523.
25
8. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELI
METODICE
Vepříková Z., Malachová A., Zachariášová M., Kostelanská M., Poustka J., Hajšlová J.,
Kontaminace máku mykotoxiny,Skalský dvůr, 4.-6.5.2010, ISSN 1802-1433
Vepříková Z., Zachariášová M., Kostelanská M., Džuman Z., Hajšlová J.: Stanovení
mykotoxinů ve vzorcích máku zakoupených v maloobchodní síti v roce 2011, XLI.
Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr, 23. - 25.5. 2011,
ISSN 1802-1433
Vepříková Z., Zachariášová M., Kostelanská M., Džuman Z., Hajšlová J.: Analysis of
mycotoxins in poppy seeds, 5th
International Symposium on Recent Advances in Food
Analysis, Praha, Česká republika, 1.–4. 11. 2011, ISBN 978-80-7080-795-8
26
9. AUTOŘI A OPONENTI
Metodu zpracovali:
Ing. Zdenka Vepříková, Ing. Marta Václavíková, PhD., Ing. Milena Zachariášová, PhD.,
Prof. Ing. Jana Hajšlová, CSc.
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze,
Ústav analýzy potravin a výživy, FPBT
Technická 3, 166 28 Praha 6 – Dejvice
Oponenti:
1) Ing. Radim Štěpán, Ph.D., Inspektorát SZPI v Praze, NRL
Za Opravnou 4, 150 06 Praha – Motol
2) Ing. Kateřina Lancová,Ph.D., Masarykova univerzita, Středoevropský technologický
institut, Kamenice 753/5, 625 00 Brno
Červenec 2012, Praha
27
Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková, Marta Václavíková, Milena Zachariášová
UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Stanovení mykotoxinů v semeni máku
Vydala: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Technická 5, 166 28 Praha 6
Recenzenti: Ing. Radim Štěpán, Ph.D., Ing. Kateřina Lancová, Ph.D.
Rok vydání: 2012
Počet stran: 27
Elektronická verze publikace ve formátu PDF na CD-ROM.
