35
UPLATNN CERTIFIKOVAN METODIKA
. 94/2018
Pentaplexn diagnostick qPCR systmy pro simultnn identifikaci a kvantifikaci tkn vznamnch a minoritnch
druh hospodskch zvat s definovanou monost vyuit pro kontrolu etickch poadavk halal potravin
Autoi
Ing. Gabriela Boilov, Ph.D. Ing. Michaela Nesvadbov, Ph.D.
Mgr. Petr Krlk, Ph.D. Mgr. Bc. Monika Petrkov
Metodika byla vytvoena na zklad vsledk een projektu Ministerstva zemdlstv NAZV QJ1530107.
Tento vzkum byl finann podpoen Ministerstvem kolstv, mldee a tlovchovy R v rmci projektu CEITEC 2020 (LQ1601).
Osvden o uplatnn certifikovan metodiky: 6/2018 Vydalo: Sttn zemdlsk a potravinsk inspekce (SZPI), Kvtn 15, 603 00 Brno
ISBN 978-80-88233-36-7 2018
http://www.vfu.cz/lide/vyhledavani-lidi.html#_|_nesvadbov%C3%A1%7C_|_all|_all|_http://www.vfu.cz/lide/vyhledavani-lidi.jsp#_|_Petr%C3%A1kov%C3%A1%7C_|_all|_all|_Oponenti certifikovan metodiky: Prof. RNDr. Ale Knoll, Ph.D. stav fyziologie, morfologie a genetiky zvat Mendelova univerzita v Brn Mgr. Lenka Bartoov, Ph.D. Odbor laborato stednho inspektortu Sttn zemdlsk a potravinsk inspekce
I. CL METODIKY
Certifikovan metodika nabz standardizovan postup detekce tkn 18 hospodsky
vznamnch ivoinch druh: prase domc (Sus scrofa), tur domc (Bos taurus), ovce
domc (Ovis aries), koza domc (Capra hircus), k domc (Equus caballus), buvol domc
(Bubalus bubalis), osel domc (Equus asinus), krlk domc (Oryctolagus cuniculus), zajc
poln (Lepus europaeus), klokan (Macropus), krokodl (Crocodylus), kur domc (Gallus
gallus), krta domc (Meleagris gallopavo), husa domc (Anser anser), kachna domc (Anas
platyrhynchos), kepelka japonsk (Coturnix japonica), ptros dvouprst (Struthio camelus) a
perlika kropenat (Numida meleagris), kter je zaloen na ptomnosti vybranch uniktnch
sekvenc ve struktue DNA (kyselina deoxyribonukleov). Metodu lze pout pro detekci vech
typ tkn, kter mohou bt hlavn i vedlej surovinou obsaenou v potravinch a krmivech;
mezi tyto tkn pat svalovina, tuk, chrupavky, vnitnosti, krev a krevn derivty, ke a jej
derivty, steva, mezenterium, plazma, elatina a proteiny. DNA pedstavuje oproti proteinm
stabiln molekulu, kterou je mon v rznm stupni fragmentace extrahovat i z technologicky
zpracovanch potravin a krmiv (tj. i z potravin vyrobench s vyuitm vysokho stupn
mlnn surovin, rznch rovn tepeln pravy i za pouit vysokho tlaku). Nov navren
pentaplexn qPCR eseje, zaloen na principu detekce vybranch sek genomov DNA, jsou
vysoce citliv; lze jimi prokzat ptomnost tkn danch druh pi koncentraci DNA 0,05
ng/l. Certifikovan metodika je pln vyuiteln nejen pro ely kontroly sloen a ovovn
autenticity potravin a krmiv, ale tak pro kontrolu produkt farmaceutickho nebo
kosmetickho prmyslu, kter pracuj se stejnou surovinovou zkladnou. II. VLASTN POPIS METODIKY
0. Pedmluva Monost komplexn analzy pro oven autenticity a zdravotn nezvadnosti potravin a krmiv
pat k zkladnm principm ochrany veejnho zdrav i ekonomickch zjm spotebitel.
Prkaz kvality a autenticity potravin a krmiv a s tm spojen een metodickch postup pro
odhalovn falovn potravin a krmiv pat mezi klov clov oblasti aplikovan vdy a
vzkumu. Akoli je falovn potravin zpravidla motivovno finannm ziskem, jeho
dsledkem me bt nejen snen kvality a jakosti produkt, ale i pm ohroen veejnho
zdrav. U vybranch typ potravin pak falovn postihuje i aspekt nboensk, etick i
sociln, kter mohou bt klov v ivotnm stylu specifickch komunit spotebitel.
Tradin postupy pro zajiovn bezpenosti a kvality potravin zaloen na detekci nebezpe
a jeho eliminaci v prbhu vroby nejsou vhodn pro prevenci zmrnho falovn, kter je
zaloen na zcela jinm principu. V souasnosti je rozvinut pedevm oblast identifikace
nebezpe s nslednou reakc na jejich ptomnost. Ekonomicky motivovan falovn vdy
definuj ti faktory: 1) monost falovn provst; 2) motivace - finann zisk; 3) absence
kontrolnch mechanism (vnitn systmy, standardy, analytika, apod.). Je zejm, e pro
zajitn zdravotn nezvadnosti a potvrzen autenticity potravin a krmiv je nezbytn nutn
rozvjet strategii prevence, tedy omezen pleitost k falovn a zamezen monost vyuit
zpsob falovn. K dosaen tohoto cle se jev jako nezbytn zaveden multidisciplinrnho
pstupu, kter slou analytick postupy (laboratorn analzy) s poznatky z obor technologie
vroby potravin a krmiv, psychologie a kriminologie a aplikace potravinovho a obchodnho
prva. Tento pstup by ml bt implementovn do strategickch dokument a kontrolnch
systm ve form revize standard pro bezpenost potravin a krmiv ve vech segmentech od
prvovroby pes zpracovatele a po globln distributory, a to jak v oblasti prodeje, tak v oblasti
gastronomie.
V dsledku stle se roziujcho globlnho trhu se jako nov clov oblast jev tak falovn
potravin pro konzumenty se specifickmi nboenskmi, socilnmi nebo kulturnmi
poadavky. Typickou komoditou jsou tzv. halal potraviny, suroviny a krmiva. Definice halal
potravin je soust islmskho prva, kter rozdluje potraviny na halal (povolen) a haram
(zakzan) (Ceranic a Bozinovic, 2009). Poet pslunk hlscch se k islmu pedstavuje asi
tvrtinu celkov svtov populace a kadm rokem se poet muslim zvyuje (Hackett et al.,
2015). Souasn tak narstaj i poadavky na produkci halal potravin a tm i tlak na kontrolu
jejich autenticity s clenou detekc ptomnosti nepovolench sloek. S rostoucm potem
vrobc i distributor halal potravin a tak se zvyujcm se potem gastro-provoz nabzejcch
halal menu, pak logicky narst problm monho falovn tchto produkt obsahujcch
ivoin sloky. Toto falovn (a u zmrn z ekonomickch dvod nebo nezmrn
zpsoben vlivem neznalosti nboenskch pravidel) me zahrnovat napklad pidn
vepovho masa, vnitnost, tuku i k do masnch vrobk i pouit vepovch stev jako
obal, nebo pidn sloek, kter pochz z prasat plazma, elatina, proteiny, kon derivty,
kter mohou bt pouvny jak masnm tak pekrenskm, cukrrenskm i lahdkskm
prmyslu, v gastronomickch provozech i ve farmaceutickm a kosmetickm prmyslu.
Vvoj rychl, spolehliv, vysoce citliv a asov i ekonomicky pouiteln metody pro detekci
a identifikaci tkn 18 vznamnch a minoritnch ivoinch druh byl identifikovn jako
jeden z klovch cl projektu NAZV QJ1530107 a certifikovan metodika Pentaplexn
diagnostick qPCR systmy pro simultnn identifikaci a kvantifikaci tkn vznamnch a
minoritnch druh hospodskch zvat s definovanou monost vyuit pro kontrolu etickch
poadavk halal potravin dokladuje jeho spn splnn.
0.1. Sekvence genu Primery a sondy byly navreny pomoc programu Oligo 7 (Rychlik, 2007).
0.1.1. BRAP (BRCA1 associated protein) Protein, kter je kdovn genem BRAP je cytoplazmatick protein, kter je schopen regulovat
transport blkovin do bunnho jdra tm, e zadruje proteiny obsahujc jadern lokalizan
signl v cytoplazm. Tento protein kontroluje rzn druhy mezibunnch signl. Je
povaovn za prahov modultor, kter kontroluje citlivost MAPK signalizan drhy, m
udruju homeostzu v tkovm prosted a d jadernou translokaci nuklernho faktoru kappa
B (NF-B). Gen BRAP je asociovn tak s nkolika onemocnnmi, kter jsou zpsobeny
zntlivmi zmnami vetn infarktu myokardu, aterosklerzy karotidnch arteri nebo
centrln obezity (Zhang et al., 2014). Sekvence primer a sondy pro BRAP qPCR identifikace perlika (Numida meleagris):
RT_F80: 5 GCA GCG CTG GCG TTA AGT TCC 3
RT_R80: 5 CCA CTA AAA AGA GCC CGG CAC C 3
RT_P80: 5 CY5 CGT GGG TGG GAA GTT TGA GGG CAG G BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu BRAP v rozsahu 564 696 bp (Acc. No.
NC_034422.1:c6468096-6453599) a dlka vslednho amplikonu je 133 bp. 0.1.2. F2 (coagulation factor II, thrombin) Gen F2 kduje koagulan faktor II (protrombin), glykoprotein, kter je syntetizovan v jtrech
jako inaktivn prekurzor enzymu (zymogen), jeho tvorba zvis na ptomnosti vitaminu K.
Protrombin je dle aktivovn na serinov protezov trombin, kter je hlavnm enzymem
koagulan kaskdy a hraje dleitou roli pi homeostze a trombze pemuje fibrinogen
na fibrin pi tvorb krevnch sraenin, stimuluje agregaci krevnch destiek a aktivuje
koagulan faktor V, VIII a XIII. Mutace v genu F2 zpsobuj rzn formy trombzy a
dysprotrombinmie (Lancellotti a De Cristofaro, 2009).
Sekvence primer a sondy pro F2 qPCR identifikace husa (Anser anser):
RT_F21: 5 CTT GTG CGT GCT CTT CTC CCT GA 3
RT_R21: 5 CGT GTT CAG AGC AGT GTA GAT GTC C 3
RT_P21: 5 HEX CTC AAA CAT CAT TCC TCT GTC ATT CTC ACG GGG TG BHQ2
3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu F2 v rozsahu 5863 5996 bp (Acc. No.
NW_013185657.1:10766418-10778807) a dlka vslednho amplikonu je 134 bp.
0.1.3. HPX (hemopexin) Produktem genu HPX (hemopexin) je glykosylovan protein s nejvy znmou vazebnou
afinitou k hemu, jeho funkce spov v transportu hemu z plazmy do jater a podl se tak na
ochran bunk ped oxidanm stresem prostednictvm endocytzy LRP1 protein, kter vede
ke katabolismu hemov oxygenzy 1 (heme oxygenase-1) a nslednmu uvolnn eleza
z feritinu (Lawson et al., 2017).
Sekvence primer a sondy pro HPX qPCR identifikace zajc (Lepus europaeus):
RT_F68: 5 CTC CCT CTA GTC TGT CCT GTA GC 3
RT_R68: 5 ATA CAA TAG AAT TCA GCA GTA AGG TTC ATG 3
RT_P68: 5 ATTO425 ATC CTT GAC TCT CCC CAC TGC CCT TAT GAT DAB 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu HPX v rozsahu 411 540 bp (Acc. No.
FJ811725.1) a dlka vslednho amplikonu je 130 bp. 0.1.4. MICAL1 (microtubule associated monooxygenase, calponin and LIM domain
containing 1)
Produkt genu MICAL1 (microtubule associated monooxygenase, calponin and LIM domain
containing 1) pat do rodiny multidomnovch protein MICAL, kter se podlej na kontrole
dynamiky cytoskletu a s tm souvisejcch zkladnch biologickch procesech, jako je nap.
kontakt bunk, bunn diferenciace a migrace, rst axon, vtven dendrit, formovn
neuromuskulrnch spoj, angiogeneze, transport vk a tak genov transkripce (Vitali et al.,
2016).
Sekvence primer a sondy pro MICAL1 qPCR identifikace prase (Sus scrofa):
RT_F3: 5 CCC CGC AAA TCC CTC AAC CA 3
RT_R3: 5 TTC CAC TTC CCA TCA CCA AAA CTA CC 3
RT_P3: 5 HEX CTG ACT TGC CAC CGC TCA CAG CCG AG BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MICAL1 v rozsahu 1046 1203 bp (Acc. No.
NC_010443.5:c75522760-75511692) a dlka vslednho amplikonu je 158 bp.
Sekvence primer a sondy pro MICAL1 qPCR kur (Gallus gallus):
RT_F17: 5 TTC ACA GCC TCG TTG CTT CCT CAT 3
RT_R16: 5 AGG CAG CAT GGA GAG TTT GTT CG 3
RT_P14: 5 ATTO425 TGC CCC CAA GTG AGC CCC CAG TGC DAB 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MICAL1 v rozsahu 8111 8262 bp (Acc. No.
NC_006113.5:29839-40913) a dlka vslednho amplikonu je 152 bp.
Sekvence primer a sondy pro MICAL1 qPCR klokan (Macropus):
RT_F67: 5 CTT GGA TGT GGT ACA GGG GCA GAG 3
RT_R367: 5 GTG TCA ACA TCC CAG CAT GCA CGC 3
RT_P67: 5 ROX AGT GGT TGA GGG ATG GAG CTG GGT GTA GG BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MICAL1 v rozsahu 6118 6205 bp (Acc. No.
ENSMEUG00000004627) a dlka vslednho amplikonu je 88 bp. 0.1.5. MICALL1 (MICAL like 1) Produkty genu MICALL1 nle do skupiny protein vzajcch lipidy s vy afinitou pro
kyselinu fosfatidovou. Na endozomln membrn mohou psobit produkty genu MICALL1
jako downstreamov efektor protein Rab, kter prostednictvm cytosolickch protein
reguluj tubulaci membrny. Dle se mohou podlet na pozdn fzi endocytzy a nepmo hrt
roli v rstu neurit (Giridharan et al., 2013).
Sekvence primer a sondy pro MICALL1 qPCR identifikace ovce (Ovis aries):
RT_F62: 5 CTC AGC CTG TGG CCA GTG CTG 3
RT_R62: 5 CCT TGA AGA TGA GGT GAC CAG GCC 3
RT_P62: 5 HEX CCA CGT GGG AAG TGC TGT GTC AGA GGG BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MICALL1 v rozsahu 2253 2343 bp (Acc.
NW_011942415.1:c2949713-2922279) a dlka vslednho amplikonu je 91 bp.
0.1.6. MED17 (mediator complex subunit 17)
Gen MED17 kduje jednu z 25 podjednotek tvoc preinician meditorov komplex
transkripce. Meditorov komplex zprostedkovv penos informac z transkripnch faktor,
kter dok rozpoznat DNA enhancer (zesilova) a tmto zpsobem pmo regulovat iniciaci
transkripce pomoc RNA polymerzy II (Hirabayashi et al., 2016). Sekvence primer a sondy pro MED17 qPCR identifikace krta (Meleagris gallopavo):
RT_F50: 5 GGT GCT GCC CTT GGG TCA C 3
RT_R50: 5 CCA GGT CCC TTT CTG CCA AGC 3
RT_P50: 5 FAM CAG CAA TAC AGG CGT GGG AAA GAG TGG C BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MED17 v rozsahu 1635 1724 bp (Acc. No.
NC_015011.2:c180858832-180845598) a dlka vslednho amplikonu je 90 bp. 0.1.7. MMAB (metabolism of cobalamin associated B) Gen MMAB kduje protein kobalamin adenosyltransferzu (ATR), kter katalyzuje finln krok
v pemn vitamnu B12 prostednictvm penosu adenosylov skupiny z ATP na kobalamin
za vzniku adenosylkobalaminu (AdoCbl) a tak slou jako chaperon pi penosu AdoCbl na
methylmalonyl-CoA-mutzu (MCM). Mutace v tomto genu jsou pinou methylmalonov
acidurie (Illson et al., 2013).
Sekvence primer a sondy pro MMAB qPCR identifikace koza (Capra hircus):
RT_F84: 5 GCA CTT CTG TCG GGC CGT GTG 3
RT_R84: 5 CAC CGC CCC CTC CAA CTG C 3
RT_P84: 5 ROX CGA GCT GAG AGA CGG TAC AGG GCC TC BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu MMAB v rozsahu 8625 8714 bp (Acc. No.
NC_030824.1:c7494575-7482857) a dlka vslednho amplikonu je 90 bp.
0.1.8. PHKA2 (phosphorylase kinase regulatory subunit alpha 2) Gen PHKA2 kduje alfa podjednotku fosforylzy-kinzy, kter hraje hlavn roli pi regulaci
rozkladu glykogenu. Podjednotky, kter jsou kdovny genem PHKA2 v jtrech a PHKA1 ve
svalov tkni, prostednictvm fosforylace, reguluj aktivitu katalytickch podjednotek gama,
kter obsahuj aktivn msto enzymu a pln tak funkci fosforylzy-kinzy. Mutace v tomto genu
jsou pinou jatern glykogenzy zpsobujc nedostatek enzymu glykogensyntetzy v jtrech
(Choi et al., 2016).
Sekvence primer a sondy pro PHKA2 qPCR identifikace krlk (Oryctolagus cuniculus):
RT_F74: 5 GCG ACA ACA CTG CAG AGC ACC 3
RT_R74: 5 CTA AAG GGC TTC GGT GAG ATG GTA TC 3
RT_P74: 5 FAM AGT GTC AGC AGA GTC GCC GAG TAT CAG C BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu PHKA2 v rozsahu 25152 25233 bp (Acc.
No. NC_013690.1:c4749748-4678201) a dlka vslednho amplikonu je 82 bp. 0.1.9. RPS7 (ribosomal protein S7) Ribozomy jsou organely bunk katalyzujc syntzu protein, kter jsou sloeny z mal (40S)
a velk (60S) podjednotky. Tyto podjednotky se skldaj ze 4 druh RNA a piblin 80
strukturn odlinch protein. Gen RPS7 kduje ribozomln protein, kter je soust mal
podjednotky (40S) ribozom. Tento gen se dle podl na regulaci apoptzy bunk a progresi
p53 bunnho cyklu. Prostednictvm signln drhy PI3K/AKT a MAPK, produkty genu
RPS7 mohou tak psobit jako tumor supresory u karcinomu vajenk (Zhang et al., 2016).
Sekvence primer a sondy pro RPS7 qPCR tur (Bos taurus):
RT_F29: 5 GCC CTT TGC CCA CCA CAG C 3
RT_R29: 5 CCC GTG AGC TTC TTA TAG ACA CCA 3
RT_P29: 5 FAM CTA CCG TCC CCT GTG TGT GTT GTG ACC ATT BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS7 v rozsahu 4978 5096 bp (Acc. No.
NC_037335.1:c110992366-110987214) a dlka vslednho amplikonu je 119 bp.
Sekvence primer a sondy pro RPS7 qPCR buvol (Bubalus bubalis):
RT_F41: 5 GTA GAG GGA AGA GCG GTG AGG 3
RT_R41: 5 CTC AAA TCG ACA GCA AAA GTA AAC AAT G 3
RT_P41: 5 ATTO425 CAG TGG GCG CGG TGG GGT AAA GCA DAB 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS7 v rozsahu 2667 2777 bp (Acc. No.
NC_037547.1:c173616710-173610980) a dlka vslednho amplikonu je 111 bp.
Sekvence primer a sondy pro RPS7 qPCR ptros (Struthio camelus):
RT_F34: 5 GCC TGG TGC CTC TTG TCC TGT 3
RT_R34: 5 AAA TCT CCC ATC TCT CAA TCC TCT CG 3
RT_P34: 5 ATTO425 CTG GCC CCA TCC TCT CGA CAC CCT CC DAB 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS7 v rozsahu 2011 2138 bp (Acc. No.
NW_009270584.1:328779-335836) a dlka vslednho amplikonu je 128 bp.
0.1.10. RPS14 (ribosomal protein S14)
Gen RPS14 kduje ribozomln protein, kter je soust mal podjednotky (40S) ribozom.
Tento gen je zapojen v 5q syndromu, kter je zpsoben delec dlouhho ramnka chromozomu
5 u lid. Produkty tohoto genu negativn reguluj aktivitu c-Myc, kter je nezbytn pro normln
bunn rst a vvoj u savc. Nadmrn exprese c-Myc zvyuje onkogenezi bunk, naopak
deficience zpsobuje, e buky vystupuj z bunnho cyklu a blokuj bunnou proliferaci.
Produkty genu RPS14 prostednictvm pm inhibice transkripn aktivity ovlivuj funkci c-
Myc zprostedkovnm degradace mRNA pomoc miRNA (Zhou et al., 2013).
Sekvence primer a sondy pro RPS14 qPCR identifikace k (Equus caballus):
RT_F32: 5 CCA GTG CCC TCA CGT GTG ATC T 3
RT_R32: 5 AGA AGA GAG CTG GAT CAT TAG ACT GAG 3
RT_P32: 5 CY5 TCA GCT CAA AGG AAG AGG ACG TGT TAG CCC BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS14 v rozsahu 5300 5430 bp (Acc. No.
NC_009157.3:26891344-26897275) a dlka vslednho amplikonu je 131 bp.
Sekvence primer a sondy pro RPS14 qPCR identifikace osel (Equus asinus):
RT_F76: 5 GGA GTC AGG ATT CTT TGG TTT CAG G 3
RT_R76: 5 CCA GGA TGT ACC CTT CCA GAT GG 3
RT_P76: 5 FAM CCG GGT GAG GTT CTG CTG TCT CTG TCT TCT BHQ1 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS14 v rozsahu 1369 1472 bp (Acc. No.
NW_014638069.1:c1889717-1883571) a dlka vslednho amplikonu je 104 bp. 0.1.11. RPS21 (ribosomal protein S21) Gen RPS21 kduje ribozomln protein, kter je soust mal podjednotky 40S ribozom,
kter je sloen z 18S rRNA a 33 proteinovch podjednotek. Protein nle k rodin
ribosomlnch protein S21E a hraje dleitou roli pi iniciaci translace, podl se na regulaci
syntzy blkovin a rstu bunk (Verras et al., 2004).
Sekvence primer a sondy pro RPS21 qPCR identifikace kepelka (Coturnix japonica):
RT_F35: 5 GCT CGG TTC GGT CCA TCC AC 3
RT_R35: 5 GCC ACA GCC CCT TTC TCA TCC 3
RT_P35: 5 ROX CGG AAA TGG TGA GTG GGG CTG CGG TAT T BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu RPS21 v rozsahu 329 444 bp (Acc. No.
NC_029535.1:c7098188-7094238) a dlka vslednho amplikonu je 116 bp.
0.1.12. SERPINE3 (serpin family E member 3) Produkty genu SERPINE3 pat do velk skupiny inhibitor serpinovch protez, kter nle
do skupiny inhibitor serinovch protez. Serpiny hraj roli ve vytven sprvnho
mikroprosted pro rst a roziovn tumor a pi lokalizaci metastz rakoviny prsu a plic
(witnicki et al., 2016).
Sekvence primer a sondy pro SERPINE3 qPCR identifikace kachna (Anas platyrhynchos):
RT_F26: 5 GTG ATT TTC CAC TCA TCG CTC CAT T 3
RT_R26: 5 GGA AAT CCA ATA ATG TCT CAG AAA CTC ACA 3
RT_P26: 5 CY5 TGA GTC CTG GGT AAA TCA AGG GGA GGG AAA GT BHQ2
3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu SERPINE3 v rozsahu 1485 1605 bp (Acc.
No. NW_004677545.1:59514-69324) a dlka vslednho amplikonu je 121 bp. 0.1.13. TRIB1 (tribbles pseudokinase 1) Tribbles proteiny nle u savc do rodiny protein, kter nevykazuj dnou detekovatelnou
kinzovou aktivitu a psob pedevm jako molekulrn adaptry regulujc jin kinzy anebo
jejich cle. Produkty genu TRIB1 hraj roli v metabolismu lipid, lipoprotein i glukzy a jsou
spojeny se steatzou jater nebo leukmi (Soubeyrand et al., 2017).
Sekvence primer a sondy pro TRIB1 qPCR identifikace krokodl (Crocodylus):
RT_F75: 5 GGA CTG CTT TAG AGA CAT TAG ATT TCA TAG 3
RT_R75: 5 GTT CTT TCC ATT ATT AAT GTT GCT TGC TTG C 3
RT_P75: 5 HEX AGA TCA TCG AGT CCA GCC CCC TTT ACC TTG BHQ2 3
Tmito primery je mon amplifikovat st genu TRIB1 v rozsahu 1906 2033 bp (Acc. No.
NW_017728886.1:253501338-253506930) a dlka vslednho amplikonu je 128 bp.
0.2. Intern amplifikan kontrola Slou ke sledovn inhibice vlastn PCR, co umon odhalit falen negativn vsledek reakce.
Sekvence primer a sondy pro IAC:
IAC nep/F57F: 5 AGA GGA CCG GGA TAT TCG AC 3
IAC nep/F57R: 5 AGG TAG TCC GAG GAA AAC TCT AAA C 3
IAC qPCRTM: 5 Cy5 GGC TCT TCT ATG TTC TGA CCT TGT TGG A BHQ 3
Dlka vslednho amplikonu je 141 bp.
1. Pedmt a psobnost Tato metodika je zvazn pro izolaci DNA ze vzork ivoinch tkn (tj. svalovina, tuk,
chrupavka, vnitnosti, krev a krevn derivty, ke a jej derivty, steva, mezenterium, plazma,
elatina, proteiny), ze vzork potravin, potravinovch surovin ivoinho pvodu
a krmiv, kter jsou urena pet zvata, a to za elem qPCR identifikace 18 druh
hospodskch zvat.
Podstata zkouky Podstatou zkouky je izolace DNA sledovanho agens z testovanho vzorku pomoc
komernho kitu a systm multiplexnch kvantitativnch PCR (qPCR) s intern amplifikan
kontrolou (IAC).
Vyvinut metoda je schopna identifikovat nsledujc tkn nebo jejich komponenty 18 druh
hospodskch zvat:
svalovina pouit masa pro ely vivy lid nebo zvat
tuk surovina pro vrobu masnch vrobk nebo i ostatnch typ potravin (nap.
pekrensk nebo cukrsk vrobky), pouit v restauracch a gastroprovozech pro
tepelnou pravu smaenm nebo restovnm nebo jako soust vaench pokrm
ke a jej derivty kon emulze, pouit do masnch vrobk
vnitnosti pouit do masnch vrobk; pouit jako vedlej suroviny ivoinho
pvodu do krmiv pro zvata
steva prodn (jedl) obalov materil pro masn vrobky, mohou se pouvat jako
vedlej suroviny ivoinho pvodu do krmiv pro zvata
mezenterium obalov materil pro kulinrn vyuit
krev surovina do masnch vrobk; me se pouvat jako vedlej surovina
ivoinho pvodu do krmiv pro zvata
plazma nhrada masa do masnch vrobk
elatina surovina pro potravinsk, kosmetick nebo farmaceutick prmysl
proteiny surovina pro produkci enzym pro farmaceutick a kosmetick prmysl
2. Mc prostedky sada pipet:
o s rozsahem nastavitelnm od 200 1000 l (s chybou do 5 %)
o s rozsahem nastavitelnm od 20 200 l (s chybou do 5 %)
o s rozsahem nastavitelnm od 2 20 l (s chybou do 5 %)
o s rozsahem nastavitelnm od 0,5 10 l (s chybou do 5 %)
o s rozsahem nastavitelnm od 0,1 2,5 l (s chybou do 5 %)
piky s filtrem k pipetm s pslunm rozsahem
kit na izolaci DNA DNeasy mericon Food Kit
roubovac zkumavky o objemu 2 ml
steriln mikrozkumavky o objemu 1,5 a 2 ml
pinzeta, nky, n, alobal
chladnika
mrazic box (-20/-80 C)
vhy, tda pesnosti I
termomixer Biosan TS-100
vortex MixMate
centrifuga MiniSpin Plus
termoblok
pstroj LightCycler 480 Instrument
96 jamkov bl plata, LightCycler 480
centrifuga 5430
vortex/centrifuga FVL-2400
laminrn box
3. Chemiklie a roztoky
3.1. Souprava na izolaci DNA Izolace DNA se provd s vyuitm kitu DNeasy mericon Food Kit, dodavatel Qiagen,
katalogov slo 69514. Kit je uren pro izolaci DNA z potravin a krmiv, vetn vzork,
u kterch je DNA znan degradovna vlivem mechanickho, tepelnho i tlakovho
opracovn surovin. Tento kit umouje izolaci i fragmentovan DNA a efektivn odstrann
neistot a inhibitor nslednch molekulrn-genetickch analz. Izolace DNA je zaloena na
modifikovan CTAB metod v kombinaci s vyuitm proteinzy K, kdy dochz nejprve k lzi
tkn a bunk a nsledn k vysren blkovin se souasnm vysrenm jinch bunnch a
potravinovch inhibitor. Po extrakci chloroformem se vodn fze obsahujc DNA smch
s vazebnm pufrem umoujc imobilizaci DNA na kolon se silikonovou membrnou.
Purifikovan DNA je poslze eluovna roztokem s nzkm obsahem sol. Izolan soupravu je
mon skladovat pi teplot 15 25 C.
3.2. Mastermix qPCR LightCycler 480 Probes Master (Roche), katalogov slo 04 887 301 001. Master Mix je
nutn skladovat pi teplot od -25 C do -15 C, nedoporuuje se opakovan zamrazen
s nslednm rozmrazovnm pro dal analzu. Po prvnm rozmrazen lze Master Mix skladovat
po dobu max. 4 tdn pi teplot od 20,5 C do 80,5C.
3.3. Voda pro qPCR Pro edn vech komponent qPCR reakce se pouv PCR ultra ist voda, dodavatel Top-Bio,
katalogov slo P040.
3.4. Ethanol Pouvat vhradn nedenaturovan 96 % etanol, dodavatel P-Lab, katalogov slo E02301.
3.5. Uracil-DNA-glykosylaza Kad kompetitivn qPCR reakce obsahuje UNG, dodavatel Roche, katalogov slo
11 775 375 001.
3.6. Primery Originln primery jsou dodvny v lyofilizovanm stavu od vrobce KRD, esk Republika.
Podle nvodu uvedenho vrobcem jsou na pracoviti rozputny v PCR ultra ist vod tak,
aby vsledn zsobn koncentrace byla 100 pmol/l. Primery jsou evidovny a uloeny
v mraznice pi teplot cca 20 C 4 C po dobu max. 5 let. Je zakzno pipetovat primery
do qPCR pmo ze zsobn zkumavky.
3.7. Sondy Originln sondy jsou dodvny v lyofilizovanm stavu od firmy Generi Biotech (esk
Republika). Podle nvodu uvedenho vrobcem jsou na pracoviti rozputny v PCR ultra ist
vod tak, aby vsledn zsobn koncentrace byla 100 pmol/l. Sondy jsou evidovny
a uloeny v mraznice pi teplot cca -20 C 4 C po dobu max. 5 let. Je zakzno pipetovat
sondy do qPCR pmo ze zsobn zkumavky.
3.8. Kvantifikan plazmidov gradient Pro uren zastoupen jednotlivch ivoinch komponent v potravinch bylo mnostv DNA
ve vzorku stanoveno pomoc kvantifikanho standardu tvoenho ednm DNA izolovan
z danho druhu v rozsahu (10; 5; 1; 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 ng/ l).
3.9. Intern amplifikan kontroly (IACs) IAC byla pevzata z ji dve zavedenho systmu pro detekci M. avium subsp.
paratuberculosis (Slana et al., 2008). Ve zkratce, k sti sekvence StTS1 genu pochzejc z
brambor (Solanum tuberosum) jsou pipojena vazebn msta pro hybridn primery nep/F57.
st sekvence tchto primer je odvozen z genomu lkovky (Nepenthes), st z genomu
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Takto vytvoen DNA konstrukt byl klonovn
do TA vektoru pCR 2.1 (Invitrogen) a transformovn do chemokompetentnch bunk
Escherichia coli. Po selekci pozitivnch koloni a pomnoen v tekutm mdiu byly plazmidov
inzerty oveny sekvenovnm. U potvrzench plazmid byla urena koncentrace a istota
pomoc men absorbance. Zjitn koncentrace byla pepotena na poet plazmidovch kopi
na objem zsobnho roztoku. Z nj byly destkovm ednm pipraveny standardn roztoky
IAC v rozmez 108 a 100 kopi na l. Plazmidov gradient IAC byl rozputn v TE pufru bez
pdavku ist DNA z rybch spermi a skladovn pi teplot cca
-20 C 4 C ve 2 ml zkumavkch se roubovacm vkem do vypotebovn.
4. Vzorkovn, manipulace se vzorkem a jeho pprava
4.1. Odbr a pprava vzork Vzorky (tkn, potraviny, potravinov suroviny ivoinho pvod, krmiva pro pet zvata)
jsou odebrny ve sterilnm laboratornm prosted z originlnho obalu v mnostv 100 g s
maximln odchylkou 5 g. Po odbru jsou vzorky dn oznaeny a skladovny pi -20 C.
Evidence vzork se d vnitnmi pedpisy laboratoe.
4.2. Izolace DNA
4.2.1 Ped vlastn izolac
1) Pedeht termomixer na 60 C.
4.2.2 Vlastn izolace DNA
1) Do zkumavky se roubovacm vkem (objem 2 ml) navit 200 mg vzorku.
a) Tkn, potraviny nebo krmiva (granule, konzervy, polokonzervy), kter zvyuj po
pidn roztoku svj objem: navit 2 100 mg a rozdlit do dvou zkumavek o
objemu 2 ml.
b) Potraviny a krmiva konzistence tekutiny: odebrat 200 l.
c) Tuk nebo tukov kryt: odebrat 2 200 mg a rozdlit do 2 zkumavek (celkem
400 mg).
2) K navenmu vzorku pidat 1 ml Food Lysis Buffer a 2,5 l Proteinase K, zvortexovat
10 s.
3) Vzorky inkubovat v termomixeru pi 60 C za stlho tepn 800 rpm pes noc (cca 18
hodin).
4) Vzorky ochladit na pokojovou teplotu.
5) Vzorky centrifugovat 5 min pi 4.700 rpm.
6) Do ist zkumavky napipetovat 500 l chloroformu a pidat maximln mnostv (cca
700 800 l) istho supernatantu zskanho v kroku 5. Pokud na povrchu vznikne
povlak, odebere se ir tekutina pod povlakem.
7) Zkumavky vortexovat 15 s a centrifugovat 15 min pi 11.000 rpm.
8) Do ist zkumavky napipetovat 700 l Buffer PB a 700 l horn vodn fze (nebo
maximln mnostv) zskan v kroku 7, zvortexovat 10 s, krtce centrifugovat.
9) Roztok zskan v kroku 8 penst na kolonku (maximln 750 l), centrifugovat 1 min
pi 12.500 rpm, odpad vylt. Opakovat tento krok, dokud nebude zpracovn veker
roztok zskan v kroku 8. Pokud dojde k ucpn kolonky, lze pro jeden vzorek pout
vce kolonek.
10) Do kolonky pidat 500 l Buffer AW2, centrifugovat 1 min pi 12.500 rpm, odpad vylt
a znovu centrifugovat 1 min pi 12.500 rpm.
11) Kolonku vloit do nov ist 1,5ml zkumavky, pidat 75 l Buffer EB, inkubovat 5 min
pi pokojov teplot a pot centrifugovat 1 min pi 12.500 rpm.
12) Opakovat krok 11 (nanst na stejnou kolonku 75 l Buffer EB, inkubovat 5 min pi
pokojov teplot a centrifugovat 1 min pi 12.500 rpm).
13) Vsledkem je zskn 150 l DNA z analyzovanho vzorku.
5. Postup zkouky
5.1. Bezpenostn opaten Proveden metody nevyaduje dn zvltn bezpenostn opaten.
5.2. Okoln podmnky zkouky Proveden metody nevyaduje kontrolu dnch okolnch podmnek.
5.3. Mnostv vzorku DNA se izoluje z 200 mg tuhch vzork, 200 l kapalnch vzork nebo 2 200 mg tuku nebo
tukovho kryt. Do qPCR reakce se pouv 5 l vzorku naednho na koncentraci DNA 5
20 ng/l.
5.4. Slep pokus
5.4.1. Negativn izolan kontrola (NIC) Provd se stejn jako izolace DNA ze vzorku tkn. Jako vzorek do izolanho kitu je msto
alikvotu tkn pouita voda v ekvivalentnm mnostv. Jedna NIC mus bt pouita na kadou
izolaci. Jedna srie zahrnuje maximln 11 vzork a 1 NIC, tj. celkem 12 analz.
5.4.2. Pozitivn izolan kontrola Tato kontrola se neprovd.
5.4.3. Negativn PCR kontrola Jako vzorek je do PCR reakce pidna PCR ultra ist voda v ekvivalentnm mnostv. Jeden
slep vzorek mus bt pouit pi kadm qPCR experimentu.
5.4.4. Pozitivn PCR kontrola Jako pozitivn kontrola slou kvantifikan standardy (sriov naedn DNA pslunch
ivoinch druh). Mus bt pouita pi kadm qPCR experimentu.
5.5. Kalibrace mcho prostedku ped zkoukou Kalibrace LightCycler pstroje je zajitna vnitnm testem, kter je soust dodanho
softwarovho vybaven.
5.6. Proveden zkouky
5.6.1. Pprava amplifikan smsi pro PCR V prvnm kroku pipravit 4 rzn mixy (detailn popsno v tabulkch ne) obsahujc vechny
primery i sondy pro detekci ve uvedench ivoinch druh a primery, sondu i plasmidy
pro IAC. Namchat mixy pro vce bh, vytvoit alikvoty a skladovat pi cca -20 C 4 C po
dobu nejdle 6 msc. Alikvoty mixu lze opakovan zamrazovat a rozmrazovat.
Tabulka 1: Sestaven mix
Mix 1 Mix 2 Mix 3 Mix4
Kur domc
(ATTO425)
Buvol domc
(ATTO425)
Ptros dvouprst
(ATTO425)
Zajc poln
(ATTO425)
Tur domc
(FAM)
Krlk domc
(FAM)
Krta domc
(FAM)
Osel domc
(FAM)
Prase domc
(HEX)
Ovce domc
(HEX)
Husa domc
(HEX)
Krokodl
(HEX)
IAC
(CY5)
Koza domc
(ROX)
Kepelka japonsk
(ROX)
Klokan
(ROX)
K domc
(CY5)
Kachna domc
(CY5)
Perlika
(CY5)
Tabulka 2: Pprava mixu 1
Sloka Vsledn mnostv na 1 reakci
Mnostv na 1000 l mixu
(na 1 reakci pijde 1l mixu)
PCR voda 848 l
Primer RT_F17 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R16 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P14 (100 M) 0,2 pmol 2 l
Primer RT_F29 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R29 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P29 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F3 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R3 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P3 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer IAC nep/F57 F (100 M) 1 pmol 10 l
Primer IAC nep/F57 R (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda IAC F57 P (100 M) 4 pmol 40 l
IAC (107) 105 kopi 10 l Tabulka 3: Pprava mixu 2
Sloka Vsledn mnostv na 1 reakci
Mnostv na 1000 l mixu
(na 1 reakci pijde 1l mixu)
PCR voda 648 l
Primer RT_F41 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R41 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P41 (100 M) 0,2 pmol 2 l
Primer RT_F74 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R74 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P74 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F62 (100 M) 10 pmol 100 l
Primer RT_R62 (100 M) 10 pmol 100 l
Sonda RT_P62 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F84 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R84 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P84 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F32 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R32 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P32 (100 M) 4 pmol 40 l Tabulka 4: Pprava mixu 3
Sloka Vsledn mnostv na 1 reakci
Mnostv na 1000 l mixu
(na 1 reakci pijde 1l mixu)
PCR voda 828 l
Primer RT_F34 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R34 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P34 (100 M) 0,2 pmol 2 l
Primer RT_F50 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R50 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P50 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F21 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R21 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P21 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F35 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R35 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P35 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F26 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R26 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P26 (100 M) 4 pmol 40 l Tabulka 5: Pprava mixu 4
Sloka Vsledn mnostv na 1 reakci
Mnostv na 1000 l mixu
(na 1 reakci pijde 1l mixu)
PCR voda 828 l
Primer RT_F68 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R68 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P68 (100 M) 0,2 pmol 2 l
Primer RT_F76 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R76 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P76 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F75 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R75 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P75 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F67 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R67 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P67 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_F80 (100 M) 1 pmol 10 l
Primer RT_R80 (100 M) 1 pmol 10 l
Sonda RT_P80 (100 M) 4 pmol 40 l Bezprostedn ped vlastn analzou pipravit premix 14 obsahujc pslun mix 14, UNG
a probes master, pesn sloen viz Tabulka 6. Tabulka 6: Pprava premixu
Sloka Mnostv na 1 reakci (20 l) Mnostv na 100 reakc
PCR voda 3,8 l 380 l
Pslun mix (viz tab.ve) 1 l 100 l
UNG (Roche) 0,2 l 20 l
LightCycler 480 Probes Master (2x conc.) 10 l 1000 l
Celkem 15 l 1500 l 5.6.2. Proveden qPCR experimentu na LC 480
Pipraven premix rozpipetovat po 15 l do jednotlivch jamek na 96 jamkovou destiku
(LightCycler 480 Multiwell Plate 96, bl). V kadm qPCR experimentu mus bt obsaeny:
kvantifikan standardy (sriov naedn DNA pslunch ivoinch druh) o koncentraci
10 ng/l; 5 ng/l; 1 ng/l; 0,5 ng/l; 0,1 ng/l; 0,05 ng/l; 0,01 ng/l, pipetovat vdy 5
l. Nsledn do zbylch jamek pipetovat 5 l testovan DNA (o koncentraci 520
ng/ul). Kad izolovan vzorek DNA je analyzovn qPCR systmem v dupliktu.
Vzorky pipetovat na 96-jamkovou destiku v poad (1) kvantifikan standardy; (2) negativn
kontrola; (3) analyzovan vzorky a NIC. Na jednu 96-jamkovou destiku je mono pipetovat 1
4 izolan bhy spolen s kvantifikanm gradientem (Tabulka 7).
Vzorky oznaen S10 S0,01 pedstavuj kvantifikan standardy (naedn DNA pslunch
ivoinch druh). K-neg oznauje negativn kontrolu. Vzorky oznaen jako vz. 1 40
pedstavuj analyzovan vzorky; oznaen repl. zna duplikt analyzovanho vzorku. Vzorky
oznaen jako NIC1 NIC4 pedstavuj negativn izolan kontrolu. Vechny multiplexn
qPCR jsou optimalizovny na jednotn qPCR protokol, take mal mnostv vzork je mon
analyzovat na ptomnost vce druh v rmci jednoho experimentu.
Tabulka 7: Pklad uspodn qPCR destiky
B1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S10 vz.1 repl.A2 vz.9 repl.A4 vz.17 repl.A6 vz.25 repl.A8 vz.33 repl.A10 NIC1
B S5 vz.2 repl.B2 vz.10 repl.B4 vz.18 repl.B6 vz.26 repl.B8 vz.34 repl.B10 NIC2
C S1 vz.3 repl.C2 vz.11 repl.C4 vz.19 repl.C6 vz.27 repl.C8 vz.35 repl.C10 NIC3
D S0,5 vz.4 repl.D2 vz.12 repl.D4 vz.20 repl.D6 vz.28 repl.D8 vz.36 repl.D10 NIC4
E S0,1 vz.5 repl.E2 vz.13 repl.E4 vz.21 repl.E6 vz.29 repl.E8 vz.37 repl.E10 repl.A12
F S0,05 vz.6 repl.F2 vz.14 repl.F4 vz.22 repl.F6 vz.30 repl.F8 vz.38 repl.F10 repl.B12
G S0,01 vz.7 repl.G2 vz.15 repl.G4 vz.23 repl.G6 vz.31 repl.G8 vz.39 repl.G10 repl.C12
H K-
neg
vz.8 repl.H2 vz.16 repl.H4 vz.24 repl.H6 vz.32 repl.H8 vz.40 repl.H10 repl.D12
Destiku pelepit kryc flii a centrifugovat 2.000 g po dobu 2 min. Centrifugovanou 96-
jamkovou destiku vloit do pstroje LC 480 a spustit program (Tabulka 8).
Tabulka 8: Nastaven teploty, asu a potu opakovn u jednotlivch cykl
Ramp Rate Aquisition mode
vodn denaturace 95 C/7 min 4,4 C/s Denaturace
47 cykl 95 C/5 s 4,4 C/s
Annealing a Extenze 60 C/40 s 2,2 C/s Single
Chlazen 40 C/30 s 2,2 C/s
Tabulka 9 a 10: Nastaven excitanch a emisnch filtr (pro men fluorescence u
jednotlivch reportr) v pstroji LightCycler 480
Selected Filter Combination List
Excitation
Filter
Emission
Filter
Name Melt Factor Quant
Factor
Max
Integratic
Time (sec.)
440 488 ATTO425 1 10 2
465 510 FAM 1 10 2
533 580 HEX 1 10 2
533 610 ROX 1 10 2
618 660 CY5 1 10 2
Hodnocen experiment probh v prosted softwaru LightCycler (version LCS480 1.2.0.169)
pomoc druhho derivanho maxima (pro IAC, kanl Cy5) a Fit point analzy (pro detekci
ivoinch druh). Pepoet relativnho mnostv ng DNA provdt vdy podle
kvantifikanho gradientu DNA v danm experimentu.
5.7. Vpoet a vyjden vsledk Ped zhodnocenm vsledk je nutn nejprve provst tzv. color kompenzaci pro pslun
kanly.
Hodnocen vsledk dle probh ve dvou po sob nsledujcch krocch:
5.7.1. Kvalitativn hodnocen
Hodnocen se provd podle nsledujc tabulky a je platn pouze pro LC 480:
Tabulka 11: Postup pi kvalitativnm vyhodnocen
E x c i t a t i o n
E m i s s i o n
488 510 580 610 640 660
440
465
498
533
618
Fluorescence clovch gen Fluorescence IAC
(Kanl Cy5) Celkov vsledek
Pozitivn Pozitivn Vzorek je pozitivn
Pozitivn Negativn Vzorek je pozitivn
Negativn Pozitivn Vzorek je negativn
Negativn Negativn Vzorek je inhibovn
Pokud je vzorek inhibovn, je nutn bu zopakovat qPCR experiment s naednou izolovanou
DNA, nebo izolaci DNA ze zsobnho dupliktu.
5.7.2 Kvantitativn hodnocen Uren mnostv dan DNA ve vzorcch probh v softwaru LightCycler (version LCS480
1.2.0.169) na zklad odetu Cq hodnoty a nslednho vpotu koncentrace podle kalibran
kivky tvoen gradientem DNA danho druhu se znmou koncentrac.
6 Validace V etnosti minimln 1 za rok provst mezilaboratorn test.
6.1 Specifita V ppad qPCR systmu nebyla nalezena dn kov reakce s jinmi druhy hospodskch,
domcch a voln ijcch zvat. Seznam druh pro oven specifity testu je znzornn
v Tabulce 12. Pouit hydrolyzanch sond jako druhho specifickho oligonukleotidu
nevyaduje dodaten potvrzen identity PCR produktu nezvislou metodou (nap.
sekvenovan, Southern blot apod).
Tabulka 12: Vpis ivoinch druh, na kterch byla testovna specifita olig
1 Baant obecn 21 Los evropsk
2 Buvol indick 22 Losos obecn
3 Dank skvrnit 23 Medvd
4 Holub domc 24 Medvd hnd
5 Husa domc 25 Muflon evropsk
6 Jelen evropsk, sika 26 Mval severn
7 Kachna domc, divok 27 Orebice horsk
8 Kapr obecn 28 Osel domc
9 Klokan 29 Ovce domc
10 Koka domc 30 Perlika domc
11 Koroptev poln 31 Pes domc
12 Koza domc 32 Potkan obecn
13 Krlk domc 33 Prase domc, divok
14 Krocan domc 34 Psk mvalovit
15 Krokodl 35 Ptros dvouprst
16 Kepelka japonsk 36 Sob polrn
17 K domc, islandsk 37 Srnec obecn
18 Kuna skaln, lesn 38 Tcho tmav
19 Kur domc 39 Tur domc
20 Lika obecn 40 Zajc poln
Testy exkluzivity byly dle provedeny na DNA ze vzork rostlinnch druh, kter pat mezi
ast komponenty v krmivech a zpracovanch potravinch ivoinho pvodu. Pro izolaci
DNA byla pouita semena, listy, plody, hlzy, bulvy nebo pupeny. Seznam testovanch vzork
je uveden v Tabulce 13.
Tabulka 13: Vpis rostlinnch vzork, na kterch byla testovna specifita olig 1 Anz 27 Jalovec 53 Pomelo 2 Bann 28 Jedl katan 54 Pomeran 3 Bobkov list 29 Kiwi 55 Psyllium 4 Borvka 30 Kmn 56 Raje 5 Brambora 31 Kopiva 57 Raje cherry 6 Brusinka 32 Kurkuma 58 Rakytnk 7 Celer 33 Lskov oech 59 Rozmarn 8 Cibule 34 Listov pent 60 Ryngle, pupen 9 Citron 35 Lnn semnko 61 Re bl 10 Cizrna 36 Majornka 62 Saturejka 11 ekanka 37 Maliny 63 Sezamov semnko 12 ern rybz, pupen 38 Mandarinka 64 Skoice mlet 13 erven epa 39 Mta peprn 65 Slunenice semnka 14 esnek 40 Mosk asy 66 Sja 15 oka velkozrnn 41 Mrkev 67 Spirulina
16 Dn 42 Muktov oek, mlet 68 alvj 17 Fazole erven 43 Nov koen 69 vestka, pupen 18 Fenykl 44 Oregano 70 Tee, pupen 19 Hemnek 45 Oek, pupen 71 Tykev semnka 20 Hrch 46 Ostropestec 72 Tymin 21 Hruka 47 Ostruina, plod 73 Vanilka, list 22 Hebek 48 Pampelika 74 Vie, pupen 23 Chia semnka 49 Paprika 75 Vlask oech 24 Chilli mlet 50 Pep ern 76 Zzvor 25 Jablko 51 Petrel 77 Zelen aj 26 Jahoda 52 Podzemnice olejn 78 lut meloun
Opakovatelnost a uren LOD
Kur domc naedn DNA
(ng/l) namen (ng/l)
prmr smrodatn odchylka varian koeficient 10 11,3250 0,8258 7,2915 5 5,1425 0,3613 7,0266 1 0,7870 0,0679 8,6297
0,5 0,5283 0,0411 7,7746 0,1 0,0876 0,0111 12,6499 0,05 0,0634 0,0038 5,9254 0,01 0,0086 0,0008 9,2341 0,005 0,0057 0,0018 31,7177 0,001 0,0006 0,0003 52,9086
Tur domc
naedn DNA (ng/l)
namen (ng/l) prmr smrodatn odchylka varian koeficient
10 10,9000 0,6364 5,8385 5 4,8025 0,2130 4,4352 1 0,8853 0,0584 6,6020
0,5 0,5030 0,0234 4,6476 0,1 0,1028 0,0072 7,0219 0,05 0,0557 0,0073 13,1824 0,01 0,0095 0,0004 4,5662 0,005 0,0048 0,0014 29,8632 0,001 0,0004 0,0003 71,8935
Prase domc
namen (ng/l)
naedn DNA (ng/l) prmr smrodatn odchylka varian koeficient
10 9,9825 0,3753 3,7592 5 4,7350 0,3012 6,3613 1 0,9568 0,0727 7,5975
0,5 0,5270 0,0495 9,3923 0,1 0,0989 0,0068 6,9031 0,05 0,0624 0,0090 14,3720 0,01 0,0086 0,0010 11,4440 0,005 0,0040 0,0037 93,1129 0,001 0,0030 0,0013 42,3807
Na zklad testovn opakovatelnosti a uren citlivosti (LOD) na 3 zkladnch druzch (prase,
tur a kur) byl stanoven LOD ve vech 3 ppadech na 0,01 ng/l vstupnho mnostv DNA.
Kritriem stanoven byla hodnota varianho koeficientu < 30%.
7. Operativn zen jakosti
Je eeno
1) kontrolou pomoc negativn izolan kontroly bhem izolace DNA (viz bod 5.4.1.),
2) pozitivn a negativn kontrolou bhem qPCR (viz body 5.4.3. a 5.4.4.),
3) duplicitn izolac DNA a nezvislou qPCR analzou.
III. SROVNN NOVOSTI POSTUPU
V souasn dob nen k dispozici dn legislativn zvazn metoda pro detekci a identifikaci
ivoinch tkn v potravinch a krmivech. V laboratorn praxi se vyuv jak proteinov
analza (imunologick, chromatografick a spektroskopick metody), tak metabolomick
metody, jejich pouit je vak limitovno u vceslokovch a technologicky opracovanch
potravin. Metody zaloen na teplotn stabiln DNA pedstavuj vhodnou metodickou
alternativu. Molekulrn-genetick metody jsou vysoce specifick, citliv, rychl, interpretan
pesn a v souasn laboratorn praxi bn ekonomicky dostupn.
Nov navren qPCR systmy, zaloen na detekci vybranch sek genomov DNA jsou
vysoce citliv a lze j prokzat ptomnost tkn analyzovanch druh ji pi koncentraci DNA
0,01 ng/l jak ve vzorcch syrovch tkn, tak u zpracovanch potravin a krmiv nebo jejich
komponent. Vznamnm novm pstupem popsanch qPCR systm je fakt, e jsou zaloeny
na amplifikaci fragment genomov DNA, kter se vyskytuj v buce v jedin kopii. Vtina
dosavadnch qPCR systm pro detekci ivoin DNA je zaloena na amplifikaci
mitochondriln a vzhledem k tomu, e poet kopi mitochodrilnho genomu zvis na typu
buky a tkn, metody zamen na jednokopiov geny jsou vhodnj pro kvantifikaci ne
metody amplifikujc fragmenty mitochondrilnch gen. Pedloen metodika pedstavuje
komplexn postup definovan od odbru a ppravy vzork, pes izolaci DNA po nov pvodn
pentaplexn qPCR detekn systmy vetn popisu vyhodnocen a interpretace vsledk.
Zrove byly logicky navreny tak, e prvn multiplex (tur, prase, kur a IAC) bude aplikovn
na kad vzorek. Touto analzou budou ve vzorku identifikovny nejbnj suroviny
ivoinho pvodu a dky IAC bude odhalena ppadn inhibice izolovan DNA.
Vzhledem k tomu, e prvn multiplexn qPCR systmem bude provdn vdy, neobsahuj dal
qPCR systmy IAC. Metodika je pln vyuiteln pro ely kontroly ptomnosti ivoinch
tkn v potravinch a krmivech a dalch nepotravinskch produktech. Pedloen
mutliplexn qPCR systmy pro detekci tkn vybranch ivoinch druh byly zavedeny
s ohledem na jejich budouc diagnostick uplatnn. Proto u n byla provedena kompletn
optimalizace, otestovna specificita a citlivost, propracovn systm kontrol, vetn internch
amplifikanch kontrol a interpretace vsledk. Pedloen qPCR systmy spluj vechny
nroky kladen na diagnostick soupravy pro rutinn pouit.
Multiplexn qPCR systmy jsou navreny tak, aby jejich hlavn analytick parametry vetn
limitu detekce, meze kvantifikace, robustnosti, opakovatelnosti a pesnosti byly srovnateln se
singlplexnmi reakcemi a zrove aby dokzaly pracovat s mez citlivosti nad tzv.
technologickmi kontaminacemi, co minimalizuje riziko falen pozitivnch vsledk. Dky
monosti soubn detekce, identifikace a kvantifikace nkolika (a 5) zvolench ivoinch
druh dochz k velmi vrazn asov spoe pi pprav reakce a tak k vraznmu snen
finannch nklad. Hlavn vhodou vak zstv pm clen detekce vybranch ivoinch
druh, kdy je mon vhodnm sestavenm multiplexu zrove detekovat ptomnost tkn
nedeklarovanch ivoinch druh.
IV. POPIS UPLATNN CERTIFIKOVAN METODIKY Certifikovan metodika je urena pro pmou detekci a identifikaci tkn 18 ivoinch druh.
Vysoce citlivou metodu lze pout pro detekci a prkaz ptomnosti vech typ tkn, ktermi
jsou svalovina, tuk, chrupavky, vnitnosti, krev a krevn derivty, ke a jej derivty, steva,
mezenterium, plazma, elatina a proteiny a to jak ve vzorcch nezpracovanch surovin, tak ve
vzorcch potravin a krmiv, kter byly technologicky zpracovny. Metodika je clena tak na
ovovn sloen a autenticity potravin a krmiv s definovanmi nboenskmi a etnickmi
poadavky, zejmna na halal potraviny a krmiva. Uivatel vyuije vsledk certifikovan
metodiky pro ely kontroly sloen a ovovn autenticity potravin a krmiv a pro kontrolu
produkt farmaceutickho nebo kosmetickho prmyslu.
Uivatelem metodiky bude Sttn zemdlsk a potravinsk inspekce, kter vyuije vsledk
certifikovan metodiky pro rozen portfolia kontrolnch diagnostickch metod v rmci sv
psobnosti jako sttnho kontrolnho a dozorovho orgnu. Uivatelem metodiky / vsledk
budou ppadn dal diagnostick laboratoe pro rozen portfolia preventivn diagnostickch
metod dostupnch pro producenty, zpracovatele a distributory potravin
a krmiv pro ovovn sloen a sprvnosti oznaovn.
V. EKONOMICK ASPEKTY Falovn potravin a krmiv ivoinho pvodu pat k aktulnm a zvanm problmm.
Globalizace obchodu s potravinami a surovinami pro vrobu potravin spolu s prudce rostouc
kupn slou populace jsou v pm souvislosti se zvyujcm se potem zmrn i nezmrn
falovanch potravin. Rzn statistick zdroje uvdj procenta chybn nebo klamav
oznaench potravin ivoinho pvodu na hranici 8 % fd 15 % v zemch Evropsk unie, 20
% v Turecku a 19 % v USA (Ali et al, 2014, Ballin et al., 2009, Ulca et al., 2013). V oblasti
vroby, distribuce a konzumace masnch vrobk se uplatuj regionln a etnick konvence a
zvyklosti, jejich nedodren i pekroen pedstavuje nejen ekonomick, ale pedevm
osobn mentln a nboensk problm (judaismus, islm). Jedn se napklad o omezen
konzumace krve, orgn i dalch tkn hospodskch zvat, anebo dle masa z elem, ps,
kon, voln ijcch zvat nebo i prasat. U produkt ze tetch zem bylo zmrn falovn
prokzno nap. u masnch polotovar, balenho dlenho masa i masnch vrobk z ny,
kdy byla deklarovan jehn svalovina nahrazovna svalovinou nork, liek nebo krys
(Beijing, 2013). V souvislosti s aktuln celosvtovou migrac obyvatel zanaj zem, pro kter
byly jet ped 10 lety halal potraviny okrajovou zleitost, produkovat i obchodovat nebo
importovat stle vce tchto potravin, krmiv a ostatnch produkt. Nrst muslimsk populace
a poteba zven produkce halal potravin se odr v objemu jejich produkce. V souasnosti
se ron obrat trhu s halal potravinami odhaduje na vce ne 1,6 bilion dolar a jejich podl na
svtov produkci potravin bude v ptch letech nepochybn narstat (Lubis et al., 2016; Sow
et al., 2017). Nejvce halal potravin se vyrb v Saudsk Arbii, Malajsii, Spojench Arabskch
Emirtech, Indonsii a Egypt, jejich produkce pedstavuje asi 42 % z celkov vroby halal
potravin. Mezi zemmi EU nejvt podl produkce halal potravin pipad na Francii, ale
vzhledem k migran vln se bude mnostv tchto potravin zvyovat i v jinch zemch EU
(Benzertiha et al., 2018).
Nklady na zaveden metodiky do laboratoe
Nklady na zaveden metodiky do laboratoe spovaj pedevm v pozen spotebnho
materilu, souprav na izolaci DNA a chemikli na proveden qPCR. Nklady na pstroje a
nstroje, jako jsou pipety, centrifugy, vortexy, vhy, termobloky, thermocycler a mechanick
homogeniztor, nejsou zapotny, nebo jsou pedpokldanm vybavenm laboratoe
vyuvajc metodiku.
Nklady na vyeten jednoho vzorku a vybaven specializovan laboratoe jsou uvedeny
v nsledujcch tabulkch. Vechny ceny jsou aktuln k datu vydn metodiky a zahrnuj DPH.
Nklady na materil na vyeten jednoho vzorku jednm mutliplexem uveden metodiky.
Kalkulace zahrnuje i prmrn nklady na pozitivn a negativn kontroly.
Poloka Obvykl cena Izolace DNA (cena izolan soupravy, zkumavky) 200 K
qPCR (enzymy, vechny sady primer a sond) 70 K Spotebn materil (piky s filtrem, zkumavky, rukavice a desinfekce) 100 K
Celkem 370 K
Komplexn analza jednoho vzorku vemi 4 multiplexnmi systmy stoj jen materilovch
nkladech 570 K. Lidsk prce, odpisy a reijn nklady nejsou zahrnuty, protoe jejich ve
je zvisl na dan instituci provdjc analzu. Ekonomick pnos pro uivatele:
Problematika kvality a bezpenosti potravin pat mezi vysoce aktuln tmata een jak na
rovni Evropsk unie, tak celosvtov. Mezi zkladn dc dokumenty esk republiky v tto
oblasti pat v souasn dob Strategie bezpenosti potravin a vivy 2014 2020, kde jako
jedno z hlavnch vchodisek pro stanoven priorit dokument uvd v negativnch trendech
rozvoj klamn spotebitele a falovn potravin, zejmna pak narstajc trend chybnho
oznaovn potravin s clem zatajit ptomnost urit sloky v potravin. Za hlavn pinu je
povaovn stle slc tlak na cenu potravin a tak vysokou poptvku veejnosti po levnch
potravinch. Mezi zkladn priority pro obdob 2014-2020 pat aktivn boj proti klamn
spotebitele v oblasti oznaovn a falovn potravin. Podobn Ministerstvo prmyslu a
obchodu (MPO) vytvoilo strategick dokument Priority spotebitelsk politiky 2015 2020,
ve kterm se zamuje pedevm na ochranu zjmu spotebitel a boj proti nekalm obchodnm
praktikm jak u potravin, tak u nepotravinskch vrobk.
Tyto strategick dokumenty dokldaj, nezbytnost vvoje novch, robustnch, vysoce citlivch
metod a jejich rychl uvdn do laboratorn praxe pro kontrolu kvality
a deklarovanho sloen potravin, krmiv a ppadn nepotravinskch vrobk vychzejcch
ze stejn surovinov zkladny.
VI. SEZNAM POUIT LITERATURY Ali ME, Razzak MA, Hamid SBA 2014: Multiplex PCR in Species Authentication: Probability
and Prospects - A Review. Food Analytical Methods, 7: 19331949.
Ballin NZ, Vogensen FK, Karlsson AH 2009: Species determinationCan we detect and
quantify meat adulteration?. Meat science, 83: 165-174.
Bejing AP 2013: Rat meat sold as lamb in latest China food scandal.
Benzertiha A, Kieroczyk B, Rawski M, Jzefiak A, Mazurkiewicz J, Jzefiak D, Messikh MS,
witkiewicz S 2018: Cultural and practical aspects of halal slaughtering in food production.
Med Weter, 74: 371376.
Ceranic S, Bozinovic N 2009: Possibilities and significance of HAS implementation (halal
assurance system) in existing quality system in food industry. Biotechnol Anim Husb, 25: 261
266.
Choi R, Park HD, Kang B, Choi SY, Ki CS, Lee SY, Kim JW, Song J, Choe YH 2016: PHKA2
mutation spectrum in Korean patients with glycogen storage disease type IX: prevalence of
deletion mutations. BMC medical genetics, 17: 33.
Giridharan SS, Cai B, Vitale N, Naslavsky N, Caplan S 2013: Cooperation of MICAL-L1,
syndapin2, and phosphatidic acid in tubular recycling endosome biogenesis. Molecular biology
of the cell, 24: 17761790.
Hackett C, Connor P, Stonawski M, Skirbekk V, Potanokov M, Abel G 2015: The future
of world religions: Population growth projections, 2010-2050. Pew Research Center,
Washington, DC, 245 p.
Hirabayashi S, Saitsu H, Matsumoto N 2016: Distinct but milder phenotypes with choreiform
movements in siblings with compound heterozygous mutations in the transcription preinitiation
mediator complex subunit 17 (MED17). Brain and Development, 38: 118123.
Illson ML, Dempsey-Nunez L, Kent J, Huang Q, Brebner A, Raff ML, Watkins D, Gilfix BM,
Wittwer CT, Rosenblatt DS 2013: High resolution melting analysis of the MMAB gene in cblB
patients and in those with undiagnosed methylmalonic aciduria. Molecular genetics and
metabolism, 11: 8689.
Lancellotti S, Basso M, De Cristofaro R 2009: Congenital prothrombin deficiency: an update.
Seminars in thrombosis and hemostasis, 39:596606.
Lawson HA, Zayed M, Wayhart JP, Fabbrini E, Love-Gregory L, Klein S, Semenkovich CF
2017: Physiologic and genetic evidence links hemopexin to triglycerides in mice and humans.
International Journal of Obesity, 41: 631.
Lubis HN, Mohd-Naim NF, Alizul NN, Ahmed MU 2016: From market to food plate: Current
trusted technology and innovations in halal food analysis. Trends in Food Science &
Technology, 58: 5568.
Rychlik, W 2007: OLIGO 7 primer analysis software. Methods in molecular biology, 402: 35
60.
Sow LC., Peh, Y. R., Pekerti, B. N., Fu, C., Bansal, N., & Yang, H. (2017). Nanostructural
analysis and textural modification of tilapia fish gelatin affected by gellan and calcium chloride
addition. LWT-Food Science and Technology, 85, 137-145.
Soubeyrand S, Martinuk A, McPherson R 2017: TRIB1 is a positive regulator of hepatocyte
nuclear factor 4-alpha. Scientific Reports, 7: 5574.
witnicki MP, Juul M, Madsen T, Srensen KD, Pedersen JS 2016: PINCAGE: probabilistic
integration of cancer genomics data for perturbed gene identification and sample classification.
Bioinformatics, 32: 13531365.
Ulca P, Balta H, an I, Senyuva HZ 2013: Meat species identification and Halal
authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods. Meat science,
94: 280284.
Verras M, Theodoraki MA, Mintzas AC 2004: Cloning, characterization, and developmental
expression of the ribosomal protein S21 gene of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata.
Archives of Insect Biochemistry and Physiology: Published in Collaboration with the
Entomological Society of America, 56:133142.
Vitali T, Maffioli E, Tedeschi G, Vanoni MA 2016: Properties and catalytic activities of
MICAL1, the flavoenzyme involved in cytoskeleton dynamics, and modulation by its CH, LIM
and C-terminal domains. Archives of biochemistry and biophysics, 593: 2437.
Zhang F, Liu C, Xu Y, Qi G, Yuan G, Cheng Z, Wang J, Wang G, Wang Z, Zhu W, Zhou Z,
Zhao X, Tian L, Jin C, Yuan J, Zhang G, Chen Y, Wang L, Lu T, Yan H, Ruan Y, Yue W,
Zhang D 2014: A two-stage association study suggests BRAP as a susceptibility gene for
schizophrenia. PloS one, 9: e86037.
Zhang W, Tong D, Liu F, Li D, Li J, Cheng X, Wang Z 2016: RPS7 inhibits colorectal cancer
growth via decreasing HIF-1-mediated glycolysis. Oncotarget, 7: 5800.
Zhou X, Hao Q, Liao JM, Liao P, Lu H 2013: Ribosomal protein S14 negatively regulates c-
Myc activity. Journal of Biological Chemistry, 288: 2179321801.
VII. SEZNAM PREZENTAC VSLEDK, KTER PEDCHZELY
METODICE Borilova G, Petrakova M, Kralik P 2017: qPCR Method for Detection of Halal Food
Adulteration. Conference Proceedings, ICAFRd 2017: 19th International Conference on
Adulterated Food and Rapid Detection, Barcelona, 19 (10) Part XXI.
Boilov G, Nesvadbov M, Krlk P, Petrkov M 2018: Vvoj novch metod qPCR pro
oven kvality a autenticity potravin a krmiv. Sbornk abstrakt Hygiena a technologie
potravin, XLVIII. Lenfeldovy a Hklovy dny, Brno, s. 29.
Boilov G, Nesvadbov M, Petrkov M, Krlk P 2018: Hodnocen autenticity potravin a
krmiv pomoc molekulrnch metod. Sbornk souhrn sdlen ze XLVIII. Symposia o novch
smrech vroby a hodnocen potravin, Skalsk Dvr, s. 25.
Petrakova M, Nesvadbova M, Kralik P, Borilova G 2018: Identification of animal species and
their detection in food and feed by multiplex real-time PCR. International Symposium Food
Fraud Prevention and Effective Food Allergen Management, Vienna. Quality Assurance and
Safety of Crops & Foods 10: Supplement 1, S18.
Servusov E, Piskat Z, Reslov N, Krlk P 2018: Identifikace ivoinch druh
v potravinch a krmivech pomoc metody MOL-PCR. Sbornk abstrakt Hygiena a technologie
potravin, XLVIII. Lenfeldovy a Hklovy dny, Brno, s. 79.
