Úvod do molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových kyselin
Uchování a přenos genetické informace - replikace
Transkripce
Proteosynthesa a skládání proteinů - translace
Regulace transkripce
Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní
technologie
Metodické přístupy molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových
kyselin Deoxyribonukleová kyselina (DNA)
Ribonukleová kyselina (RNA)
Každá monomerní jednotka obsahuje:
1) Fosfátovou skupinu
2) Pětiuhlíkatý monosacharid
• Ribosa
• 2-deoxyribosa
3) Base
Purinové a pyrimidinové
stejné
Nukleové báze
Vlastnosti nukleových bází – souvisí s jejich funkcí
• Planární
• Keto-enol tautomerie
• Slabě bazické
• Spektrální - UV
Monomerní jednotka RNA
Monomerní jednotka DNA
H H
base
O
O P O
O
H2C5´ O
C4´ H H C1´
C3´ C2´
O OH
H
Glykosidická vazba Mezi C1 monosacharidu a N
base
NUKLEOSID
Monosacharid + base
HO
NUKLEOTID
C5´- fosforylovaný derivát
nukleosidu, monomerní
jednotka NK
Uhlíkové atomy v cukerné části
číslovány s čárkou
Strukturní jednotky NK
1 9
Glykosidická vazba v
nukleosidech a nukleotidech je u
purinových bází tvořena mezi N9
a C1´ (deoxy)ribosy
Glykosidická vazba v
nukleosidech a nukleotidech je
u pyrimidinových bází tvořena
mezi N1 a C1´ (deoxy)ribosy
Názvosloví
Nukleosidy:
Purinové: přípona – osin (adenosin, guanosin)
Pyrimidinové: přípona – idin (thymidin, cytidin, uridin)
Deoxy-
Nukleotidy:
Nukleosid (x‘) mono-, di-, tri- fosfát
Adenosin 5‘ trifosfát´= ATP, obecně NTP nebo dNTP
Báze se označují jednopísmennými symboly: A T C G U
Funkce nukleotidů • stavební složky nukleových kyselin
• přenašeče energie (ATP, GTP, ligasy, hydrolasy)
• fosforylační činidla (ATP - kinasy)
• aktivátory meziproduktů biosyntéz:
UDPglukosa CDPcholin
O P
O
O
O
H
P
OH
O
O
H
O
H
H
CH2
H
O
O
CH2
CH2N
+
CH3
CH3
CH3
N
N
O
N
Funkce nukleotidů …. • součásti kofaktorů (NAD(P), FAD, AdoMet, CoA)
• regulační molekuly a neuromodulátory (cAMP, cGMP)
• Využití v terapii – antivirotika (AIDS, herpes, hepatitida)
HPO
O
O
O
H
O
H
H
CH2
H
NN
NN
NH2
O
cAMP
Cyklický AdenosinMonoFosfát
Struktura DNA
• Primární - pořadí nukleotidů 5´ → 3´
• Sekundární
• Terciární
Primární struktura
Zapisujeme:
TACG.....
(dTdAdCdG.....)
Sekundární struktura DNA
dvojitá šroubovice
1953 - James Watson, Francis Crick
Rosalind Franklin -
rentgenostrukturní analysa → meziatomární vzdálenosti,
helikální struktura
Zastoupení basí v DNA (molární %)
Organismus A T G C
Člověk 30.9 29.4 19.9 19.8
Kuře 28.8 29.2 20.5 21.5
Kobylka luční 29.3 29.3 20.5 20.7
Pšenice 27.3 27.1 22.7 22.8
Kvasinky 31.3 32.9 18.7 17.1
E. coli 24.7 23.6 26.0 25.7
Chargaffova pravidla:
[A] = [T] a [G] = [C]
[A] /[T] = [G] / [C] = 1
Princip párování basí
James D.Watson & Francis Crick
Nobelova cena 1962
1. Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix,
vzájemně svinuté, parametry
2. Monosacharid + fosfát´= páteř vně šroubovice – polární
povrch
3. Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů
kolmo na osu, stohování basí, patrové hydrofobní
interakce
4. Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým
pravidlům, vodíkové můstky
5. Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a
malý (úzký a hluboký)
6. Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání:
5‘ → 3‘
3‘ → 5‘
velikost se udává počtem párů bazí – bp
Sekundární struktura
Terciární struktura DNA
Prokaryotní
1 molekula kruhové DNA - 1 chromosom (E.coli 2,6x106 kDa, 1400 m!!)
Plasmid(ová DNA) - autonomně se replikující (zdvojující) mimochromosomální
cirkulární DNA, odlišná od bakteriálního genomu (chromosomální DNA), která
není nezbytná pro kontinuální existenci organismu za neselektivních podmínek.
+
Eukaryotní DNA je lineární
Chromosomy
+ mimojaderná: mitochondriální, plastidová (pozor!! kruhová)
Kódující úseky – exony, nekódující úseky - introny
Kondenzace, poměr sbalení až 8 000
Základní jednotka - nukleosom
Vlastnosti DNA
DNA poměrně málo stabilní - lze poškodit i mechanicky
Přechod dvouvláknové struktury na jednovláknovou - porušení
hydrofobních interakcí a vodíkových můstků:
Pokles optické otáčivosti
Pokles viskozity
změna spektrálních vlastností
Změna pH - protonace N1 v adeninu a N3 v cytosinu
Pokles iontové síly - odhalení záporných nábojů fosfátové kostry
Teplotní denaturace DNA
Tm = teplota tání DNA
Denaturace může být vratná
- annealing
Tm se ↑ s ↑ zastoupením
GC párů
Hyperchromní efekt:
RNA
Ribosa x deoxyribosa
U x T
Jednovláknová!
Messenger RNA – mRNA (5%)
Ribosomální RNA – rRNA (80%)
Transferová RNA – tRNA (10 – 15%)
Ribosomální RNA, sekundární struktury: smyčky,
výdutě, helikální úseky
Transferová RNA
3’ konec
Úvod do molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových kyselin
Uchování a přenos genetické informace - replikace
Transkripce
Proteosynthesa a skládání proteinů
Regulace transkripce
Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní
technologie
Metodický přístup molekulární biologie
Přenos genetické informace
Centrální dogma molekulární biologie:
Základní pojmy:
Templát - vázán nekovalentně - matrice, vzor
Replikace, transkripce, translace – řízené polymerace:
Iniciace, elongace, terminace, postsyntetické úpravy (processing)
Primer - vázán kovalentně - iniciátor růstu řetězců
viry
x
Replikace DNA
Konzervativní x Semikonzervativní ? Meselson - Stahlův experiment
Meselsonův a Stahlův
experiment nově
vznikající DNA je
kombinací starého a
nového řetězce:
hybridizace
E.coli v mediu s 15 N
Specifické párování bází umožňuje kopírování
ssDNA slouží jako templát
Vysoká rychlost – genom E.coli 4,8 x 106 bp zkopírován za 40 min!!!
tj. inkorporace 2000 bází/s
lidský genom 6 x 1012 bp - replikace zahájena na více
místech najednou
Replikace
Rozvolnění dvojšroubovicové struktury
v počátku replikace
© Espero Publishing, s.r.o.
Vznik replikační bubliny – replikační vidlička
Polarita DNA-řetězců v replikační vidličce
© Espero Publishing, s.r.o.
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa
Podmínky:
templát
Mg2+
Sumárně: dNTP + (DNA)n (DNA)n+1 + PPi
Specifita:
Vazba 3‘→ 5‘
Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘
Na začátku nutná přítomnost volné
3‘OH - primer
Mechanismus replikace
Asymetričnost replikační vidličky
Dokončení synthesy zpožďujícího se vlákna
DNA polymerasa I
DNA polymerasa III
DNA ligasa
DNA ligasa – propojení Okazakiho fragmnetů
ATP AMP + PPi
Replikace DNA .....
Terminace
Prokaryota – kruhová DNA
Eukaryota – telomery, telomerasy
Vysoká přesnost kopírování je nezbytná!!!
Pravděpodobnost inkorporace chybné base je 1 : 104
Ve skutečnosti pouze 1 : 1010 Opravný mechanismus??
Nukleasová aktivita DNA polymerasy
Stručná historie sekvenování DNA
• První DNA sekvence
– ~1965 - alanin tRNA (77 basí) z kvasinky
• Vývoj metod pro sekvenování DNA
– 1977 - Maxam-Gilbert a Sanger
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa
Podmínky:
templát
Mg2+
Primer s 3‘OH
Sumárně: dNTP + (DNA)n (DNA)n+1 + PPi
Specifita:
Vazba 3‘→ 5‘
Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa
Podmínky:
templát
Mg2+
Sumárně: dNTP + (DNA)n (DNA)n+1 + PPi
Specifita:
Vazba 3‘→ 5‘
Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘
Na začátku nutná přítomnost volné
3‘OH - primer
Sangerova metoda
Založena na použití dideoxynukleotidů
Pro sekvenování je třeba:
• Dostatečný počet kopií DNA
• Vhodný primer
• DNA polymerasa
• „normalní nukleotidy“ v dostatečném množství
• Malé množství dideoxynukleotidů nějak označených (radioaktivně, fluorescenční značkou)
4 reakční směsi:
Elektroforetické
dělení fragmentů
podle Mh
Templát 3’ …CCAAGGGT ………………5’
5’……primer G
GG
GGT
GGTT
GGTTC
GGTTCC
GGTTCCC
GGTTCCCA
-
+
Sangerova metoda
Automatické sekvenování
s využitím fluorescenčně
značených
dideoxynukleotidů
Copyright Bios Publishers Ltd
Realita…..
Amplifikace DNA
Metoda PCR - polymerase chain reaction
Polymerasová řetězová reakce
Amplifikace DNA - PCR (polymerase chain reaction)
Reakční směs:
- Taq polymerasa
- Primery: levý
pravý
- Nukleotidy dNTP
• Materiál pro sekvenování
– Sekvenace genomů (HUGO)
– Diagnostika infekčních onemocnění
– Identifikace poruch na úrovni DNA
– Identifikace osob
– Studium evoluce (zpracování fosilií)
• Základ genových technologií - GMO
Využití PCR:
Úvod do molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových kyselin
Uchování a přenos genetické informace - replikace
Transkripce
Proteosynthesa
Regulace transkripce
Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní
technologie
Metodické přístupy molekulární biologie
Exprese genu
DNA RNA Transkripce
RNA protein Translace
Transkripce
DNA RNA
RNA polymerasa katalyzuje většinu kroků v procesu:
- rozpoznává iniciační místa – promotory
- vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny)
- katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb
- rozpoznává terminační místo
- nemá nukleasovou aktivitu – neopravuje chyby!
Mechanismus syntézy je stejný pro všechny typy RNA
Transkripce
• σ podjednotka:
1. snižuje afinitu RNA polymerasy k nepřepisovaným
oblastem
2. Rozpoznává oblast promotoru
Iniciace - promotor
rozpoznán sigma (σ) podjednotkou RNA polymerasy
prokaryota:
DNA je transkribována enzymem
RNA-polymerázou ( DNA dependentní)
RNAn + NTP → RNAn + 1 + PPi
5´→ 3´
3´→ 5´
- vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny)
- katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb
- rozpoznává terminační místo
Transkripce dvou genů
na snímku z elektronového mikroskopu
© Espero Publishing, s.r.o.
Transkripce mnoha RNA najednou
Není třeba opravovat – RNA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu
Posttranskripční úpravy RNA
• 5' čepička (cap)
• 3 ' konec - poly A ocas (tail)
Prokaryota - bez úprav
Eukaryota -
replikace a transkripce jsou časoprostorově oddělené procesy
Sestřih (splicing)
+
Sestřih RNA
Intergenic Intergenic Gen
Exon Intron Exon Exon Intron
Transkripce pre-mRNA
GT AG AG GT
Exon Exon Exon
Sestřih mRNA
5’
5’
5’
3’
3’
3’
Genom:
Transkriptom:
Translace - proteosynthesa
Probíhá na ribosomech
Mechanismus u všech organismů prakticky stejný
Směr N-konec C-konec
Překlad z jazyka basí do jazyka aminokyselin:
Genetický kód – úkol:
Ze 4 písmen je třeba vytvořit 20 slov :
42 = 16 43 = 64
Dešifrován pomocí syntetických polynukleotidů: poly U → polyphe
Vlastnosti genetického kódu
• Tripletový
• Nepřekrývá se –
• Degenerovaný, pouze trp a met jeden kodon, ostatní více (synonyma)
• Většina synonym se liší basí na třetí pozici
• Degenerace minimalizuje vliv mutací → záměna basí neznamená vždy záměnu AK (Ile, Leu)
• Počet kodonů koreluje s četností výskytu AK v proteinech
• Pouze tři nemají smysl - stop!
• Iniciace – start kodon Met
• Téměř univerzální, výjimky u protozoí a mitochondrií (vlastní sada tRNA)
Proteosynthesa
probíhá na
ribosomech:
rRNA - 80%
buněčných RNA
Ribozymy
25% sušiny E.coli
S = Svedbergův koeficient –
míra rychlosti sedimentace
při centrifugaci
Base → aminokyselina
Vazba AK na tRNA - aminoacyl tRNA synthetasa (ligasa)
sumárně:
AK + tRNA + ATP aminoacyl tRNA + AMP + PPi
Opravný mechanismus – hydrolasová aktivita některých aminoacyl tRNA synthetas
(thr x val)
Iniciace
Elongace – růst peptidového řetězce
Energetická bilance – aktivace AK ekv. 2 ATP
elongace 2 GTP
Terminace – stop kodon, Rf faktor
Proteosynthesa -shrnutí
Exprese genu u prokaryot a eukaryot - shrnutí
• N-glykosidická vazba - Asn
• O-glykosidická vazba - Ser a Thr
fosforylace
Postranslační modifikace proteinů
glykosylace
myristoylace
Posttranslační úpravy proteinů - štěpení
Doprava na místo určení
(targeting)
– signální sekvence pre-
Vznik biologicky aktivní formy z
pro – formy
Příklad - insulin
Regulace genové exprese
• Transkripce a postranskripční procesy
• Degradace RNA
• Translace
• Degradace proteinů
Regulace převážně na úrovni iniciace translace
Konstitutivní geny - kontinuální transkripce – síla promotoru
Indukovatelné a reprimovatelné geny
Příklad: lac operon
Regulace genové exprese
+ regulátor
Operonová teorie:
lac operon
E.coli
Kultivace v mediu
s glc
Při nedostatku glc
náhrada laktosou
PRO
nejoptimističtější scénář:
Zvýšení nutriční hodnoty potravin
Boj s chorobami
Výživa třetího světa
Snížení spotřeby pesticidů
PROTI
nejpesimističtější scénář:
Zvýšení úmrtnosti díky alergickým
reakcím
Nevratné zamoření životního
prostředí
Genové technologie (inženýrství)
Manipulace s genomem a s tím související technologie
Genové technologie (inženýrství)
• Sekvenování celých genomů - tvorba DNA knihoven
• Transkriptomika - Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp.
pathologické situaci
• Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin)
• Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace)
• Klonování organismů -
produkce geneticky identických populací organismů, ale také tvorba kopií DNA
• Genetická modifikace organismů -
vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Oblasti využití:
Amplifikace DNA pomocí plasmidů
Technologie rekombinantní DNA
Základ genových manipulací:
Plasmid – vektor
Restrikční endonukleasy
Restrikční endonukleasy
Příprava plasmidu (vektor) – rekombinantní DNA
1. Vhodný plasmid (resistence k
amp a tet
2. Štěpení restrikčními
endonukleasami
3. ligace insertu
4. Transfekce buněk
5. Selekce buněk nesoucích
plasmid s insertem
Selekce plasmidů nesoucích vloženou DNA
DNA knihovny, YAC, BAC
1) Reversní transkriptasa: RNA Dependentní DNA Polymerasa
2) Každý gen je nejméně jednou zastoupen v DNA knihovně
Chromosom
fragmenty DNA
mRNA
Reversní
cDNA
Transkriptasa
Genové technologie (inženýrství)
• Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven
• Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci
• Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin)
• Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace)
• Klonování organismů
• Genetická modifikace organismů -
vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Oblasti využití:
Instead of putting the foreign
DNA
into a bacterium, put it into a
farm animal that can be milked
so that the factor will be in he
milk. Genetically modified organisms
Genové technologie (inženýrství)
• Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven
• Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci
• Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin)
• Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace)
• Klonování organismů
• Genetická modifikace organismů -
vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Oblasti využití:
Konvenční křížení versus genové technologie
škůdce
Pomalý přirozený
výběr resistentních
rostlin
škůdce
Isolace genu resistence
škůdce
Vložit do jiné rostliny
rychle
nepřirozeně – vedlejší účinky?
Může trvat mnoho generací
Genetické úpravy rostlin
Buňka nesoucí
příslušný gen
DNA
Dělení buněk Transgenní rostlina
A single
gene
transformace
Rostlinná
buňka
Buněčná kultura
Rekonstrukce
rostliny
Studium funkce genů
SIGnAL- SALK Institute Genomic Analysis Laboratory
T-DNA SALK lines
resource for systematic genome-wide functional screens, a "phenome-
ready" genome, Up today 24773 lines, representing 15719 individual
genes are available
Agrobacterium tumefaciens
Příprava cDNA
Transkriptom
DNA mikročipy - analýza exprese
genů
• Microarrays detect gene interactions: 4 colors: – Green: high control
– Red: High sample
– Yellow: Equal
– Black: None
• Problem is to quantify image signals
Proteomika
A toto je realita……
Proteom:
Vnější prostředí
Studium procesů probíhajících v živých organismech
Transkripce
Translace
Proteiny
Vnější projevy
Biochemické procesy
DNA Genom
Transkriptom
Metabolom, Fyziom
Proteom
2D
MS
HPLC
DNA
array
Příprava cDNA
Reversní genetika – studium funkce genů