Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 8 . Mikrosatelity

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

8. Mikrosatelity

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

Mikrosatelity - úvod

Mikrosatelity (SSR = Simple Sequence Repeat; STR = Short Tandem Repeat; SRS = Simple Repetitive Sequence)

jeden z tzv. variabilních repetitivních DNA sekvencí (VNTR = Variable Number Tandem Repeat)

jednotkou je opakující se sekvenční motiv = repetice, např. (CA)n:

CTTGGCGAGCACACACACACACACACACACGGTGACATCTCC

• mono-, di- (AT, AG), tri- (GAA, AGT),... až hexanukleotidy• variabilní počet opakování motivu: ~3-100• motivy >10 repetic obvykle vysoce variabilní

minisatelit mikrosatelit

Další typy repetitivních sekvencí:satelity – dlouhé motivy (2-)100-300(-několik tisíc) bp, velký počet opakování

motivu (1000-100000 a více); okolí centromér chromozomů, tvoří heterochromatin

minisatelity – středně dlouhé motivy ~10-60bp, menší počet opakování (~20-50); subtelomerní (koncové) části chromozomů nebo centromery; využití - RFLP genomové DNA a hybridizace s minisatelitní sondou, nebo arbitrární PCR s primery s minisatelitním motivem – obdoba ISSR)


Charakteristika

u rostlin jsou nejčastější motivy (A)n, (AT)n, (CA)n, (GA)n, (GAA)n

převážně jaderné, A/T motivy i v chloroplastu (ale nižší variabilita)


klasifikace repeats:• simple perfect – čisté opakování motivu, ideální případ (viz výše

uvedené příklady)• imperfect (interrupted) – např. (GT)3A(GT)6

• compound – např. (GA)4N12(CA)8

Charakteristika

vysoce variabilní → populační genetika, studie blízce příbuzných taxonů, detekce klonality

jaderné SSR jsou kodominantní → přesný odhad frekvence alel

vysoce specifický marker pro určitý druh nebo skupinu druhů

vysoce reprodukovatelné krátká délka → umožňuje analýzu i u nekvalitního nebo

starého (herbářového) materiálu s fragmentovanou DNA cena analýzy: zhruba > ISSR, << AFLP


Provedení metody PCR amplifikace konkrétního SSR lokusu: nutné znát primery z

okolí SSR – tzv. flanking regionu:

forward primer ►

◄ reverse primer

délka amplikonů jednotlivých lokusů obvykle 100-500 bp volena tak, aby se lokusy navzájem co nejvíce lišily

Mikrosatelity – princip metody

forward primer

reverseprimer

Provedení metody délková variabilita výsledného PCR produktu odráží počet

opakování motivu (repetic) v minulosti vizualizace např. denaturační PAA elektroforézou:

PAA (data z 1 lokusu)


Provedení metody délková variabilita výsledného PCR produktu odráží počet

opakování motivu (repetic) v současnosti obvykle pomocí fragmentační analýzy – PCR s

fluorescenčně značenými primery:

FA - 3 barevně odlišené lokusy (+ červený size standard)


lokus 1

lokus 2

lokus 3

PCR se značenými primery: specifický forward primer syntetizován v fluorescenčně značené modifikaci nebo M13 universal tail protokol (není nutné draze značit jednotlivé forward

primery daných SSR lokusů samostatně; univerzální značené primery lze použít na jakékoli druhy organismů) PCR s 3 primery:

• specifický forward primer na 5´ konci s M13 universal tail sekvencí• druhý forward M13 primer s fluorescenční modifikací• reverse primer bez modifikace


Schuelke M. 2000. An economic method for the fluorescent labeling of PCR products. Nat. Biotechnol. 18: 233-234.

v prvních cyklech PCR je Ta nastavena tak, aby u forward primeru nasedala pouze jeho specifická část ...

v pozdějších cyklech PCR je Ta snížena a na M13 tail produktu nasedá druhý forward primer – M13 s fluor. modifikací

... ve výsledné směsi pak převládají produkty s fluor. značeným koncem

M13 tail sekvence

sekvence specifická pro daný lokus

Provedení metody amplifikace lokusů daného vzorku smíchány (pool), každý vzorek

analyzován fragm. analýzou na kapilárním sekvenátoru nepodceňovat barevný design analýzy – barvy pro jednotlivé lokusy

rozvrhnout tak, aby bylo možné do jedné fragm. analýzy zahrnout (optimálně) všechny analyzované lokusy: sekvenátory obvykle umožňují detekci 4 různých fluor. barev (např. 6- FAM, VIC, NED, PET) lokusy s nápadně odlišnými délkami lze značit stejnou barvou


5 zelených lokusů...plus 3 modré lokusy...plus 2 černé (= žluté) lokusy...... a ještě 1 červený lokus = celkem 11 lokusů v jedné F. A.

délkově blízké/překrývající se lokusy nutno barevně odlišit!

Provedení metody možnost tzv. multiplex PCR: v jedné reakci namíchány primerové

páry pro více lokusů → každý pár naamplifikuje specificky svůj lokus může značně šetřit čas a peníze primerové páry se ale nesmí příliš lišit parametry PCR amplifikace (teplota nasedání primerů, délka elongace apod.) při použití M13 tailu dávat do multiplexu jen lokusy značené stejnou barvou! existují komerční PCR mixy specializované pro multiplex PCR


multiplex. amplifikace 3 SSR lokusů (Spergularia echinosperma, P. Kúr)

100 bp ladder

◄

◄◄

Odečítání SSR alel: u diploidů (nebo haploidní fáze živ. cyklu) lze přesně odečíst, které

alely (=délkové varianty) jsou v genomu přítomny nutné znát délku repetice (mono-, di-, tri- atd. nukleotid) zohlednit tzv. stutter bands: artefakty PCR, sklouzáváním polymerázy

(polymeráza ale nejčastěji tvoří fragmenty správné délky → převládají nad artefakty); ztěžují interpretaci lokusů s >~20 repeticemi

(stutter bands)alely: 161+161

vzdálenost Stutter Bands = délka repetice, např. 2bp


*

PAA gel:fragmentační analýza:

SB

SB

SB SBSBSB

SB

SB

SB

SB

alela

alela

Odečítání SSR alel: u diploidů (nebo haploidní fáze živ. cyklu) lze přesně odečíst, které

alely (=délkové varianty) jsou v genomu přítomny nutné znát délku repetice (mono-, di-, tri- atd. nukleotid) zohlednit tzv. stutter bands: artefakty PCR, sklouzáváním polymerázy

(polymeráza ale nejčastěji tvoří fragmenty správné délky → převládají nad artefakty); ztěžují interpretaci lokusů s >~20 repeticemi

homozygot je, když: nápadně nejvyšší pík je napravo, reálná alela = nejvyšší pík

ostatní patterny → heterozygot!

(stutter bands)alely: 161+161

vzdálenost stutter bands = délka repetice, např. 2bp


Odečítání SSR alel:heterozygot: reálné alely jsou dva nejvyšší píky

! heterozygot: reálné alely jsou dva nejvyšší píky vpravo (alely se liší o délku depetice – 161 a 163; delší 163 svými stuttery navyšuje píky směrem nalevo)

alely: 152+160

alely: 161+163


Odečítání SSR alel: u některých lokusů mohou být A-produkty: terminální transferázová

aktivita Taq polymerázy → na konec PCR produktu přidává A

homozygot

(A-produkty)

(pro srovnání - heterozygot bez A-produktů) alely: 161+163

alely: 151+151

(vzdálenost A-produktů od alely příp. klasických stutter bands = 1bp)

(2bp)


nemůže být druhou alelou heterozygota: nesedělo by násobkům dinukleotidové repetice!!!

+A

(2bp)

Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: u vyšších ploidií často nemožné přesně odečíst konstituci alel

např. když u tetraploida vidíme 2 alely - 160 a 162, tak může být:2x(160)+2x(162)3x(160)+162160+3x(162)


skóruje se např. jako dominantní (absence/presence, matice 0/1)

ideální případ – zřejmě 4 různé alely zřejmě 2 alely, ale jejich relativní zastoupení v genotypu nelze interpretovat (nesedí na 2:2, ale ani na 3:1)

tetraploidní data – Euphrasia (Š. Svobodová):

(SB)

***** *

• výška píků pro určení poměru alel příliš nepomůže – někdy ovlivněna stuttery sousední alely, nebo poměr alel vychýlen PCR bias:

Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: allelic dropout: jedna z alel heterozygota se nenaamplifikuje = jedinec se jeví

jako homozygot


dropout alely 149

příčiny: • nízká kvalita templátové DNA • PCR bias - preferenční amplifikace (obvykle kratší) alely

• u problematických vzorků se vyplatí analýza replikátů PCR - testování error rate, poolování replikátů daného lokusu před fragm. analýzou redukuje PCR bias

Pompanon F. et al. 2005. Genotyping errors: Causes, consequences and solutions. Nature Reviews Genetics, 6: 847-859.

nulové alely: mutace v místě nasedání primerů → žádný PCR produkt, nebo allelic dropout některé z alel

Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: ´stegosaur´ alely s velkým počtem repetic (ca >20-30): výrazné a četné stuttery

→ obtížné stanovení velikosti alely


pull-up peaks: intenzivní amplifikace jedné barvy ´vytahuje´ zdánlivou amplifikaci dalších barev (kopírují i její stutter pattern!)

Selkoe K. A., Toonen R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 9: 615-629.

z publikací nebo databází:x předpokladem je, že někdo už s daným organismem pracoval

pokud není dostupné přímo pro náš cílový organismus, můžeme zkusit primery navržené pro příbuzné druhy = cross-species amplification

pokusit se vyvinout vlastní, tzv. izolace SSR

Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů?

Cross-species amplification: s rostoucí evol. vzdáleností klesá úspěšnost obvykle nutná optimalizace podmínek PCR, ne všechny lokusy se

podaří naamplifikovat, případně neamplifikují všechny vzorky = nulové alely

i pokud primery amplifikují, může mít lokus např. sníženou variabilitu:

primery izolované z mechu Scorpidium cossonii – např. lokus (GT)16:testován u Hamatocaulis vernicosus – nedostatečná variabilita, pouze 5 repetic:


Izolace SSR: několik různých protokolů

• tvorba SSR-enriched genomic library (obohacené knihovny)• pomocí AFLP markerů• pomocí ISSR markerů• z EST library – expressed sequence tag:

total mRNA → cDNA → hledání SSR a design primerůSSR z okolí kódujících oblastí → větší šance na úspěšnou cross-species amplification

možné využít i komerční služby vše většinou relativně finančně náročné (~40 tis. Kč a více)


Příprava SSR-enriched genomic library1. Izolace většího množství (~10-20 µg) kvalitní genomové DNA2. Restrikce genomové DNA na fragmenty které lze sekvenovat (~500-1000 bp)

3. Na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a ligaci při klonování

+ restr. enzym

+ T4 ligáza, linkery


Příprava SSR-enriched genomic library4. K fragmentům přidána biotinylovaná sonda nesoucí určitý SSR motiv →

naváže se (hybridizuje) na fragmenty s daným SSR motivem

teplotní denaturace

+ sonda

5. Magnetické mikročástice (beads) pokryté streptavidinem → vazbou streptavidin-biotin vychytají fragmenty se SSR → vlastní SSR-enriched library (obohacená knihovna)

separace magnetem

+ roztok streptavidin-coated

beadsodsátí roztoku


Zpracování SSR-enriched genomic library6. PCR amplifikace fragmentů enriched library (sekvence linkerů slouží jako

PCR primery) a jejich klonování → separace jednotlivých molekul7. Klony screenovány sekvenací (případně předběžné ověření Southern blotting

s příslušnou SSR sondou, nebo PCR s primerem nesoucím SSR motiv)

8. Design primerů, jejich PCR testování - zda netvoří nulové alely, zda jsou dostatečně variabilní…


Vypadá to (relativně) snadně, ale:

ne všechny SSR sondy na daný organismus fungují... jen zlomek (~5-15%) fragmentů obohacené knihovny nese skutečně

SSR... část SSR nepoužitelných - příliš krátké nebo naopak příliš dlouhé,

případně složité compound motivy... ne pro všechny fragmenty se podaří nadesignovat primery... ne všechny navržené primery skutečně fungují na vzorcích ...


Komerční služby:

např. osekvenování celého cílového genomu pomocí 454-pyrosekvenování (~30 tis. Kč, ale cena 1 sekvence je ~200x nižší než při klasickém sekvenování Sangerovou metodou):• získá se velké množství (desítky tisíc) sekvencí o délce ~550 bp,

zlomek z nich obsahuje SSR nebo stejným způsobem osekvenovat vlastní SSR-enriched library

(efektivnější než sekvenace genomu - vyšší výtěžek SSR fragmentů) firmy často poskytnou i navržené primerové kombinace


Chloplastové mikrosatelity (cpSSR)► obvykle opakování jedné báze, větš. A / T

» roztroušeně v cp genomu; poly-A/T úseky v sekvencích…

► chloroplastový genom obecně stabilnější než jaderný → „univerzální“ cpSSR primery (funkční minimálně pro příbuzné druhy, někdy ale i mezi čeleděmi)

► Mutační rychlost v řádu 10-5 / generace» u jaderných mikrosatelitů více, ale odhady se různí (10-5 – 10-3)» u jiných nekódujících chloroplastových úseků méně (10-9)

► Využití pro „středně“ rychlé procesy» Haploidní → 1/2 efektivní velikost populace, citlivé na gen. drift» původ / fylogeneze / hybridizace příbuzných druhů» vnitrodruhová variabilita (fragmentace popul., fylogeografie,…)» …a spousta studií na užitkových rostlinách

Vyhodnocení mikrosatelitových dat► Kodominantní

» základní statistiky viz přednáška allozymy• počet alel, polymorfní lokusy,…• podíl heterozygotů, He, HW rovnováha,…

► Nulové alely» mutace v místě nasedání primerů» nevzniká žádný produkt, jedinec hodnocen jako homozygot» podhodnocení počtu heterozygotů» lze odhalit jen při křížení / analýze potomstva

Vyhodnocení mikrosatelitových dat► U vyšších ploidií problém s určením počtu alel heterozygotů

» AAAB vs. AABB vs. ABBB» prakticky nelze z intenzit píků / proužků!

► Co s tím?» kódovat přítomnost / nepřítomnost alely = binární data

• ztráta informace» za předpokladu allotetraploidie a pokud převažují vzorky s 1-2

alelami kódovat jako diploida• automaticky předpokládá AABB• problém, pokud jsou 3- nebo 4-alelické vzorky• možné zkreslení výsledků

» pravděpodobnostní výpočty, odhady frekvence alel• např. program ATETRA

Mutační modely► Diferenciace mezi populacemi – analogie FST, výpočet gene- tických

vzdáleností,…► Infinite alleles model (IAM)

» všechny alely rovnocenné, stejná rychlost jejich tvorby» stejně dlouhé alely homologické (identity by descent, IBD)» toto se používá také pro isozymy, ISSR, AFLP,…

► Stepwise mutation model (SMM) – nejčastěji používaný» alely vznikají postupně mutacemi o 1 krok (repetici), stejná rychlost v obou

směrech (prodloužení × zkrácení)» alely s podobnou délkou jsou si příbuznější» možná homoplazie, alela vzniká přidáním nebo zkrácením (identity in

state, IIS)» koeficient RST, resp. jeho odhad ρST, distance D1, Da, (δμ)2

► Two-phase model (TPM)» změna o jednotku rychlostí p, o více jednotek rychlostí 1-p

Mutační modely► Identity by descent (IBD)

» Stejně dlouhé alely jsou homologické (od společného předka)

► Identity in state (IIS)» Stejně dlouhé alely nejsou homologické (nemají spol. předka)

…(AT)7… …(AT)8… …(AT)8… …(AT)9… …(AT)8… …(AT)9…

…(AT)8… …(AT)8… …(AT)8…

…(AT)8… …(AT)7…

IBDIIS IIS

Identifikace klonů► Multilokusové genotypy, shoda = klon (?)

» výpočet pravděpodobnosti, že stejný genotyp vznikle nezávisle pohlavním rozmnožováním

» statistika PSEX (PGEN) (Parks & Werth 1993, Am. J. Bot.)• počítáno z frekvence alel a polymorfních lokusů a počtu vzorků• klony = pouze pokud PSEX < 0.05 (nebo jiná hranice)

» clonal diversity: R = (G – 1) / (N – 1) (pro 1 klon pak vyjde 0)

► Různá rozlišovací síla» počet lokusů» jejich variabilita (počet

a frekvence alel)dvě populace Cymodoce nodosa

Arnaud-Haond et al. 2005J. Heredity 96: 434-440

Populační studie – ochranářská

struktura populace, pole = 10 cm

Betty & Provan 2011, Ann. Bot. 107: 663–670

► Monotropa hypopitis v Sev. Irsku ► 8 lokusů, průměr 14 alel / lokus► F-statist., AMOVA, určení klonů

► překvapivě velký počet klonů, malý podíl vegetativního rozmn.

► FIS: v některých populacích hodně autogamie► He: ochuzení proti střední Evropě ► mírná diferenciace

mezi populacemi → nemíchat materiál, outbreeding depression

Populační studie - invazníHuotari et al. 2011, Plant Syst. Evol. 294: 27-37► Elodea canadensis ve Finsku► předpoklad: klonální (dvojdomý, v

v Evropě chybí ♂), 1 zavlečení► 7 popul., 10 lokusů, 2-5 alel / lokus► zákl. statistiky, RST, pairwaise FST,

AMOVA, STRUCTURE

► 181 vzorků / 80 multi-locus genotypes► skoro 80% variability uvnitř populací, diferenciace mezi pop., potvrzuje

i STRUCTURE (2 hlavní skupiny)► rozdíly proti americkým populacím (někt. lokusy se ani neamplifikují)

→ možná relativně rychlá evoluce► vícenásobné zavlečení × evoluce somatickými mutacemi ?

Klonalita + rozmnožovací systémZipperle et al. 2011, Ann. Bot. 107: 127–134

► porost Zostera noltii na pří-livových plošinách v Baltu

► trvalka, ale velký obrat ramet a náhrada ze semen

► hermafrodit, hydrogamní, předpokládáno opylovánív rámci „fleku“ (klonu) → inbreeding

► plocha 100m2, 256 plodných lodyh, analýza dosp. + semena

► 9 lokusů, klonální struktura, F-statist., hetero-zygozita, původ semen (MLTR, Cervus)

Klonalita + rozmnožovací systémZipperle et al. 2011, Ann. Bot. 107: 127–134

► vysoká míra cizosprášení (~ 90%), zbytek převážně auto- a geitonogamie, velmi málo biparental imbreeding (opylení od jiného, ale příbuzného jedince)

► semena v rámci květenství většinou mají různé otce

► ale jen 50% vajíček je oplodněno – vysvětlováno obecně nedostatkem pylu (třeba 104-105 zrn na jedno vajíčko)

► efektivní vzdálenost šíření pylu je pouze několik m

► dále je v článku diskutován vliv režimu disturbancí na rozmnožování a přežívání populace…

HybridizaceSnow et al. 2010, Am. J. Bot. 97: 2061–2067► Typha latifolia (pův.), T. angustifolia (pův?,

zavlečená), T. ×glauca (invaz) v Americe► kříženec údajně sterilní, silně klonální► starší studie 30 druhově specifických RAPD,

nyní 9 SSR primerů, 7 druhově (±) specifické► FST, STRUCTURE, morfometika

► F1 hybridi kombinují alely od obou rodičů► existují zpětní hybridi

(→ není to sterilní) ► potvrzuje i

morfologie

Vývoj areálu / fylogeografieKuss et al. 2011, Persp Plant Ecol. Evol. Syst. 13: 101–110► Campanula thyrsoides v Alpách, 2 poddruhy

JV Alpy × zbytek (S obvod Alp)► 51 populací, 5 lokusů► populační variabilita, STRUCTURE, AMOVA,

výpočet hranic v programu Barriershttp://www.mnhn.fr/mnhn/ecoanthropologie/software/barrier.html

► zjištěny 3 významnější zlomy v geneticképodobnostinamapování gen. nepo-dobností sousedůvýběr nejvyšší hodnoty,protažení hranice kokrajům; další kolo,…bootstrap (100 matic)

Vývoj areálu / fylogeografieKuss et al. 2011, Persp. Plant Ecol. Evol. Syst. 13: 101–110► 4 genetické skupiny, 1

výrazně jiná (JV poddruh)► hranice skupin souhlasí

s programem Barriers► asi alopatricky se vyvíje-

jící skupiny + pozdějšíkontakt a tok genů

► souvislost s přežitím zalednění (2 poddruhy, v severním asi více refugií)

► …ale populace z potenciálně refugiálních míst (stanovených podle jiných prací) nejsou geneticky bohatší, rozdíly možná později setřeny genovým tokem

Fylogeografie - cpSSR

Quintela-Sabarís et al. 2011, Plant Biol. 13: 391-400► Cistus ladanifer, 38 populací, testováno 10 úseků

cpSSR, z toho variabilní 2» vnitropopulační diverzita, mezipo-

pulační rozdíly (GST, RST), AMOVAhaplotypová síť,…

» PCoA, Barriers, SAMOVASpatial AMOVA (Dupanloup et al. 2002)se snaží rozdělit populace do K skupin, geograficky homogenních s min. vnitro- a max. meziskupinovou variabilitou

► 6 + 3 alely → 11 haplotypů► 3 hlavní skupiny, 2 reliktní (H7, H8) a 1

široce rozšířená (H4, H5)► ancestrální asi H8, přišlo to z Maroka

Fylogeneze, vymezení taxonů► použití pro fylogenezi možné, ale se značným omezením (sice velká

variabilta, ale i spousta nevýhod):» neznáme rozmístění lokusů v genomu, lokus je „bodová“ informace

(méně informace než 1 sekvenovaný úsek!) → použít víc lokusů, ideálně fyzická mapa

» problémy s homologií (fylogeneze potřebuje IBD, ne IIS)→ pouze u blízkých druhů a na nižších úrovních

» neznámá mutační dynamika, nelze použít mutační modely – z běžných metod konstrukce stromů zbývá pouze maximální parsimonie a distanční metody (např. neighbour-joining)

► použití pro vymezení (kryptických) druhů / linií:Ramaiya et al. 2010, Am. J. Bot. 97: 1707–1718» játrovka Frullania asagrayana, sekvenčně zcela uniformní, ale SSR

ukazují na přítomnost 2 linií

FylogenezeKim et al. 2012, Plant Syst. Evol. 298: 811–817► rod Schoenoplectiella (Cyperaceae), prob-

lémy s vymezením druhů, asi hybridizace,ale rodiče hybrida nejasní

► 6 SSR lokusů; polyploidi → prezence / absence alel

► MP a NJ strom, STRUCTURE

► 59 alel, některé druhově specifické► 2 hlavní příbuzenské skupiny► potvrzeny všechny druhy, vč. 1 morfolo-

gicky slabě vymezeného (geneticky jasný)► předpokládaný hybrid není hybrid, ale slabě

diferencované populace jednoho z druhů

Software► MSA (Microsatellite Analyzer)

http://i122server.vu-wien.ac.at/MSA/MSA_download.html► MICROSAT

http://hpgl.stanford.edu/projects/microsat/► The Excel Microsatellite Toolkit http://www.animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-

toolkit/kontrola dat, převod do formátů pro Arlequin, Microsat, Fstat,…

► ATETRAhttp://www.vub.ac.be/APNA/ATetra.htmlodhad frekvencí alel a genotypů u tetraploidů

► Cervushttp://www.animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit/frekvence alel, parentage analysis (kodominantní data, diploidi)

► Genclonehttp://www.ccmar.ualg.pt/maree/software.php?soft=genclonidentifikace multilokusových genotypů, výpočet Psex, kinship coefficient,…

Date post:	18-Mar-2016
Category:	Documents
Upload:	min
View:	92 times
Download:	5 times

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 8 . Mikrosatelity

Documents