Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mM), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mM Tris, pH 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 °C a byl sledován přírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.

Sledování průběhu separace

Metoda Koncentrace bílkovin [mg/ml]

Objem

[ml]

Celková aktivita [U]

buněčný extrakt

258,1 20 4000

(NH4)2SO4 118,1 9 4053

HIC 57,5 6 3565

GPC 19,3 2 2565

Metoda Koncentrace bílkovin [mg/ml]

Objem

[ml]

Celková aktivita

[U]

Specifická aktivita [U/mg]

Stupeň přečištění

Výtěžek

[%]

buněčný extrakt

258,1 20 4000 0,77

- 100

(NH4)2SO4 118,1 9 4053

3,81 4,9 101 HIC 57,5 6 3565

10,33 13,3 89 GPC 19,3 2 2565

66,45 85,8 64

Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mM maltosy a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 °C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na2CO3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 °C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm3.cm-1.mol-1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?

Afinitní chromatografie

Matrix Spacer arm

afinitní ligand

+

1. afinitní chromatografie

Matrix Spacer arm

ligand protilátka

+

2. Imunoafinitní chromatografie Proteinový epitop

protein

Princip afinitní chromatografie

enzym analog substrátu, inhibitor, kofaktor

protilátka antigen,virus, buňka

lektin polysacharid, glykoprotein, buněčný povrch, receptor

nukleová kys. komplementární sekvence, histony, DNA/RNA polymerasy, DNA/RNA vázající proteiny

hormon, vitamin receptor, přenašeče

Příklady afinitních interakcí

•nejčastěji agarosa (Sepharosa) •ligand kovalentně navázaný přes –OH skupinu cukerné jednotky nosiče •velké póry umožňující průnik velkých molekul •co nejnižší nespecifické adsorbce •ligandy:

•specifické •reversibilní vazba •schopnost navázat na nosič bez ovlivnění vazby •vazba na protein nesmí být ani slabá ani silná

Stacionární fáze

Ligand x raménko •ligand Mr<1000 – raménko

•krátké raménko – látka se na ligand špatně váže •dlouhé raménko – možná nespecifická vazba – snížení selektivity

•velká hustota ligandů - sterická nepřístupnost přebytečných ligandů

Vhodné vazebné a eluční podmínky

ideální podmínky

vazba mezi ligandem a purifikovanou molekulou

[LP][L].[P]KD =

vazba KD 10-6 - 10-4 M eluce KD 10-1 - 10-2 M

KD > 10-4 ~ slabá interakce

KD < 10-6 ~ silná interakce obtížná eluce

Možnosti eluce

Metoda 1 změna pH nebo iontové síly Metoda 2 Extremní pH nebo vysoká koncentrace močoviny nebo guanidin hydrochloridu Metoda 3 a 4 přídavek kompetičního činidla

Gradientová x skoková eluce

pomalá vazba pomalá desorpce

Typy afinitních ligandů Ligandy používané pro mono-specifickou afinitní chromatografii

Látky používané pro připojování ligandů aktivátor skupina ligandu N-hydroxysukcinimid (NHS) -NH2 CNBr -NH2 Karbodiimid -NH2, -COOH Epoxid -SH, -NH2, -OH …

N-hydroxysukcinimid (NHS-Sepharosa)

•připojení přes amino skupinu (často protilátka nebo antigen) •první výběr při přípravě imunospecifického média

> 30 mg / 1 ml nosiče

CNBr (CNBr aktivovaná Sepharosa) •alternativa k NHS aktivované Sepharose •vazba přes primární aminoskupinu nebo přes jinou nukleofilní skupinu •vhodná pro větší ligandy •proteiny, peptidy, aminokyseliny, nukleové kyseliny

N, N'-disubstituovaný karbondiimid

ECH Sepharosa + ligand-NH2

•malé ligandy

EAH Sepharosa + ligand-COOH

Epoxid (Epoxy-aktivovaná Sepharosa 6B)

•ligandy obsahující –OH, -NH2, -SH •malé ligandy – cholin, ethanolamin a cukry

Aktivovaná thiolová skupina 1– 2 tvorba disulfidů (reversbilní-DTT) 3– kovalentní chromatografie 4– reakce s těžkými kovy a jejich deriváty např. p-chloromercuribenzoate → mraptidy 5- reakce s alkylovými nebo arylovými halogenidy → thioleterové deriváty 6- reakce s látkami obsahujícími C=O, C=C a N=N

Ligandy používané pro skupinově-specifickou afinitní chromatografii skupinově specifický ligand specifita

Protein A Fc region IgG Protein G Fc region IgG Lektiny glukopyranosylové a mannopyranosylové

skupiny Cibacron Blue široká skupina enzymů, NAD+ dependentní

enzymy, sérový albumin Procion Red NADP+ Lysin plasminogen, rRNA Arginin serinové proteasy Benzamidin serinové proteasy Kalmodulin proteiny regulované kalmodulinem

Heparin kolagulační faktory, lipoproteiny, lipasy, hormony, steroidní receptory, nukleové kyseliny vázající enzymy

Streptavidin Biotin a biotinylované látky Oligo (dT, dA, ...) mRNA, nukleasy Kovové ionty proteiny a peptidy obsahující dostupný His

Protein A a Protein G

protein A – Staphylococcus aureus protein G – Streptococcus purifikace:

monoklonální protilátky IgG polyklonální protilátky IgG imunokomplexy

Heparin

• DNA vázající proteiny – iniciační a elongační faktory, restrikční endonukleasy, DNA ligasa, DNA and RNA polymerasa • inhibitory serinových proteas - antithrombin III • Enzymy – lipoprotein lipasy, koagulační enzymy, superoxid dismutasa • růstové faktory • extracelulární matrixové proteiny • hormonální receptory - androgenní receptory • Lipoproteiny

A hexuronová kyselina - D-glukuronová kyselina nebo L-iduronová kyselina (C-5 epimer) B D-glukosamin R1 = -H nebo -SO3 R2 = -SO3 nebo -COCH3.

Streptavidin •streptavidin - molekula isolovaná z Streptomyces avidinii

•biotinylované protilátky – purifikace antigenů

5‘-AMP-Sepharosa •ATP-dependentní kinasy

2'5‘-ADP-Sepharosa

•NADP+-dependentní dehydrogenasy silně interagují s 2'5‘-ADP

Cibacron™ Blue F3G-A (Blue Sepharosa)

•Cibacron Blue F3G-A ~ „analog“ NAD+ ⇒ enzymy vyžadující kofaktory obsahující adenyl - kinasy, dehydrogenasy

•vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

Procion™ Red (Red Sepharosa)

•enzymy vyžadující kofaktor NADP+

•vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

Konkavalin A •lektin z Canavalia ensiformis (jack bean)

•tetramerní metalloprotein

•větvené mannosidy, cukry s terminální mannosou

nebo glukosou (αMan > αGlc > GlcNAc)

• purifikace glykoproteinů, polysacharidů a glykolipidů

• detekce změn ve složení látek obsahujících cukry

• isolace povrchových buněčných glykoproteinů

„Lentil“ lektin •lektin z Lens culinaris (čočka) •větvené mannosidy obsahující fukosu α−1,6 vázanou na N-acetyl-glukosamin •membranové glykoproteiny, povrchové buněčné antigeny, virální glykoproteiny

•ze semen Triticum vulgare (pšenice)

•homodimerní neglykosylovaný protein

•vazba - N-acetylglukosaminových zbytků, chitobiosového jádra N-oligosacharidů, N-acetylneuraminové kyseliny

Pšeničný lektin

Kalmodulin •vysoce konservovaný regulační protein eukaryotních buněk

•účastní se mnoha buněčných procesů – metabolismus glykogenu, přenos nervových impulsů, regulace, kontrola poměru NAD+/NADP+

•purifikace kalmodulin vázajících proteinů - ATPasy, adenylát cyklasy, protein kinasy, fosfodiesterasy, neurotransmitery

Aktivovaný thiol

•Thiol-obsahující látky • ~ kovalentní chromatografie

Produkce rekombinantních proteinů

M B cyt IB kultivační podmínky

bakteriální kmen expresní systém

produkce rozpustného proteinu

nebo

nerozpustný protein

proteiny vyrobené genovými modifikacemi, při nichž do genomu producenta (obvykle bakterie nebo kvasinky) byl uměle začleněn gen kódující požadovanou bílkovinu z jiného organismu

Rekombinantní fůzní proteiny fůzní kotva imobilizovaný ligand podmínky vazby podmínky eluce

Glutathion S-transferasa GST

redukovaný glutathion Neutrální pH, nedenaturující prostředí, glutathion musí být redukovaný a GST musí být aktivní

volný redukovaný glutathion

Histidinová kotva His-tag

Chelatovaný nikl nebo kobalt

Neutrální pH bez redukčních a oxidačních látek

>200 mM Imidazol, nízké pH, silné chelatační činidlo

Maltose Binding Protein MBP

Amylosa Neutrální pH, nedenaturující prostředí; přídavek NaCl k snížení nespecifické sorbce

maltosa

Protein A IgG Neutrální pH, nedenaturující prostředí

změna pH, iontové síly

Green Fluorescent Protein GFP

Anti-GFP antibody Neutrální pH, nedenaturující prostředí

nízké pH, iontová síla

GST fůzní protein

glutathion S-transferasa

glutathion

SDS elektroforesa

Pharmacia

NNH

CHNH

CH

NH

O

R

CH2 N

OCH2 N

N

O

O

N

OCH2

CHCH2

O

OO

Ni2+

NH OH

O

Histidinová kotva

stacionární fáze: •NiNTA Agarosa •His Bind •HiTrap Chelating

NiNTA Agarosa

„In-fusion“ ligace

MBP (maltosu vázající protein)

GFP (zelený fluorescenční protein)

OHNH

NH

O CH2

OH

NH

O

O

N

N

OH

O

NH

OH

O

O2

Ser 65

Tyr 66

Gly 67

Jak vysvětlit tvorbu inkluzních tělísek v bakteriích?

„misfolded“ špatně sbalený

agregát nativní protein

„overexprese“ proteinu chaperon

příčiny: poměr protein : chaperon velké množství částečně sbaleného proteinu

Inkluzní tělíska u eukaryot

Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000

Dva modely tvorby inkluzních tělísek

Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000

výhody nevýhody Vysoká produkce Obtížná renaturace,

optimální postup nelze předpovědět

IB mohou být isolovány ve vysoké čistotě (40 - 90 %)

Produkce nemůže být sledována testováním aktivity

Proteiny v IB jsou chráněny před proteasami

Hlavní kontaminací jsou oligomery a špatně sbalené nebo štěpené formy proteinu, které je problém odstranit

Možnost produkce toxických proteinů

Výhody a nevýhody inkluzních tělísek (IB)

resuspendace buněčné pelety v pufru s inhibitorem proteas, DTT (5mM) a lysozymem přidat detergent (Triton X-100, DOC) + sonikace přidat DNasu I centrifugace 30 000 x g 30 min 4°C opláchnout peletu pufrem s detergentem rozpustit peletu (inkluzní tělíska) v pufru s 6M guanidin-HCl a 25 mM DTT centrifugace 100 000 x g 10 min – důležitý krok změřit koncentraci proteinů v supernatant

Izolace inklusních tělísek

buňk

y

supe

n.

pele

ta

IB

Solubilizace inkluzních tělísek pufr + denaturační činidlo - 4-6 M guanidin/HCl nebo 8M močovina (! při 4°C krystalizuje)

Alternativa: alkalické pH, detergenty např. N-laurylsarkosin, SDS (0,3 - 5%)

Purifikace denaturovaných proteinů

renaturace → purifikace za nativních podmínek

purifikace za denaturujících podmínek → renaturace

kompatibilita denaturujících podmínek s chromatografiemi

Renaturace hlavní parametry renaturace proteinů

renaturační pufr: typ pufru redoxní systém u proteinů s disulfidovými můstky pH aditiva podmínky: teplota koncentrace proteinu koncentrace aditiva koncentrace redoxního činidla renaturační techniky: ředění dialysa/ultrafiltrace gelová chromatografie na koloně neexistuje univerzální postup!!!

Refolding database

Redoxní systém

pro proteiny s disulfidovými můstky je potřeba optimální koncentrace oxidačního i redukčního činidla, pro umožnění vytvoření správných disulfidových vazeb • glutathion (GSH/GSSH) - 5-15 mol/l, molární poměr red : ox ~ od 1:1 do 10:1

• cystein / cystin

• cysteamin / cystamin

pH reakce > 9 (pKa Cys v denaturovaném proteinu je 8,7)

Typ a koncentrace aditiva

Renaturační kity

Renaturační techniky

Renaturační technika Výhody / nevýhody Dialýza Časová náročnost

Velké objemy pufru Ředění Jednoduchá technika

Záleží na rychlosti ředění Až stonásobně zředěný protein

Gelová chromatografie Sepadace agregátů od renaturovaného proteinu Lze použít vysoké koncentrace proteinu Agregáty může být obtížné vymýt z kolony Pouze malý objem nanášeného vzorku

Renaturace na koloně Jednoduché a rychlé Libovolný objem vzorku

GSH/GSSG

GSH/GSSG

Renaturace na koloně

Koncentrace proteinu

výtěžek renaturace klesá s vyšší počáteční koncentrací proteinu 10 - 50 µg/ml

• SDS-PAGE analýza rozpustné a nerozpustné složky

• testování aktivity

• ELISA ne WB

• cirkulární dichroismus nebo infračervená spektroskopie

• DLS

Analýza renaturovaného proteinu

http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/improving_protein_solubility/

Jak zlepšit rozpustnost rekombinantního proteinu??? • snížit rychlost exprese

• snížení teploty kultivace • použití slabšího promotoru

• změna kultivačního média • přídavek prostetické skupiny nebo kofaktoru • přídavek pufru – kontrola pH • přídavek 1 % glukosy – represe indukce lac promotoru laktosou z

media (LB,…) • přídavek polyolů (sorbitol) nebo sacharosy – zvýšení osmotického

tlaku – akumulace osmoprotektantů v buňce • exprese s chaperony a/nebo enzymy pomáhajícími správně sbalit protein

• GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, ClpB • peptidyl prolyl cis/trans isomerasa (PPI's), disulfidoxidoreduktasa

(DsbA), disulfidisomerasa (DsbC) • cílení do periplasmatického prostoru

• přídavek leader sekvence (pelB , ompT) • disulfidoxidoreduktasa (DsbA), disulfidisomerasa (DsbC)

• použití speciálních kmenů E.coli • AD494 - mutace thioredoxinreduktasy (trxB) • Origami - mutace thioredoxinreduktasy (trxB) + glutathionreduktasy

(gor) • fúzní proteiny

• použití low-copy plasmidu • snížení koncentrace induktoru

použití afinitní chromatografie Mono-specifická AC Skupinově-specifická AC Fůzní proteiny AC

jednokroková purifikace enzymů, receptorů, protilátek ~ s využitím specifických ligandů

jednokroková purifikace proteinů obsahujících obecnější vazebné místo jako jsou některé skupiny protilátek, glykoproteiny, NADP-dependentní proteiny, ...

jednokroková purifikace afinitní část je k proteinu připojena pomocí genového inženýrství

Experiment Mono-specifická AC Skupinově-specifická

AC Fůzní proteiny AC

stacionární fáze

vysoce poresní, dobře přístupné jak pro ligand, tak i pro protein

média jsou komerčně dostupná

média jsou komerčně dostupná

kolona krátké silné krátké silné krátké silné ligandy některé jsou senzitivní k

degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky

některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky

některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky opakované použití pouze pro stejný protein, riziko kontaminace

průtok vazba a desorbce závisí na průtoku

vazba a desorbce závisí na průtoku

vazba a desorbce závisí na průtoku

objem vzorku

nesmí být překročena kapacita kolony pokud je velké KD neměl by být vzorek moc naředěn

nesmí být překročena kapacita kolony

nesmí být překročena kapacita kolony

.