Základy imunologických metod:

Precipitační a aglutinační reakce

Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol

Metody, ve kterých se používají protilátky

Neznačený antigen/protilátka

• Precipitace

• Aglutinace

Značený antigen/protilátka

• Enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA)

• Radioimmunoassay (RIA)

• Western blotting

• Immunofluorescence

• Průtoková cytometrie

Citlivost imunochemických metod

precipitace - 30 mg/ml

aglutinace - 1 mg/ml

nefelometrie – 0,1 mg/ml

radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml

Imunoprecipitační křivka

Charakteristická křivka vyjadřující závislost tvorby imunoprecipitátu na

množství antigenu, přidávaného ke konstantnímu množství protilátky

Oblast nadbytku protilátky

• se zvyšujícím se množstvím antigenu vzrůstá

precipitát. Na všechna vazebná místa antigenu

jsou navázány protilátky. Výsledkem je vznik

malých rozpustných komplexů antigenu a

protilátky, které se vzájemně nepropojují. V

supernatantu neprokazujeme žádný antigen.

• V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu

antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného

antigenu. Tyto reakční poměry se využívají u

imunoturbidimetrie a imunonefelometrie a

nekompetitivních imunoanalýz.

Oblast ekvivalence

• dochází k vzájemnému propojování molekul

antigenu a protilátky a tím vznikají velké

nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou

strukturou, které agregují a vytvářejí

imunoprecipitát. V supernatantu neprokazujeme

volný antigen ani volnou protilátku

• Dosažení ekvivalence se používá u

imunodifúzních metod.

Oblast nadbytku antigenu

• množství precipitátu klesá v důsledku vysoké

koncentrace antigenu. Velké vzájemně propojené

imunokomplexy se rozpadají. Všechna vazebná místa

protilátek jsou vysycena antigenem a některé molekuly

antigenu zůstávají bez navázané protilátky. Vznikají

malé rozpustné imunokomplexy. V supernatantu nejsou

přítomny volné protilátky, ale vzestupné množství

volného antigenu.

• Podmínka nadbytku antigenu musí být splněna u

kompetitivních imunoanalýz.

Precipitační reakce

Imunoprecipitační křivka je základem pro různé

imunochemické metody, které mohou být prováděny v gelu

nebo v roztoku

Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek -

ve zkumavce

Řada metod založených na měření stupně zákalu – turbidity

Turbidimetrie - optická metoda založená na měření

procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích

Nefelometrie měří rozptýlené (tzv. Tyndallovo) světlo , které

vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je

odlišný od směru dopadajícího záření.

Precipitační reakce v gelu

Imunoprecipitační metody v gelu:

•Radiální imunodifuze

•Dvojitá difuze

•Imunoelektroforéza

Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí

gelu

Jedna z nejstarších imunologických metod, dnes ji

nahrazuje nefelometrie

Velká pracnost, nízký rozsah měření a časová náročnost (až

48 h)

Radiální imunodifuze

Protilátka je rozpuštěná v gelu;

Ag je přidán do jamek

Měření koncentrace různých sérových

proteinů, např. hladiny imunoglobulinů

Dvojitá difuze

Identické Neidentické Částečně identické

Ab a Ag difundují proti sobě

• Stanovení homogenity systému antigen-protilátka

• Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění

• Používáno následně po purifikaci směsi antigenů

• Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny

Dvojitá imunodifuze

Ouchterlony

Örjan Ouchterlony

Vyvinul techniku

dvojité imunodifuze v

roce 1948

Dvojitá difuze (Ouchterlony)

Dvojitá difuze

Dvojitá difuze

Dvojitá difuze

Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací

pomocí dvojité difuze

detekce přítomnosti nebo absence proteinu v séru

Imunofixační elektroforéza (IFE)

• Stále používaná metoda pro stanovení

monoklonální gamapatie a typu Ig řetězců

• Monoklonální gamapatie je onemocnění, při kterém

jeden klon plazmatických buněk produkuje vyšší

hladiny protilátky – tato protilátka má těžký řetězec

jednoho typu a jeden idiotyp (nazývá se paraprotein

nebo M-protein)

• Po elektroforetické separaci proteinů vyšetřovaného

séra se na gel nanesou protilátky anti IgG, anti IgA,

anti IgM, anti kappa a anti lambda

Imunofixační elektroforéza (IFE)

Raketková imunoelektroforézaAntigen je podroben elektroforéze v gelu obsahujícím protilátku

Vzdálenost od startovací jamky k vrcholu raketky odpovídá koncentraci antigenu

Aglutinační reakce

• Přímá aglutinace

• Pasivní aglutinace

• Inhibice aglutinace

Ab + částicový Ag Aglutinace (shlukování)

Nenáročná, rychlá a levná metoda, ale:

Aglutinují pouze protilátky třídy IgG a IgM

Nevýhodou je nízká citlivost (0,2 – 2 µg/ml)

Částice s navázanou protilátkou mají tendenci se

při skladování shlukovat

Přímá aglutinace

• Ag je přirozenou složkou částice

• Např. testování pacientova séra na přítomnost

protilátek proti určité bakterii:

– Pacientovo sérum je sériově ředěno do zkumavek

s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou

aglutinací určuje titr protilátky v séru

Přímá aglutinace• Stanovení protilátek proti erytrocytům

• Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může

být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG

protilátky)

• Řešení: Coombsův test - použití anti

imunoglobulinového séra

Příklad: detekce anti-Rh protilátek v krvi Rh- matek

Coombsův Test

• Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami

• Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Po promytí se přidá Coombsovo činidlo

• stanovení Rh protilátek

• diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)

Přímý a nepřímý Coombsův test

Měření

vázané

protilátky

Měření sérové

protilátky

Pasivní aglutinace

• Aglutinace mezi protilátkou a solubilním

antigenem vázaným na nesolubilní částici

(latexová částice)

• Mnohonásobné zvýšení citlivosti oproti

precipitační reakci

• Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních

onemocnění

– Diagnostika autoimunitní thyroitidy:

Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit

k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta

- Diagnostika revmatoidní artritidy

Inhibice aglutinace

• velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých

množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové

partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag,

která aglutinuje.

• Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje

aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab.

• Průkaz užívání drog (kokain, heroin).

• Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice

hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k

diagnostice (zarděnky, chřipka).

Inhibice aglutinace

• Kompetice se solubilním Ag

+

Prior to Test

+ +

Test

Patient’s sample

Inhibice aglutinace

V řadě A jsou pozitivní jamky 1-8

Průkaz HCG v moči

Hemaglutinace