ZZááklady klonovklady klonováánníí a genova genovéého ho ininžženýrstvenýrstvíí

KBC/BAM KBC/BAM -- PokroPokroččililéé biochemickbiochemickéé a biotechnologicka biotechnologickéé metodymetody

KLONOVKLONOVÁÁNNÍÍMolekulMolekuláárnrníí klonovklonováánníí::•• multimultikrokový proces který vytvokrokový proces který vytvořříí kolekci definovaných fragmentkolekci definovaných fragmentůů dandanéé DNA DNA

•• spojenspojeníí vybraných DNA fragmentvybraných DNA fragmentůů (v(věěttššinou jednoho genu) se speciinou jednoho genu) se speciáálnlníím m nosinosiččem em –– vektorvektor

•• ppřřenos vzniklenos vznikléého konstruktu do ho konstruktu do žživých bunivých buněěk (k (ččasto baktasto baktéérie) rie)

•• mnohonmnohonáásobnsobnéé namnonamnožženeníí vlovložžených DNA fragmentených DNA fragmentůů replikaci v replikaci v žživivéé bubuňňce ce ––DNA KLONYDNA KLONY

BunBuněčěčnnéé klonovklonováánníí::

•• vytvvytváářřeneníí geneticky identických bungeneticky identických buněěk (organismk (organismůů))

•• v v žživivéé ppřříírodroděě ppřřirozenirozenéé: kolonie bakt: kolonie baktéériiriiřříízkovzkováánníí rostlinrostlinjednovajejednovaječčnnáá dvojdvojččataata

umuměělléé ►►

VyuVyužžititíí molekulmolekuláárnrníího klonovho klonováánníí

zemědělství

farmaceutika

medicínaprůmysl

základní výzkum

• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny)

• produkce proteinů pro různorodé využití• vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)

k4

Snímek 3

k4 retinis pigmentosa5 milionu lidi na svetephotoreceptor glycoprotein peripherinkokos; 18.4.2010

PPřřííprava prava knockknock--outout organismuorganismu

pozitivní selekce na neomycin (gen M)

inserční vektor substituční vektor

knockoutovanknockoutovanáá mymyšš• gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru• gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu)

do jeho ORF• transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu• vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky• selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu)

gen v genomu EKBExon 1Exon 2Exon 3Exon 4

homologní rekombinace a přerušení genu

inzerční vektor

knockoutovanknockoutovanáá mymyšš• PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ

REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) • možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci• do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa)

mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také tento gen

• selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk• náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají

NeoR HSVtk

Gene s

egmen

t 1

Gene s

egmen

t 2

linearizovaný substituční vektorhomologní rekombinace

NeoR

NeoR+/ HSVtk-

náhodná integrace

NeoR+/ HSVtk+

ZINC FINGER NUCLEASES

CÍLENÁ MANIPULACE V GENOMU příprava knockoutovaných linií organismů

PŘIROZENÁREKOMBINACE

oprava dvouřetězcových zlomůreakce na poškození DNA

HRHR – homologní rekombinace

NHEJ NHEJ – nehomologní lepení konců

ZINC FINGER NUCLEASESchimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných „zinkové prsty“

pg5

Snímek 9

pg5 The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site.galuszka; 21.4.2010

ZINC FINGER NUCLEASES

Testování specifity ZFN

Knock-out genu pomocí ZFN

Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

pg6pg7

Snímek 12

pg6 CCR5 - chemokinovy receptorklinicke testy 18 pacientudeletovany homozygot je immunni vuci AIDSgaluszka; 21.4.2010

pg7 alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemiigaluszka; 21.4.2010

KLONOVACKLONOVACÍÍ VEKTORYVEKTORYA) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDYPLASMIDY

• přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb

• replikují se nezávisle na baktérii

• vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených

19701970 -- pBRpBR ((BolivarBolivar a a RodriguezRodriguez))

• 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli

• oriVoriV vlastní počátek replikace• rezistence k Amp a Tc• unikátní restrikční místa • kapacita pro inzertovou DNA 11--5 kb5 kb

ori

MCS (MCS (multiple cloning site - polylinker)

Unikátní synteticky vytvořenásekvence, obsahující za sebou

jdoucí restrikční místa frekventovaných restrikčních

endonukleas

popoččáátek replikace tek replikace oriVoriV

• cca 300 bp

• kóduje sekvenci „antisense“ RNA,

která iniciuje DNA replikaci (slouží

jako primer)

• regulace: „high copy plasmid“ např.

ColE1

• vzájemná inkompatibilita

agarosovagarosováá elektroforesa plasmidovelektroforesa plasmidovéé DNADNA

3 kb3 kb

4 kb4 kb

8 kb8 kb6 kb6 kb

linearizovanýlinearizovaný plasmidplasmid

ococ forma forma plasmiduplasmidu

cccccc forma forma plasmiduplasmidu

cccccc –– covalentlycovalently closedclosed circlecircleococ –– openopen circlecircle

cccccc ococ

genomickgenomickáá DNADNA

izolace plasmidovizolace plasmidovéé DNADNA•• metoda alkalickmetoda alkalickéé denaturacedenaturace•• cccccc plasmidovplasmidováá DNA je stabilnDNA je stabilněějjšíší v alkalickv alkalickéém m pHpH•• linearnlinearníí genomickgenomickáá DNA se pDNA se přři i pHpH 12 12 -- 12.5 denaturuje a pak p12.5 denaturuje a pak přři rychle i rychle

neutralizaci neutralizaci precipitujeprecipituje•• v pv přříítomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se tomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitujprecipitujíí i proteiny a RNAi proteiny a RNA

izolace plasmidovizolace plasmidovéé DNADNAKolony s kKolony s křřemiemiččitým nosiitým nosiččem nebo aktivnem nebo aktivníími DEAE skupinamimi DEAE skupinami

DEAE matriceDEAE matricekkřřemiemiččititáá matricematrice+ + chaotropnchaotropníí ssůůll

VýtVýtěžěžky: 1ml LB mky: 1ml LB méédia 10dia 10μμg DNA (g DNA (highhigh--copy copy plasmidplasmid))1ml LB m1ml LB méédia 0.5dia 0.5μμg DNA (g DNA (lowlow--copy copy plasmidplasmid))

pg4

Snímek 18

pg4 DEAE cistci pro transfekcechaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu.galuszka; 20.4.2010

KLONOVACÍ VEKTORYF) bakteriální - BAC umBAC uměělléé bakteribakteriáálnlníí chromosomychromosomy

(bacterial artificial chromosomes)

odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na buňku

VÝHODY oproti YAC:

- stabilita (cirkulární)- snadná manipulace- potlačení rekombinace

Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligacijsou získány pulsní gelovou elektroforesou

VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY

INVITROGEN

k8

Snímek 19

k8 par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek

repE helikasa

musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasamakokos; 22.4.2010

SCREENING SCREENING BACovýchBACových knihoven pomocknihoven pomocíí „„3D3D--poolovpoolováánníí““

•• BakteriBakteriáálnlníí

•• KvasinkovKvasinkovéé

•• HmyzHmyzíí bubuňňkyky

•• SavSavččíí bubuňňky ky

•• TransgennTransgenníí rostlinyrostliny

HeterolognHeterologníí expresnexpresníí systsystéémymy

+---γ-karboxylace

+++-acylace

+++-acetylace

+++-fosforylace

+++-O-glykosylace

komplexníjednoduché, bez sialové

kyseliny

vysoký obsah manosy-N-glykosylace

řádně složenéproteiny

řádně složenéproteiny

v některých případech

nutnédodatečné

složení

obvykle nutnédodatečné složenískládání proteinů

posttranslační modifikace

sekrece do media

sekrece do media

sekrece do media

sekrece do inkluzních tělísekextracelulární exprese

malé nebo střednímalé až velkémalé až velkévelkémnožství exprimovaného

proteinu

vysokávysokánízkánízkácena růstového media

komplexnímedium

komplexnímediumminimálníminimálnípožadavky na růstové

medium

pomalý (24 h)pomalý (18-24h)rapidní (90min)rapidní (30min)buněčný růst

savčí buňkyhmyzí buňkykvasinkyE. colicharakteristika

rekombinatnrekombinatníí genetickgenetickáá informace je informace je vklonovvklonováánana do do vhodnvhodnéého expresnho expresníího ho plasmiduplasmidu, nedoch, nedocháázzíí k integraci k integraci do do genomugenomu

TA klonovTA klonováánníí

TaqTaq polymerasypolymerasy bez 3bez 3´́-- 55´́ samoopravnsamoopravnéé aktivity paktivity přřididáávajvajíí na 3na 3´́konce konce dATPdATP

TA TOPO klonovTA TOPO klonováánníí

linearizovaný vektor ošetřen DNA topoisomerasou Irychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy

pg8

Snímek 25

pg8 The key to TOPO® cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence 5´-(C/T)CCTT-3´ and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3´ thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity of topoisomerase, TOPO® vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3´ phosphategaluszka; 21.4.2010

rekombinarekombinaččnníí klonovklonováánníí• místně specifický rekombinační systém bakteriofága lambda – slouží k integraci do

genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus)

attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci).

rekombinarekombinaččnníí klonovklonováánníí•• rrekombinaceekombinace probprobííhháá v obou smv obou směěrech a jerech a je katakatalýzlýzovováánnaa proteiny proteiny zz λλDNA DNA i i

bakteribakteriáálnlníímimi..

•• selekce antibiotikum a gen selekce antibiotikum a gen ccdBccdB mezi mezi rekombinantnrekombinantníímimi mmíísty, protein sty, protein ccdBccdBinhibuje bakteriinhibuje bakteriáálnlníí DNA DNA gyrasugyrasu a zpa způůsobuje smrt bunsobuje smrt buněěk nesouck nesoucíí prpráázdný vektorzdný vektor

vstupnvstupníí vektorvektor

destinadestinaččnníí vektorvektor

•• InvitrogenInvitrogen doddodáávváá vvššechny typy vektorechny typy vektorůů kompatibilnkompatibilníích pro ch pro rekombinantnrekombinantníí klonovklonováánníí

•• reakce trvreakce trváá 1 hodinu p1 hodinu přři laboratorni laboratorníí teplotteplotěě

•• zachovzachováávváánníí ččtectecíích rch ráámcmcůů (ORF), (ORF), žžáádndnéé slosložžititéé plpláánovnováánníí

KlasickKlasickéé klonovklonováánníí do vstupndo vstupníího vektoru:ho vektoru:

• pENTR vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdB inhibici)

• po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdB – nerostou nezrekombinované plasmidy

• 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony

rekombinace do rekombinace do donorovdonorovééhoho vektoru:vektoru:

•• pENTRpENTR a a pDONRpDONR: pomocn: pomocnéé vektoryvektory

•• pDESTpDEST: c: cíílovlovéé vektory k pouvektory k použžititíí

ppřříímmáá amplifikace s amplifikace s primeryprimery obsahujobsahujííccíí rekombinarekombinaččnníí sekvence:sekvence:

attB2attB2

attB1attB1

LR reakceLR reakce BP reakceBP reakcese se úúččastnastníí integrasaintegrasa a a ekscionasaekscionasa ((ααDNA) se DNA) se úúččastnastníí IHF a IHF a integrasaintegrasaa IHF (a IHF (integrationintegration host host factorfactor) z bakterie) z bakterie

rekombinarekombinaččnníí klonovklonováánníí

T7 promotorT7 promotor přesná a silná exprese heterogenního proteinu

RibosomeRibosome bindingbinding sitesite

TOPO TOPO klonovacklonovacíí mmíísto pro PCR produktsto pro PCR produktXpressXpress™™ epitopepitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocíAnti-Xpress™ protilátky

NN--terminalterminal 6xHis 6xHis tagtagumožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatačníchromatografie popř. detekci pomocíAnti-HisG protilátky

EK EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag

T7 T7 transcriptiontranscription terminationtermination regionregionsilný terminační systém T7 bacteriofága

gen pro rezistenci k gen pro rezistenci k ampicilinuampicilinuumožňuje selekci plasmidu v E. coli

pUCpUC originorigin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli

CC--terminalterminal V5 V5 epitopeepitope tagtagumožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-V5 protilátky

PG2

Snímek 32

PG2 T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotoremgaluszka; 11.3.2007

his tag x-press exprimovaný proteinsignální peptid

izolace

detekce

„„““

forward primer

reverse primerTAG

his tagV5 epitopexprimovaný proteinsignální peptid

izolacedetekce

„„““

ATGforward primer

reverse primerTAG

exprimovanýexprimovaný proteinprotein

usnadnusnadněěnníí izolace izolace rekombinantnrekombinantnííhoho proteinuproteinukoncovkoncovéé znaznaččkyky

nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): HisHis--tagtag pro metal pro metal chelatachelataččnníí chromatografii (Ni)chromatografii (Ni) FLAG FLAG epitopepitopee -- tag DYKDDDDKtag DYKDDDDK

(Sigma; specifick(Sigma; specifickáá protilprotiláátkatka)) CCBPBP -- calmodulincalmodulin binding peptidebinding peptide

(26 (26 AKAK)) CBDCBD -- ccelellluloseulose binding domainbinding domain

PG3

Snímek 34

PG3 FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou

celulosa váže aromatické residua AKgaluszka; 11.3.2007

izolace proteinu z bakteriizolace proteinu z bakteriáálnlníí kultury:kultury:

mar

ker

was

hI

was

hII

IB IB

bakt

.ext

rakt

1M 100m

M

200m

M

0.5m

M

imidazol

• pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem

• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem

• poté je nutno protein renaturovat - SLOSLOŽŽITITÉÉ!!!!!!!!

tagytagy zalozaložženenéé na sacharidna sacharid--vazebných proteinechvazebných proteinech

MBP - maltosa binding protein - amylosaCBP - intein – chitin binding protein - chitin

k1 k2

k3

Snímek 36

k1 inteiny - proteinové intronykokos; 17.4.2010

k2 The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNAwhich plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but, since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would resultin a different base pair at that position, not mispairing at that position.)kokos; 17.4.2010

k3 15 -30uvolneni represe az 1000 kopiikokos; 17.4.2010

Který kmen Který kmen E.E.colicoli zvolit?zvolit?

tontonAA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klonylaclacZZ.M15 .M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementacipotřebné pro blue/white screening na miskách s X-galendendA1A1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNAlaclacIqIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTGmcrmcrAA, , mcrmcrBCBC, a , a mrrmrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNArecrecA1A1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNAFF´́ episomepisom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli

firmaúčelmutacekmen

InvitrogenInvitrogenpropagace propagace plasplasmimidudu, klonov, klonováánníí..araara mutantmutantTop10Top10

NovagenNovagenexprese exprese eukaryotneukaryotnííchch gengenůůGeny pro Geny pro argUargU, , argWargW, , glyTglyT, , IleXIleX, , leuWleuW, , metTmetT, , proLproL, , thrTthrT, , thrUthrU, , andandtyrUtyrU

RosettaRosetta

NovagenNovagenexprese, tvoexprese, tvořříí disulfidickdisulfidickéé mmůůstky stky v cytoplasmv cytoplasměě

trxBtrxB a a gorgor mutantmutantOrigamiOrigami (DE3)(DE3)

LifeLifeTechnologiesTechnologies

propagace propagace plasplasmmiduidu, klonov, klonováánníí..prvnprvníí laboratornlaboratornííkmenkmen

DH5DH5λλ

InvitrogenInvitrogenpropagace GATEWAY vektorpropagace GATEWAY vektorůůss toxickým genem toxickým genem ccdccdBB

gyrgyrA462 A462 alelaalelaDB3.1DB3.1

InvitrogenInvitrogenexprese sexprese s redukovanou degradacredukovanou degradacííRNARNA

RNaseERNaseE mutantmutantBL21 Star BL21 Star (DE3)(DE3)

NovagenNovagenppřřesnesněě řříízenzenáá expreseexpresedeficientndeficientníí na na proteasyproteasy, exprese , exprese lysosymulysosymu

BL21 (DE3) BL21 (DE3) pLysSpLysS

StratageneStratageneobecnobecnáá expreseexpresedeficientndeficientníí na na proteasyproteasy

BL21(DE3)BL21(DE3)

NejpouNejpoužžíívanvaněějjšíší laboratornlaboratorníí kmeny kmeny E.E.colicoli

regulace exprese pod T7 promotoremregulace exprese pod T7 promotorem•• exprese exprese naklonovannaklonovanééhoho genu je kontrolovgenu je kontrolováána velice silným na velice silným

promotorem z bakteriofpromotorem z bakteriofáága T7, který pga T7, který půůvodnvodněě řřííddíí expresi genu 10 expresi genu 10 pro obalový protein pro obalový protein

•• pro expresi je nutno dodat do hostitelským bunpro expresi je nutno dodat do hostitelským buněěk T7 RNA k T7 RNA polymerasupolymerasu a to bua to buďď infekcinfekcíí bakteriofbakteriofáágem, nebo jejgem, nebo jejíí indukovanou indukovanou expresi. expresi.

•• v sytv sytéému mu pCRpCR®®T7 TOPOT7 TOPO®® TA TA ExpressionExpression je exprese T7 RNA je exprese T7 RNA polymerasypolymerasy indukovindukováána na lacZlacZ promotorem pomocpromotorem pomocíí IPTG a tento IPTG a tento systsystéém je ulom je uložžen v en v genomugenomu hostitelských bunhostitelských buněěkk

kmeny kmeny E.E.colicoli vhodnvhodnéé pro expresipro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysSLysS

• před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein

• kmen E.coli BL21(DE3) BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehožinaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG)

• někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt proE.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitěplasmidu. Kmen BL21(DE3)BL21(DE3)LysSLysS navíc obsahuje T7 lysozym(produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol.

• T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice

• T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

JakJakéé geny lze v geny lze v E.E.colicoli exprimovatexprimovat??

•• vvěěttššinu z inu z prokaryotickýchprokaryotických organismorganismůů•• eukaryotneukaryotníí geny jejichgeny jejichžž produkty nepodlprodukty nepodlééhajhajíí posttranslaposttranslaččnníímm

modifikacmodifikacíímm•• vvěěttššina ina cytosolcytosoláárnrnííchch proteinproteinůů (nen(neníí glykosylovanglykosylovanáá))•• geny kgeny kóódovandovanéé chloroplastovouchloroplastovou nebo nebo mitochondrimitochondriáálnlníí DNADNA

(podobný genetický k(podobný genetický kóód, evolud, evoluččnníí ppřřííbuznost)buznost)•• vvššechny geny jejichechny geny jejichžž produkty nepotprodukty nepotřřebujeme v aktivnebujeme v aktivníí formforměě

stabilizace stabilizace exprimovanexprimovanééhoho proteinuproteinu

Sumo Sumo proteasaproteasa

SUMO peptide SUMO peptide –– SmallSmall UbiquitinUbiquitin likelike MOdifierMOdifier

ochrana pochrana přřed proteolýzoued proteolýzouzvyzvyššovováánníí rozpustnosti proteinurozpustnosti proteinu

zvyzvyššuje mnouje množžstvstvíí exprimovanexprimovanééhoho proteinuproteinu

2004

kvasinkové expresní systémy• jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu • rychlá propagace a jednoduchá média • jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními,

„shuttleshuttle“ vektorvektor)• většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační

modifikace – glykosylace, folding)• jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média

hostitelské organismy: Saccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombePichia pastorisHansela polymorphaKluyveromyces lactisYarrowia lipolytica

SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae (od 1979)(od 1979)

SHUTTLE VEKTORSHUTTLE VEKTOR

•• GAL1GAL1 promotorpromotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu

•• T7 promotor/T7 promotor/primingpriming sitesite umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu

•• MultipleMultiple cloningcloning sitesite má 9 jedinečných klonovacích míst

•• CYC1CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mRNAtranskript

•• pMB1 pMB1 originorigin ((pUCpUC--derivedderived)) udržuje „high copy“replikaci v E. coli

•• AmpicillinAmpicillin resistanceresistance genegene selekce v bakterii•• URA3URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním

médiu•• 2 2 μμ originorigin udržování replikace v kvasince•• f1 f1 originorigin produkce single-stranded DNA

k9k10

Snímek 45

k9 epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosakokos; 22.4.2010

k10 CYC1 cytochrom c oxidasekokos; 22.4.2010

SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae

HOSTITELSKHOSTITELSKÉÉ BUBUŇŇKYKY

A) standardní kmen E. coli např. TOP10F TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním.

B) kmen S.cerevisiae INVSc1INVSc1

Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura-INVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.

• u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti glukosy v médiu

• transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média

• alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahujícírafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy

REGULACE EXPRESEREGULACE EXPRESE

SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae

POSTRANSLAPOSTRANSLAČČNNÍÍ ÚÚPRAVY HETEROLOGNPRAVY HETEROLOGNÍÍHO PROTEINUHO PROTEINU

• N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu

• např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou

• tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů

• N-glykosylace většinou probíhá bez problému• problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací,

methylací, miristylací a isoprenylací• problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované

cizí proteiny

• sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální peptid

• některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem• často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od

S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktor (MFa1)

SEKRECE HETEROLOGNSEKRECE HETEROLOGNÍÍHO PROTEINU V KVASINKHO PROTEINU V KVASINKÁÁCHCH

PichiaPichia pastorispastoris

• v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasickáSaccharomyces

• klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces• selekce – zeocin nebo nutriční autotrofie• Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces -

zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu

PichiaPichia pastorispastoris je je methylotrofnmethylotrofníí organismus tzn. jako zdroj uhlorganismus tzn. jako zdroj uhlííkkůů vyuvyužžíívváá metanolmetanol•• nejdnejdřřííve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro ve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasualkoholdehydrogenasu) za ) za

ppřříítomnosttomnostíí kyslkyslííku, proces probku, proces probííhháá v v peroxizomechperoxizomech jelikojelikožž vznikvznikáá toxický toxický peroxid vodperoxid vodííku. Kvasinkovku. Kvasinkováá AOX mAOX máá velice slabou afinitu ke kyslvelice slabou afinitu ke kyslííku a proto je ku a proto je AOX AOX exprimovexprimováánnáá ve velice velkve velice velkéém mnom množžstvstvíí (5% ve(5% vešškerkeréé mRNAmRNA).).

•• toho vyutoho využžíívváá heterolognheterologníí expresnexpresníí systsystéém, kdy je m, kdy je transgentransgen vlovložžen pod AOX en pod AOX promotor.promotor.

g10

Snímek 48

g10 roste do vysoké density až sirupovitágaluszka; 1.3.2011

HIS4 selekce v Pichiiampicilinová selekce v bakteriíAOX1 promotorAOX1 terminátorpBR322 bakteriální počátek replikace

PichiaPichia pastorispastorisf1 produkce ssDNAS – signální sekvence alfa faktoru3´AOX1 – ORF pro AOX gen –

místo pro homolognírekombinaci

PichiaPichia pastorispastoris

• transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace.

• transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku

• integrace na AOX1 lokus – gen narušen

• může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností 1-10% jednoduchéinzerce

rekombinace a integracerekombinace a integrace vv PichiaPichia pastorispastoris

rekombinace a integracerekombinace a integrace vv PichiaPichia pastorispastoris

MNOHONMNOHONÁÁSOBNSOBNÁÁ REKOMBINACE A INTEGRACEREKOMBINACE A INTEGRACE v v PICHIIPICHII

• selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu• je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost)

rrůůznznéé typy selekce transformovantypy selekce transformovanéé PichiaPichia pastorispastoris

• narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%)

• využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1

• nutriční autotrofie – gen pro histidinol fosfatasu (his4) – lepší pro udržováníintegrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace)

ANTIBIOTIKA• zeocin 50 μg - 2000 μg /mL• blasticidin• Kanamycin/G418

kanamycinkanamycinG418G418

PichiaPichia pastorispastoris -- glykosylaceglykosylace

NN--glykanyglykany majmajíí vysoký obsah manosyvysoký obsah manosy

YarrowiaYarrowia lipolyticalipolytica• je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány

a mastné kyseliny

• do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2)

• promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovámokolními vlivy

• hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pXPR2 a vykazuje konstitutivní expresi

• za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipázy

• klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)

• vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomukvasinky) odvozené od základního plasmidu pBR322

•• pINA1267pINA1267 – mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo

•• pINA1294pINA1294 – mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonovásekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky

• hostitelský kmen na knockoutovány geny pro extracelulární proteasy• do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje

růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)

YarrowiaYarrowia lipolyticalipolytica

srovnání s ostatními heterologními systémyexprese kukuexprese kukuřřiiččnnéého enzymu cytokinin ho enzymu cytokinin oxidasyoxidasy//dehydrogenasydehydrogenasy

Escherichia coli (pTYBII cytosolická exprese s protein fusován s inteinem)±± 5 mg/litr m5 mg/litr méédiadia

Saccharomyces cerevicae (pYES2 sekrece do média)±± 2 2 μμg/litr mg/litr méédiadia

Pichia pastoris pPICZ-A (přirozený signální peptid)±±10 10 μμg/litr mg/litr méédiadia

Pichia pastoris pPICZ-α (signální peptid z kvasinky)1 mg/litr m1 mg/litr méédiadia

Yarrowia lipolytica pINA1294 (signální peptid z kvasinky)5mg/litr m5mg/litr méédiadia

přirozený zdroj – kukuřice (purifikace)2 2 μμg/kg mg/kg méédia kukudia kukuřřiiččných zrnných zrn

HeterolognHeterologníí exprese v exprese v YarrowiaYarrowia lipolyticalipolytica

3 dny3 dny

3 týdny3 týdny

1 týden1 týden

3 m3 měěssíícece

2 m2 měěssíícece

3 týdny3 týdny

mutace mmutace míístnstněě ccíílenlenáá((sitesite--directeddirected mutagenesismutagenesis))

• gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru

• navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci

• vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a držíu sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick)

• ošetření restrikční endonukleasou DpnIDpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid)

• transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu

• 100% účinnost není třeba selekce mutovaný/nemutovaný

mutace mmutace míístnstněě ccíílenlenáá((sitesite--directeddirected mutagenesismutagenesis))

M G A L L W Lpůvodní sekvence 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’

forward primer 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’reverse primer 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’

M G A L L S L

PfuTURBOPfuTURBO termostabilntermostabilníí DNA DNA polymerasapolymerasa- nejmenší chybovost - 3´- 5´exonukleasová aktivita

XL10XL10--GoldGold kmen kmen E.E.colicoli- nemá knockoutované metyltransferasy

originorigináálnlníí plasmidplasmid

nastavennastaveníí PCRPCRs s PfuTURBOPfuTURBO TaqTaq

PCR s nPCR s níízkým zkým popoččtem cykltem cyklůů

restrikce s restrikce s DpnIDpnI

transformacetransformacea namnoa namnožženeníí

DpnIDpnI

CCÍÍLENLENÁÁ MUTACEMUTACE

KOZAKOVKOZAKOVÁÁ SEKVENCESEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mRNA) u eukaryot.

--6 6 --5 5 --4 4 --3 3 --2 2 --1 start 1 start codoncodon +4 +5 +6+4 +5 +6KozakKozak seq. U A A seq. U A A AA C A C A A U GA U G GG C UC U

60%60% 100%100% 70%70%

AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX2 A A A C A A A U G G C U AtCKX2 A A A C A A A U G G C U HvCKX2HvCKX2 A G A A G A GG C C A U G C C A U G AA G G G G

aAcaATGGcrostliny

aAaAaAATGTCtSaccharomyces cerevisiae

cAAaATGDrosophila spp.

gccRccATGGobratlovci

syntsyntééza genza genůů na zakna zakáázkuzku

17#12#12#12#turnaround time$0.39/bp$0.39/bp$0.39/bp$159price/bp

2000 – 3000 bp1000 – 1999 bp0 – 999 bpMinimum charge

syntsyntééza DNAza DNAochrana Nochrana N--bbáázzíí

FOSFORAMIDITFOSFORAMIDIT

SyntSyntééza umza uměělléého genuho genu

E. coli Arabidopsis th. H. sapiens

AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9%AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1%

kodkodóónn pro pro argininarginin (6 r(6 růůzných):zných):

CGUCGU AGAAGACGACGA AGGAGGCGGCGGCGCCGC

odchylky v genetickodchylky v genetickéém km kóódudusnisnižžujujíí výtvýtěžěžek ek heterolognheterologníí expreseexprese

výjimky:výjimky:

jinjináá preference:preference:

Optimalizace syntetickOptimalizace syntetickéého genu firmou ho genu firmou MrMr.GENE.GENE1. Úprava kodonů2. Vyvarování se terciárním strukturám mRNA3. Vyhledávání specifických motivů např.

Shine-Dalgarnova sekvence 5'-AGGAGGU-3' polyadenylační signály

PyrosekvencovPyrosekvencováánníí

DNA DNA polymerasapolymerasa

dNTPdNTP mixmix

ATP ATP sulfurylasasulfurylasa

AdenosineAdenosine 5 5 fosfosulffosfosulfáátt

LuciferasaLuciferasa

LuciferinLuciferin

ApyrasaApyrasa

NOVNOVÉÉ METODY SEKVENCOVMETODY SEKVENCOVÁÁNNÍÍ::

1.1. Izolace Izolace genomovgenomovéé DNA a restrikce na vhodnDNA a restrikce na vhodnéé fragmenty (300fragmenty (300--800 800 bpbp))

2.2. ZatupenZatupeníí konckoncůů a nava naváázzáánníí adaptorovadaptorovéé sekvence s sekvence s biotinovoubiotinovouznaznaččkou (modrkou (modráá) a druh) a druhéé bez (bez (ččervenervenáá))

3.3. NavNaváázzáánníí na kulina kuliččky se ky se streptavidinemstreptavidinem

4.4. NanesenNaneseníí na na mikroreaktorovoumikroreaktorovou destidestiččku ku

5.5. ProvedenProvedeníí emulsnemulsníího PCR (ho PCR (ččervený a modrý ervený a modrý primerprimer))

6.6. ParalelnParalelníí pyrosekvencovpyrosekvencováánníí ve vve vššech jamkech jamkááchch

RocheRoche 454/GS454/GS FLX FLX SequencingSequencing TechnologyTechnology

Illumina/Solexa metoda cyklické reverzibilní terminace1. 2. 3.

4. 5. 6.

„„BridgeBridge““ PCRPCR

cyklickcyklickáá reverzibilnreverzibilníí terminaceterminace

ChemickChemickéé ššttěěpenpeníí ve vodnve vodnéém m prostprostřřededíí za katalýzy paladiemza katalýzy paladiemDEALLYLACEDEALLYLACE

IlluminaIllumina//SolexaSolexa -- vyhodnocenvyhodnoceníí

SROVNSROVNÁÁNNÍÍ

200.000540.000359 dní35Cyklickáreverzibilníterminace

Fragmentace + „bridge“PCR

ILLUMINA SOLEXA

1.000.000500.0000.458 hod.

330pyrosekvencováníFragmentace + emulsníPCR

ROCHE 454

Cena přečtenílidského genomu

Cena přístroje(USD)

PřečtenéGb

na jeden běh

Doba běhu

Délka jednoho

čtení(bp)

chemismusPříprava templátu

platforma

ROCHE 454 + dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy)+ rychlé-- chyby v homopolymerních repeticích (AAAAAAAAA, GGGGGGGGGGG)

ILLUMINA/ + nejpoužívanějšíSOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu

-- nízká multiplexita

ODSEKVENOVANODSEKVENOVANÉÉ GENOMYGENOMY

nejvnejvěěttšíší význam DIAGNOSTIKAvýznam DIAGNOSTIKA

•• zlevnit zlevnit ppřřesekvencovesekvencováánníí lidsklidskéého ho genomugenomu na 1.000 USD (do roku na 1.000 USD (do roku 2015)2015)(nov(novéé levnlevněějjšíší ppřříístupy: SOLID stupy: SOLID AppliedApplied BiosystemsBiosystems, HELIOS), HELIOS)

•• CANCER GENOME ATLASCANCER GENOME ATLAS

•• TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNATRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA--seqseq) ) –– výhoda oproti DNA výhoda oproti DNA ččipipůům je m je žže 100% postihuje alternativne 100% postihuje alternativníí sestsestřřih a ih a alelickoualelickou variabilituvariabilitu

•• SINGLE MOLECULE SEQUENCING (SINGLE MOLECULE SEQUENCING (HeliosHelios) ) –– preinplantapreinplantaččnníídiagnostikadiagnostika

•• SOLID PHASE CAPTURE SOLID PHASE CAPTURE –– NimbleGeneNimbleGene™™ ččip vyrobený pro vychytip vyrobený pro vychytáánnííkodujkodujííccííchch sekvencsekvencíí a regulaa regulaččnníích oblastch oblastíí z z fragmentovanfragmentovanéé genomickgenomickééDNA pDNA přřed vlastned vlastníím m vysokovysokoúúččinnýminným sekvencovsekvencováánníímm