Hmotnostní spektrometrie 08 - pmfhk.cz · Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je...

transcript

Základy hmotnostníspektrometrie

Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové

HistorieKoichi TanakaKoichi Tanaka vyvinul MALDI technikuTanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., YoshidaT.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151

JB JB FennFenn vyvinul ionizaci elektrosprejemFenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64

Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie

Tanaka K.

Fenn J.B.

PrincipHmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, kteráurčuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty.

Přístroj se nazývá hmotnostníspektrometr.

PrincipMS vypovídá o primární struktuře analyzované

látky

Neposkytuje informace o sekundární či terciálnístruktuře proteinu

Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace

Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace

Princip

Umožňuje analýzu komplexních směsí

Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality

Identifikaci proteinů

Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby

Možnost analýzy nekovalentních komplexů

Vlastnosti hmotnostní spektrometrie

Citlivá

Specifická

Rychlá

Jednoduchá interpretace dat

Popis přístroje

1. Iontový zdroj

2. Hmotnostní analyzátor

3. Detektor

4. Řídící počítač

Experimentální uspořádání

Vacuum Vacuum SystemSystem

Sample Sample InletInlet DetectorDetector Data Data

SystemSystemMass Mass

AnalyserAnalyserIonisation Ionisation MethodMethod

Atmosphere

SouSouččáásti MS syststi MS systéémumu

MALDI-TOF hmotnostní spektrometry

Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)

4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)

MALDI-TOF Voyager

(Applied Biosystems)

PrincipIonizace1.Měkké techniky ionizaceEnergetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.

2. Tvrdé techniky ionizaceDodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.

Typy ionizace

- nárazem elektronů (EI)- působením elektrostatického pole (FI, FD)- chemickou ionizací (CI)- nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB)- ionizací fotony- ionizací 252Cf- elektrosprejem, termosprejem (ESI)- ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)

Hmotnostní analyzátoryUmožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.

Typy analyzátorůPrůletový analyzátor (TOF)Kvadrupólový analyzátor (jednoduché, trojnásobné)

Iontová pastHybridní (Q-TOF, Q-trap, trap-TOF, trap-ICR, …)

Tandemové (TOF-TOF, QQQ)FT- ICR MS, ORBITRAP

DetektorPoskytuje analogový signál úměrný počtu

dopadajících iontů.

Dělí se do dvou skupin1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud

vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů(měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)

2. Násobičové detektory využívají efekt násobeníelektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)

Ionizace

MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Metoda využívá ionizace laserempulsní technika -------- UV (N2)

IR (CO2) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns)

dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých)

jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)

MALDI-TOF MS - ionizace

1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce

2. Laserový výstřel ionizujemolekuly matrice.

3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonuz matrice:

MH+ + A M + AH+

MALDI destička

+20 kV Ground Variable Grid Grid

MALDI ionizace

Měkká ionizaceMalá nebo žádná fragmentaceJednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]-

Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery …Analýza komplexních sloučeninRychlá příprava vzorku & analýzaTolerantní k detergentům a solímJednoduchá interpretace datSpojený s TOF analyzátorem

ESI - ionizace elektrosprejemMěkká ionizaceTechnika pro disperzi kapalin a aerosolůOn-line spojení HPLC a hmotnostního spektrometruVznik vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+, [M+zH]z-

Pro jeden analyt se ve spektru objevují série píků, které odpovídají iontům téže látky, o stejné molekulovéhmotnosti M, s rozdílným počtem nábojů z.Výskyt iontů - aduktů analytu se sodnými ionty [M+zNa]z+ a draselnými ionty [M+zK]z+ (pokud je vzorek zasolený)Není tolerantní k detergentům a solím (před analýzou je nutné přečištění a odsolení vzorku)Spojení s různými typy analyzátorů

ESI MS intaktního proteinu

VýhodyDíky přítomnosti analytu ve více iontech

s různým nábojem lze snadno určit náboj iontů

NevýhodySnížení citlivosti díky rozdělení signálu mezi

více píků a menší přehlednost spektersložitějších směsí.

ESI - ionizace elektrosprejem

Při ionizaci elektrosprejem probíhajíčtyři základní procesy

1) vznik nabitých kapek na konci sprejovacíkapiláry

2) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaný rozpad (Coulombické štěpení)

3) uvolnění iontů do plynné fáze z malých, vysoce nabitých kapek

4) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi

ESI - ionizace elektrosprejem

Sprejovací kapilára

Zdroj vysokého napětí

Elektrony

Oxidace

+ + ++ + + + +

+ + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + +

++ + + + + + + + + + + +

+ + ++ + + + +

+ + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + +

Elektrony Redukce

Taylorův kužel

Coulombické štěpení

Zmenšování kapek v důsledku odpařování rozpouštědel

Foto ESI

Kapilára

Vstup do MS

Hmotnostní analyzátory

Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu majírychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z

Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t

Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu

t = k ( m1/z - m2/z)

TOF analyzátor

Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovéma PSD módu

Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m)Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letuje prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m)Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)

Letová trubice

Detektor

Zdroj iontů

15-25 kV

Průletový analyzátor (TOF)

Letová trubice

Detektor

Zdrojiontů

Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.

15-25 kV

Průletový analyzátor (TOF)

MALDI MS spektrum proteinů

Lineární mód

Reflektronový mód

Charakteristika – reflektronový mód

Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm)

Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol)

Teoreticky neomezené rozmezí m/z

Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu

Kvadrupólový analyzátor (Q)

Dynamický analyzátor, dělení iontů je dosaženo jejich průchodem mezi čtyřmi kovovými tyčemi

Tyče jsou paralelně rozmístěny na kružnici, na protilehlé tyče je vloženo vždy stejné napětí, které je kombinací stejnosměrné (U) a střídavé (V) složky

Napětí vložená na dva páry tyčí jsou zvolena v daném časovém okamžiku tak, aby mezi tyčemi proletěly pouze ionty s hodnotou m/z v určitém omezeném intervalu, případně s jedinou hodnotou m/z.

Zbylé ionty jsou vyneseny ven z elektrického pole a zachyceny na tyčích kvadrupólu.

Příčný průřez kvadrupólovým analyzátorem

Schematické znázorněníkvadrupólového analyzátoru s naznačením dráhy iontů.

Současnou, plynulou změnou hodnot U a V jsou postupně analyzovány všechny ionty ve zvoleném rozsahu m/z Kvadrupól funguje jako laditelný filtr sloužící ke skenování spektra ve zvoleném rozsahu Je-li na tyče přivedena pouze střídavá složka napětí, kvadrupólový analyzátor propouštívšechny ionty nezávisle na jejich efektivních hmotnostech. V tomto režimu se analyzátor používá jako iontový vodič.

Výhodyrelativně rychlý záznam celého spektralineární stupnice m/znení přítomen magnet

Nevýhodynízké rozlišenínízký rozsah m/z (2 – 4 kDa)diskriminace iontů s vyšším m/z

Použitípři analýzách anorganických a lehkých či středně těžkých organických sloučeninanalýza peptidů a proteinů je výhodná především ve spojení s ESI, kde je hodnota m/z generovaných iontů snížena díky vyššímu počtu nábojůdosahují také výborných výsledků při měření kvantity analytůjsou vhodné pro spojení GC/MS a HPLC/MS umožňují měření v tandemovém uspořádání hmotnostního spektrometru

lze použít stejné hmotnostní analyzátory, např. QqQ – trojitýkvadrupólnebo kombinace hmotnostních analyzátorů, např. Q-TOF –kvadrupól a průletový analyzátor

Využití trojitého kvadrupólupro strukturní analýzu peptidů a jiných lehkých a středně těžkých biomolekul pracuje tak, že v prvním kvadrupólovém filtru je izolován prekurzor (mateřský iont) druhý kvadrupól pracuje v režimu iontového vodiče a slouží jako kolizní cela v důsledku srážek s molekulami kolizního plynu (např. helium, argon) dochází ke kolizně indukované disociaci (CID) za vzniku dceřinných iontů, které jsou pak analyzovány posledním, třetím, kvadrupólem

Iontová past (IT)je v podstatě trojrozměrný kvadrupól

skládá se z prstencové střední elektrody s hyperbolickým průřezem a dvou kruhových elektrod rovněž s hyperbolickým průřezem, které prstenec volně uzavírají

na prstenec je vloženo kombinované stejnosměrné (U) a radiofrekvenční (V) napětí

dochází ke stabilním oscilacím iontů v pasti

všechny ionty nad určitou hodnotu m/z odpovídajícíamplitudě vysokofrekvenčního napětí mají trajektorie, kteréje udržují uvnitř pasti

Iontová past (IT)do iontové pasti je zaváděno hélium („tlumící“ plyn) He tlumí oscilace iontů a udržuje je ve středu pasti při zvyšování vysokofrekvenční amplitudy se ionty s rostoucíhodnotou m/z postupně stávají nestabilními a jsou vypuzovány z pasti a detekovány.

Kvadrupólová iontová past

Výhodyumožňuje strukturní analýzy bez nutnosti jakéhokoli rozšíření

přístroje vybraný iont lze v pasti uchovat, následně ho podrobit fragmentaci do druhého (MSMS) nebo více (MSn) stupňůteoreticky mohou komerční iontové pasti mít MS10, prakticky jsou detekovány ionty asi do MS4 a výjimečně do MS7

poměrně vysoká rychlost skenování (~103 Da/s) umožňuje dosažení izotopového rozlišení do m/z ~ 2 – 4 kDavyššího rozlišení lze dosáhnout za cenu snížení rychlosti skenováníspektra nebo rozsahu m/z

Iontová past (IT)

Výhodyměřící rozsah iontové pasti byl původně 650 Da, ale

dalšími úpravami bylo dosaženo až 70 000 Da a rozlišovací schopnosti FWHM až 40 000standardně se vyrábějí iontové pasti s rozsahem 2 000 Dave spojení s ESI (poskytující vícenásobně nabité ionty) je iontová past vynikajícím nástrojem proteomiky

Iontová past (IT)

Lineární iontová pastv současné době dochází k přechodu od klasické kvadrupólové

(trojrozměrné) pasti k pastím lineárním (linear trap, LT) LT jsou tvořeny kvadrupólem, který je ze všech stran uzavřenvíčkyionty jsou nejprve akumulovány v potenciální jámě mezi víčky iontového vodiče pracujícího v kvadrupólovém režimu a pozdějivypouštěny ve směru osy nebo přes otvory v tyčích kvadrupólunejvýznamnější výhodou lineární pasti, ve srovnání s trojrozměrnou, je výrazně účinnější akumulace iontů, vyššíiontová kapacita, tím i vyšší dynamický rozsah, a víceoperačních režimůvhodné pro měření posttranslačních modifikací proteinů(fosforylace)

Iontová past (IT)

Tandemový hmotnostní spektrometrtandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS),

případně hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MSn), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky, např. určení aminokyselinové sekvence nebo lokalizaceposttranslačních modifikací

obsahují dva hmotností analyzátory sériově spojenékolizní celou

v prvním analyzátoru dojde k rozlišení prekurzorových (mateřských) iontů a k výběru jednoho z nich

tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizní cele a vzniklé produktové (dceřinné) ionty jsou rozlišeny v druhém analyzátoru

Příprava vzorků pro MSPředseparační techniky

rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….)

Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí

Separovaný

Protein

Proteolytické

peptidy

MALDI-TOFMS spektrum

proteolyt. peptidů

Proteasa

Postup přípravy vzorků

2D-PAGE a MALDI-TOF

Štěpení proteinůEnzymové

proteolýza, nejpoužívanější enzym je trypsin

Chemickénejsou běžné, používají se jako doplňkovénapř. BrCN - bromkyan se používá pro štěpení ve vodě nerozpustných nebo membránových proteinů

Molekulová hmotnost vzniklých peptidů se pak měřína hmotnostním spektrometru

Proteolytické enzymy - proteázyKatalyzují exotermní hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a

peptidech

Výhody jejich použitívysoká specifitaminimalizované vedlejší reakcedobrá účinnost štěpení

Podmínky použití, důležité je dodržení: pH reakčního pufrupoměru enzym/substrátteptotydoby inkubacepokud je to nutné provádí se:

redukce disulfidových vazeb (např. DTT)alkylace reaktivních cysteinů (např. jodacetamid)

Klasifikaceproteinázy - působí na proteiny (nevyžadují přítomnost volných konců susbstrátů)peptidázy - působí na malé oligopeptidy (vyžadují alespoň jeden konec substrátu volnýa to v blízkosti místa štěpení)

endopeptidázy - katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitř řetězce a tvoří peptidy o různé délce exopeptidázy - katalyzují hydrolytické odštěpeníkoncové aminokyseliny

N-koncové (aminopeptidázy)C-koncové (karboxypeptidázy)

Proteolytické enzymy - proteázy

PeptidázyEndopeptidázy se získávají:

z orgánů trávicího traktu obratlovců (pankreas - chymotrypsin, trypsin, žaludek - pepsin)

krve (thrombin)

sleziny (kathepsiny)

rostlinného materiálu (papain, ficain, bromelain)

mikroorganismů (Glu-C, pronase, thermolysin)

Exopeptidázy se získávají:pankreaturostlinmikroorganismů

Tabulka enzymů a chemických látek používaných pro štěpení proteinů

Trypsinv proteomice nejpoužívanější serinová endopeptidázaštěpí v mírně alkalickém prostředí (pH 7.8)štěpí specificky peptidové vazby na C-konci kladněnabitých zbytků argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolindoba štěpení 4 - 24 hodinteplota při štěpení 37 °C

methylovaný trypsin štěpí 30 minut při 58 °C

poskytuje definované peptidové fragmentydobře se ionizujívýhodná velikost pro MS analýzu

jeden z možných typů trypsinu je hovězí trypsin má Mw 24 kDa, pH 9.4

trypsin je výhodný pro štěpení v polyakrylamidovém gelu, je schopný difundovat póry gelu k proteinu

větší molekuly peptidáz nejsou schopny do gelu difundovat ze stérických důvodů

vzhledem k vysoké specifitě štěpení jsou tvořeny databáze obsahující proteiny s teoretickými trypsinovými peptidy včetně jejich m/z hmotností

využití k identifikaci proteinů metodou peptide mass fingerprinting (peptidovémapování)

Nevýhodymalá termostabilita (při vyšší teplotě klesá aktivita)

autolýza (autolytické peptidy trypsinu ruší MS analýzu)

štěpí pouze v optimálním pH

Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabraňují jeho autolýze a termolabilitě.

Trypsin

Chymotrypsinserinová endopeptidázaněkdy nahrazuje nebo doplňuje trypsinvhodný pro štěpení proteinů v roztoku i geluspecifita štěpení je na rozdíl od trypsinu nízká

peptidovou vazbu štěpí na C-konci v místě: F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan), L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin) pokud nenásleduje prolin

Glu-Cserinová endopeptidázaprodukt bakterie Staphylococcus aureusštěpí peptidové vazby na C-konci kyseliny

glutamové případně kyseliny asparagové (3000x pomaleji)

Lys-Cserinová endopeptidáza produkt bakterie Lysobacter enzymogenesštěpí peptidové vazby na C-konci lysinu

Použití enzymů v proteomicestudium glykosylace (Glu-C, Asp-N)lokalizace fosforylačních míst (elastáza)analýza peptidů s disulfidovými vazbami (Glu-C, Lys-C, thermolysin)peptidové mapování (Asp-N, Arg-C, Glu-C, Lys-C -striktní specifita)proteinové modifikace včetně posttranslačních (pronáza), poskytuje krátké peptidy - nevhodná pro peptidovémapovánístrukturní změny v proteinech na základě izotopovévýměny vodík/deuterium, analýza O-glykosylace proteinu (pepsin, peptidázy)

Enzymatické štěpení vzorku

Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidovévazby u kladně nabitých zbytků.

Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.

- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -

TrypsinTrypsin

Matrice

Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum

Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpacírychlostí vakuového systému)

Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly

U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, kterézajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci

Vzorce a názvy matric

Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce

Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensisBrucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis

MALDI-TOF MS Výběr matrice

Název matrice Analyzovaná látka

α-kyano-4-hydroxyskořicová kys. (CHC) Peptidy, proteiny < 10 kDa, karbohydráty, lipidy

3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kys. (SA) Proteiny, peptidy > 10 kDa, glykoproteiny

2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) Neutrální karbohydráty, syntetické polymery, peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy, glykoproteiny

3-hydroxypikolinová kyselina (3-HPA) Oligonukleotidy, glykoproteiny

3,4-dihydroxyskořicová kyselina (CA) Proteiny, oligonukleotidy

Interpretace spekter

Metoda peptidového mapování (PMF)

700 1260 1820 2380 2940 3500Mass (m/z)

Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]

1112.57

1508.83

1337.66

1806.97

721.401032.59

1718.911278.702299.222007.11

874.52 1204.641381.70 1851.911530.83 2310.251095.54

Hmotnostní spektrometrie 08 - pmfhk.cz · Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je...

Documents