Moderní způsoby kultivace

Ing. Aleš Prell, CSc.Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i.

Biotechnologická hala

moderní způsoby kultivace v bioreaktorech

kultivace v bioreaktorechsubmerzní kultivace v kapalině (SLC)

míchané bioreaktorymíchané bioreaktory

jednorázové kultivační vakyjednorázové kultivační vaky

membránové bioreaktorymembránové bioreaktory

kultivace na pevných půdách (SSC)proces – dynamika, řízení, optimalizace

základní typy kultivačních procesůzákladní typy kultivačních procesů

optimalizace bioprocesuoptimalizace bioprocesu

kultivace v bioreaktorech

BIOREAKTOR

zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze

substrátu na jeden či více produktů

ideální bioreaktor

rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,

nízké provozní náklady

transport živin a metabolitů

1.mezifázové rozhraní plyn-kapalina

2.transport v kapalině3.kapalina-pevná fáze4.transport

aglomerátem5.transport přes

biologické membrány

Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance

rozdělení bioreaktorů / kultivací

podle skupenské fáze submerzní (suspenzní) – částice se volně vznášejí v

kapalné fázi míchané reaktorymíchané reaktory air-liftair-lift bublané kolonybublané kolony

imobilizované – buňky jsou ukotveny v pevné struktuře membránové – oddělení fází či komponent systémumembránové – oddělení fází či komponent systému pevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosičepevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosiče fluidní lože – vznáší se v proudufluidní lože – vznáší se v proudu

na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a buňky tvoří povlak čí nárůst

submerzní kultivace(Solid-Liquid-Cultivation – SLC)

vs.kultivace s imobilizací

vs.kultivace na pevném substrátu(Solid-Solid-Cultivation – SSC)

submerzní kultivace kultivace s imobilizací

výskyt gradientu živin živiny protékají

nízká vrstva substrátu vysoká vrstva média

transportní procesy transportní procesy / limitace

kyslík rozpuštěn v kapalině kyslík rozpuštěn v kapalině

růst MO na povrchu substrátu MO rostou v médiu růst MO na/v matriciprodukt koncentrovaný nízká koncentrace produktu vyšší koncentrace produktu

obtížný scale-up definovaný scale-up

kultivace na pevném substrátu

živiny jsou rovnoměrně rozptýlené

průtočný systém / vznos / míchání

limitace transportu tepla a hmoty

třífázový systém pevná – kapalina - plyn

dvoufázový systém kapalina - plyn

třífázový systém pevná – kapalina - plyn

kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze

teplo se odvádí pomocí plynné fáze

teplo se odvádí vnějším chlazením

teplo se odvádí vnějším chlazením / problematický

přechod z pevné fáze

obtížné sledování a řízení procesu

sledování a řízení procesu je běžné

sledování a řízení procesu je možné, ale obtížnější v pevné

fázi

obtížněji definovatelný scale-up

rozdělení bioreaktorů podle operačního módu

vsádkový (batch)vsádkový (batch) přítokovaný (fed-batch)přítokovaný (fed-batch) kontinuálníkontinuální perfuzní perfuzní

měřítka laboratorní (do 30 L)laboratorní (do 30 L) čtvrtprovozní (do 100 L)čtvrtprovozní (do 100 L) poloprovozní (do 5000 L)poloprovozní (do 5000 L) provozníprovozní

výběr bioreaktoru přestup kyslíku přestup tepla přestup hmoty požadavky na míchání nároky na energie citlivost kultury ke střižným

silám reologie kapaliny - viskozita

média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné síly)

minimalizace odparu kapaliny

tlaková odolnost

sterilita operace

čištění bioreaktoru

bezpečnost

účelová flexibilita a kompatibilita

cena zařízení a jeho provozu

přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up

živné půdy (media)

kultivační médium

je nezbytné pro růst a metabolismus mikroorganismů

tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování mikroorganismu (růst, metabolismus, fyziologie)

ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby produktu, složení produktu

musí obsahovat dostatečné množství živin živiny – růst buněk, získání energie pro syntézu

produktu a zachování buněčné integrity

základní typy médií

KOMPLEXNÍ organický zdroj živin

hydrolyzáty proteinů hydrolyzáty proteinů (peptony)(peptony)

extrakty masa, kvasnicextrakty masa, kvasnic

DEFINOVANÁznámo složení

minerální soliminerální soličisté esenciální složkyčisté esenciální složkyzdroj uhlíku a energiezdroj uhlíku a energie

návrh složení média

je nutno znát biochemii kultivace – vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace

účel kultivace – složení média (DSP) cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu),

stálost jeho složení formulace média - kompromis mezi nutričními

požadavky, cenou a dostupností složek média chemické složení média – určí se ze složení

biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů

funkce živin

zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy

zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů)

ovlivňují složení mikrobiální buňky elementární složení všech mikrobiálních buněk je

relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků MO na živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P)

fyziologické funkce média

uhlík, vodík, kyslík, dusík, fosfor, síra, kationty a stopové prvky, voda...

část oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané energie na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace)

poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje

maximální výtěžnost substrátu - čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v YX / S

hlavní elementární složky

VODÍK – hlavní zdroj je katabolický NAPDPH+

KYSLÍK – plynný, mění typy metabolismu DUSÍK – amonné soli, dusičnany, aminokyseliny,

močovina, pepton, hydrolyzát kaseinu, kvasničný extrakt

FOSFOR – anorganické fosfáty IONTY KOVŮ – Fe, Mg, K, Ca...

definované roztoky nebo komplexní org. zdrojedefinované roztoky nebo komplexní org. zdroje

další nezbytné složky

stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si

buňka neumí sama syntetizovat vitamíny – často kofaktory enzymůvitamíny – často kofaktory enzymů L-aminokyseliny – především glutamováL-aminokyseliny – především glutamová puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselinpuriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin

VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná... odpěňovadla – povrchové napětí, oleje, polyglykoly

polymery (PPG)

pH a iontová rovnováha stabilizace pH – užití pufrů v médiích

organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES …organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES … regulace pH

NaOH, NHNaOH, NH33, H, H33POPO44, H, H22SOSO44

iontová síla, redox – ovlivňují růst, produkci a produkty

příprava inokula, sterilizace, inokulace

příprava inokula

uchování kmenů lyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazenílyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazení přeočkovávání na pevných půdáchpřeočkovávání na pevných půdách

revitalizace v kapalném médiu – třepání inokulační tanky

poměr 1:10 až 1:20poměr 1:10 až 1:20 důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média

a převod do definovanýcha převod do definovaných co nejméně inokulačních stupňůco nejméně inokulačních stupňů

aseptický proces, sterilizace

požadavky na aseptický proces sterilita – nepřítomnost živých organismů odstranění veškerých živých MO ze zařízení zabránění vstupu kontaminace po sterilaci zachování sterility – ekonomika procesu, bezpečnostní

hledisko sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a

portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.)

úrovně požadavků na čistotu

pro dekontaminace životního prostředí pro agrotechnologie pro krmivářství potravinářská kvalita pro biochemii, biotransformace farmaceutická a medicínská kvalita

kontaminace může způsobit

likvidaci producenta (bakteriofágy) produkci toxinů (bezpečnost produktu,

inhibice produkčního kmene) produkci enzymů (degradace produktu) snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu) produkci metabolitů (polysacharidy) spotřebu části substrátu (výtěžnost)

sterilizace média a bioreaktoru

ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa horkým vzduchem 150-180ºC chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol,

formaldehyd.... UV, X-rays – většinou povrchy, prostory ultrafiltrace – plyny, roztoky velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu

hodnocení sterility

D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10 závisí na odolnosti mikroorganismu

NN – počet živých zárodků, – počet živých zárodků, tt – čas sterilizace, – čas sterilizace, k - k - konstanta MO pro mokré/suché teplokonstanta MO pro mokré/suché teplo

Bacillus subtilis D121 = 0.4 - 0.7 min (mokré teplo) pro N0/Nt = 1012 je t = 12.D

−dNdt

=kN lnN t

N 0=−kt

sterilizace parou in situ

naplnění médiem, zapnutí přívodu páry, míchání pomalé, horní otvor otevřen, ostatní uzavřeny, zahřátí média, vypuzení vzduchu, dosažení 100ºC

uzavření horního otvoru, jediná cesta – kondenzátor, sterilace filtrů (in/out), sterilace potrubí a výpustního ventilu, dosažení 121ºC, sterilace 20 minut

ochlazení na kultivační teplotu nutnost sterilního vzorkování a filtrace vzduchu

sterilizace vzduchu a odplynů

možnost sterilizace velkých objemových průtoků: vzdušnění obvykle 1 VVMvzdušnění obvykle 1 VVM 10 m10 m33 reaktor – za 48 h 29 000 m reaktor – za 48 h 29 000 m33 vzduchu vzduchu koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchukoncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu ultrafiltraceultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke – splňuje všechny požadavky, používá se ke

sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry vsterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 μmpatroně, póry 0.1 μm

inokulace

aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně

sterilizovatelné potrubní spojení čerpání tlakem sterilního vzduchučerpání tlakem sterilního vzduchu

sterilní inokulační jehly septa v aperturách ve víku bioreaktoru čerpání peristaltickými čerpadly

inokulum nepřichází do styku s čerpadleminokulum nepřichází do styku s čerpadlem

přestup tepla, aeracea přestup kyslíku

přestup tepla vznik tepla - míchání (příkon míchadla 15 kJ/m3.s,

aerace, činnost mikroorganismů aerobní procesy – množství uvolněného tepla

proporcionální spotřebovanému kyslíku, Q(kJ/mQ(kJ/m33.s) = 0,12 . OCR(mmol O.s) = 0,12 . OCR(mmol O22/m/m33.s) .s) Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost

spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného Ospotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného O22

submerzní kultury 3-15 kJ/m3.s odvod tepla – chlazení, externí plášť, interní vestavby scale-up – přestup kyslíku a tepla limitující (omezená

chladicí plocha – vyšší objem, menší chladicí plocha)

aerace (provzdušňování) aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za

současné účinné dispergace – velké mezifázové rozhraní

stupeň dispergace DDbb – průměr bublin (2-3 mm), – průměr bublin (2-3 mm), ε – plynová zádržε – plynová zádrž

vvm – volume/volume/minute VVGG – průtok vzduchu – průtok vzduchu VVrr – objem reaktoru – objem reaktoru

a=6⋅ϵDb

vvm=V G

V r

přestup kyslíku

rychlost přestupu kyslíku (oxygen transfer rate)

rychlost spotřeby kyslíku (oxygen uptake rate)

OTR=K La⋅(C*−C )

OUR=X⋅qO2=μXY X /O

vlivy na přestup kyslíku C*: rovnovážná koncentrace kyslíku

teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita)viskozita)

C: aktuální koncentrace kyslíku geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a

velikost míchadla, příkon, zarážkyvelikost míchadla, příkon, zarážky aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu,

způsob operacezpůsob operace vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO, vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO,

odpěňovací činidla) ovlivňují Codpěňovací činidla) ovlivňují C velké fermentory (>5000 L) OTR < 300 mmol/L.h

jak zvýšit přestup kyslíkuza daných podmínek

zvýšení průtoku vzduchu zvýšení otáček míchadla zvýšení tlaku v bioreaktoru zvýšení obsahu kyslíku ve vzduchu závislosti jsou nelineární

submerzní kultivace vkapalném médiu

SLC

submerzní bioreaktory kyslík - aerobní, anaerobní konstrukce

míchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulickémíchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulické fluidní vrstvafluidní vrstva náplňovénáplňové membránovémembránové fotobioreaktoryfotobioreaktory ......................

hlavní funkce bioreaktoru

zajistit ideální prostředí pro růst a tvorbu produktu médium médium →→ živiny živiny →→ homogenita homogenita →→ míchánímíchání médium médium →→ živiny živiny → → přítokovánípřítokování aerobní procesy aerobní procesy →→ přestup kyslíku přestup kyslíku → → míchání, aeracemíchání, aerace tepelná bilance tepelná bilance → → míchání, temperacemíchání, temperace regulace pHregulace pH

míchané bioreaktory

míchání bioreaktoru s mechanickým mícháním s pneumatickým promícháváním

probublávané reaktoryprobublávané reaktory prostéprosté s vnitřními vestavbami (air-lift)s vnitřními vestavbami (air-lift)

s cirkulační trubkous cirkulační trubkou s vnější cirkulacís vnější cirkulací

fluidní lože

pneumaticky míchané reaktory

vstup energie pouze plynnou fází (aeračním plynem) vzduch vstupuje zespoda tryskami aerobní kultivace vhodné pro MO citlivé ke střižným silám výhody: jednoduché zařízení, neporuchové, investičně

nenáročné, rychlost přenosu kyslíku vysoká nevýhody: ne pro média s vyšší viskozitou, velká spotřeba

vzduchu, pěnění média

probublávané reaktory

cylindrická nádoba, poměr 1:2 (kolona) rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění

vzduchu a reologií kapaliny maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 ms-1

nevýhoda – obvykle malý přestup O2

air-lift reaktory

vestavby – zarážka, cirkulační trubka funkce vestaveb:

dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíkumezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíku

organizování toku fázíorganizování toku fází zvýšení doby prodlení plynuzvýšení doby prodlení plynu zvýšení mikroturbulencezvýšení mikroturbulence

air-lift reaktory - cirkulace

systémy s vnitřní cirkulací difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce, difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce,

část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí kapalina zpět dolůkapalina zpět dolů

cirkulační trubkacirkulační trubka systémy s vnější cirkulací

2 kolony spojené ve spodní a horní části2 kolony spojené ve spodní a horní části aerovaná kolona – větší průměraerovaná kolona – větší průměr úplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoruúplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoru indukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoruindukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoru

bublaná kolona aair-lift s centrální trubkou

reaktory s fluidním ložem I vhodné pro imobilizované MO nebo enzymy, flokulované MO kapalina proudí vzhůru – suspendace pevné fáze podobné probublávaným reaktorům, horní část rozšířená –

redukce povrchové rychlosti – pevné částice se vracejí do střední části, kapalina odchází lze probublávat vzduchem/jiným plynem – zvýšení turbulence

a míchání příliš lehké částice – použití nosiče, zvýšení sedimentační

schopnosti náplňové bioreaktory pevná matrice (porézní x neporézní, polymer x rigidní

materiál), biokatalyzátor

reaktory s fluidním ložem II

přívod živin, kontinuální, proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny

výška náplně – hustota a kompresibilita nosiče, proudění kapalin (tlak na nosič), prostor pro proudění plynů

nehomogenní prostředí – změna koncentrace živin s výškou náplně, gradient pH, špatné promíchávání

využití – reakce, kde se vyskytuje inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně)

další typy bioreaktorů

fotobioreaktory fotosyntetizující kultury – mikrořasy, cyanobakteriefotosyntetizující kultury – mikrořasy, cyanobakterie

bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi bioreaktory pro kultivaci živočišných buněk

mechanicky míchané reaktory třífázový systém: plyn-kapalina-pevná fáze účel míchání – homogenizace, dispergace koncentrační a teplotní homogenita střihové napětí – rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha vysoká turbulence – přestup látky a tepla mechanické míchadlo (disková turbína, 4-6 listů, d asi 0.3

dT) vzdušnění zespoda zarážky pro optimální promíchávání (4-8, d asi 0.1dT) –

zamezení vzniku víru aerační věnec - bubliny rozbíjeny míchadlem vrchní část - odplyny

mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba I

1 - nádoba bioreaktoru

2 - plášť

3,4 - izolace

5 – přívod inokula

6 – porty pro pH elektrody

7 - míchadlo

8 – aerační věnec

9 – ucpávka

10 - převodovka

11 – motor

12 – vypouštěcí otvor

mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba II

13 – chlazení pláště

14 – vzorkovací otvor s připojením páry

15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)

16 – přívod roztoků na úpravu pH a odpěňovadla

17 – vstup vzduchu

18 – víko

19 – přívod média

20 – odvod vzduchu

21 – porty na různé senzory (O2, T,…)

22 – rozbíječ pěny

23 – přívod páry

24 – tryska

dispergace mícháním rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha – vysoký

přestup O2 do kapaliny vytvoření dostatečného střihového napětí nutno znát maximální střihové napětí, které

mikroorganismy snáší kompromis mezi maximální dodávkou kyslíku a

homogenizací a velikostí střihových sil

základní typy míchadel

vrtulové vysoká čerpací kapacita, menší střižné síly, axiální tokvysoká čerpací kapacita, menší střižné síly, axiální tok

turbínové otevřená disková turbína s dělicím kotoučem, vzduch otevřená disková turbína s dělicím kotoučem, vzduch

přiváděn do aeračního věnce pod míchadlem; výhody přiváděn do aeračního věnce pod míchadlem; výhody – vysoké střižné síly způsobují dispergaci – vysoké střižné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin, dělicí kotouč zabraňuje vzduchových bublin, dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele; nevýhoda – zkratovému toku vzduchu kolem hřídele; nevýhoda – omezená čerpací kapacitaomezená čerpací kapacita

mechanická míchadla

nahoře: disková míchadla - různý směr lopatek

dole: a) vrtulovéa) vrtulové b) diskové s b) diskové s

narážkaminarážkami c) diskové bez c) diskové bez

narážeknarážek

základní konfigurace obvykle více míchadel – zlepšení homogenizace

(vzdálenost 1-1.5 D) rychlost míchání – limitace dle systému (vibrace) velikost míchadla – větší průměr – lepší míchání

(D/DT = 0.4-0.5) zarážky – zlepšení míchání, minimalizace vzniku víru,

4 ks 0.1 DT vzdušnění – zlepšení míchání PG

P=f ( V̇ G

n⋅d3 )

příkon míchadel

pro newtonské kapaliny

příkonové číslo je funkcí Reynoldsova čísla

P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, μ – dynamická viskozita

P=P0⋅ρ⋅n3⋅d 5

Re= n⋅d2⋅ρμ

důvodem pro intenzívní míchání není obvykle homogenizace, ale

přestup kyslíku

kultivace v jednorázových kultivačních vacích

charakter kultivačních vaků

stupňování požadavků na čistotu a sterilitu citlivost tkáňových kultur na střižné síly předsterilizované jednorázové plastové

kultivační vaky kultivační objemy od stovek mililitrů až po

tisíc litrů nedostatek kyslíku – jemná dispergace náklady na jednorázové zařízení jsou vysoké

- drahé produkty

bioreaktory s vlnovým mícháním

1: základna,2: čep,3: vsádka,4: vak,5: výstupní filtr, 6: vstupní filtr.

výbava kultivačních vaků

apertury pro vstupy a výstupy médií, inokula, aeračního plynu a výdechového plynu

sterilita plynů se zajišťuje mikrofiltry spoje jsou realizovány jednorázovými

trubkami, hadicemi a konektory jednorázové senzory pro kultivační

parametry - pH, teplotu, koncentraci rozpuštěného kyslíku

vaky s mechanickým mícháním

nedostatečné míchání v plastových vacích plastové nebo ocelové mechanické míchadlo pohyblivé spojení je zajištěno magnetickou

spojkou, nebo různými typy plastových či keramických ucpávek

vak je často umístěn v ocelové nádobě

Sartorius Stedim Biotech:BIOSTAT CultiBag STR Plus

membránové bioreaktory

charakter a použití MBR

charakteristická zádrž buněk nebo nosičů je možné dělení produktů katalyzovaná reakce (retězec reakcí)

mimo membránu mimo membránu uvnitř membrány (funkcionalizovaná membrána) uvnitř membrány (funkcionalizovaná membrána)

vhodné pro kultivace tkáňových buněk, kmenových buněkkultivace tkáňových buněk, kmenových buněk čištění odpadních vodčištění odpadních vod

submerzní membránový bioreaktor

funkční dělení MBR

bioreaktory se separací buněk (biomass separation membrane bioreactor, BSMBR)

bioreaktory s aerací přes membránu (membrane aeration bioreactor, MABR)

extraktivní bioreaktory, kde se odděluje metabolit či produkt (extractive membrane bioreactor, EMBR)

bioreaktory s výměnou iontů na membráně (ion exchange membrane bioreactor, IEMBR)

perfuzní bioreaktory

distribuce media sítí kanálů k buňkám - kontinuální výměna média

hollow-fibre bioreaktor

dvou-kompartmentový systém intrakapilární a extrakapilární prostorintrakapilární a extrakapilární prostor

svazek dutých vláken svazek dutých vláken rovnoměrný průtok pro všechna vlákna rovnoměrný průtok pro všechna vlákna

svazkusvazku svazek dutých vláken je uložen v svazek dutých vláken je uložen v

cylindrickém pouzdře, kterým proudí cylindrickém pouzdře, kterým proudí extrakapilární tokextrakapilární tok

semipermeabilní membrána - selektivní semipermeabilní membrána - selektivní prostup složek médiaprostup složek média

kultivace na pevných půdáchSSC

výhody SSC jednoduchost a nenáročnost na strojní vybavení vyšší objemová koncentrace produktů efektivnější izolace produktů jednodušší inokulace, absence tvorby pěny menším objem odpadů některé organismy se v submerzním prostředí kultivují obtížně,

nebo netvoří žádané produkty (např. některé vláknité mikroorganismy, nebo tkáňové buňky adherující na pevné povrchy)

uvádí se vyšší odolnost ke kontaminaci, protože SSC představují selektivnější prostředí z hlediska dostupnosti substrátu a snížené vlhkosti.

je obtížnější zajistit sterilitu technicky

bioreaktory pro pevný substrát

nemíchané bioreaktory

nemíchaný a neaerovaný otevřená vana, nad kterou cirkuluje vzduchotevřená vana, nad kterou cirkuluje vzduch

nemíchaný a aerovaný packed-bed – suchý substrát ve vertikálním loži, zespoda packed-bed – suchý substrát ve vertikálním loži, zespoda

vháněný zvlhčovaný vzduchvháněný zvlhčovaný vzduch

míchané bioreaktory

s aerací nebo bez bubnové rotační, bubnové s lopatkamibubnové rotační, bubnové s lopatkami vertikální s oběžným míchadlemvertikální s oběžným míchadlem

Terrafors 15 L rotating drum

submerzní kultivace kultivace s imobilizací

výskyt gradientu živin živiny protékají

nízká vrstva substrátu vysoká vrstva média

transportní procesy transportní procesy / limitace

kyslík rozpuštěn v kapalině kyslík rozpuštěn v kapalině

růst MO na povrchu substrátu MO rostou v médiu růst MO na/v matriciprodukt koncentrovaný nízká koncentrace produktu vyšší koncentrace produktu

obtížný scale-up definovaný scale-up

kultivace na pevném substrátu

živiny jsou rovnoměrně rozptýlené

průtočný systém / vznos / míchání

limitace transportu tepla a hmoty

třífázový systém pevná – kapalina - plyn

dvoufázový systém kapalina - plyn

třífázový systém pevná – kapalina - plyn

kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze

teplo se odvádí pomocí plynné fáze

teplo se odvádí vnějším chlazením

teplo se odvádí vnějším chlazením / problematický

přechod z pevné fáze

obtížné sledování a řízení procesu

sledování a řízení procesu je běžné

sledování a řízení procesu je možné, ale obtížnější v pevné

fázi

obtížněji definovatelný scale-up

kultivační proces – dynamika, řízení, optimalizace

základní typy kultivací

vsádková (batch) uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani

odvod metabolitůodvod metabolitů přítokovaná (fed-batch)

přítok média ano, odvod média ne – objem přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantníreaktoru není konstantní

kontinuální (continuous cultivation) otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, otevřený systém, plynulý přítok a odtok média,

konstantní objem reaktorukonstantní objem reaktoru

vsádková kultivace (batch)

uzavřený systém všechny živiny i inokulum přivedeny na počátku

kultivace živiny postupně spotřebovávány, akumulace

biomasy a metabolitů – činností metabolismu MO

konstantní objem bioreaktoru zanedbává se změna objemu – úprava pH,

odpěňování, vzdušnění

fáze růstu v batch režimu

lag fáze exponenciální fáze stacionární fáze fáze odumírání mezi jednotlivými fázemi tranzientní stavy požadavky: minimalizace lag fáze, prodloužení

a exponenciální fáze

fáze růstové křivky

exponenciální fáze růstu

intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako koncentraci buněk nebo biomasy

T – doba zdvojení, n – počet generací

X=X 0⋅eμ t dXdt

=μ⋅X

t=n⋅T X=X 0⋅2n

ln (X )=μ t+ ln (X 0)

průběh vsádky v exp. fázi

maximalizace μ

složení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.

množství vytvořené biomasy přímo úměrné množství spotřebované živiny

výtěžnost (yield): rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby živiny

a naopak hodnota YX /S za různých podmínek různá

Y X /S=dXdS

řízení vsádkového procesu

produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu

produkce primárního metabolitu – prodloužení exponenciální fáze růstu za současné produkce metabolitu

produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodloužená stacionární fáze

přítokovaná kultivace (fed-batch) jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru

během kultivace, produkt zůstává v bioreaktoru přítok média ano, odvod média ne – Vr není

konstantní řízení rychlosti přítokování limitujícího substrátu řízení

rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a metabolismu

výhoda – řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek nebo produktivitu

živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem bioreaktoru roste

uplatnění fed-batch

substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)

hustá kultura – vysoká koncentrace buněk glukosový efekt (over-flow metabolismus) katabolická represe – snadno metabolizovatelný

zdroj (glukosa) optimalizace tvorby metabolitu – produkce AK,

řízené udržování nízké koncentrace S prodloužení produkční fáze (oddělení produkční a

růstové fáze) – sekundární metabolity

řízení přítoků I

koncentrace substrátu se udržuje konstantní nebo se mění podle optimálního algoritmu pomalý konstantní přítok média – lineární růst pomalý konstantní přítok média – lineární růst

celkové biomasycelkové biomasy exponenciální přítok média – exponenciální růst exponenciální přítok média – exponenciální růst

biomasybiomasy přítokování média podle zvoleného parametru

spojeného s růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace)

řízení přítoků II

podle předem daného schématu – přerušovaný nástřik podle vypočtené funkce

přímo – měření koncentrace substrátu v bioreaktoru, podle toho upraven nástřik

nepřímo – měření jiných parametrů, které jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.

kontinuální kultivace

otevřený systém plynulé(nepřetržité) dodávání živin (média) plynulý odběr média pozměněného

metabolickou činností MO i s částí biomasy rychlost přítoku = rychlost odvodu konstantní objem bioreaktoru rozmnožování za optimálních podmínek

typy kontinuálů - chemostat

chemostat konstantní rychlost přítoku média F (konstantní konstantní rychlost přítoku média F (konstantní

zřeďovací rychlost D, rychlost přítoku substrátu = zřeďovací rychlost D, rychlost přítoku substrátu = rychlost spotřeby substrátu) mikroorganismy si podle rychlost spotřeby substrátu) mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní podmínek nastaví konstantní μμ a konstantní X a konstantní X

D= FV

(s−1 , h−1) D=μ

další typy kontinuálů

turbidistat konstantní turbidita (koncentrace biomasy) – mění se D konstantní turbidita (koncentrace biomasy) – mění se D

(automatická regulace)(automatická regulace) auxostat

konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO(nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO22stat: stat: COCO22=konst)=konst)

optimalizace bioprocesu

konstrukce/selekce produkčního kmene optimalizace složení média výběr typu kultivace

podle optimalizovaného parametru, technických podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritériímožností a dalších kritérií

optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)

optimalizace složení média

kvalitativní a semikvantitativní složení baňkové pokusy, využít optimalizační metodu, např. baňkové pokusy, využít optimalizační metodu, např.

experimentální design odvozený od Response Surface experimentální design odvozený od Response Surface Methodology, Optimal či Central Composition Methodology, Optimal či Central Composition Design, ke snížení počtu experimentůDesign, ke snížení počtu experimentů

kvantitativní složení vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a

vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu, vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu, mění se v časemění se v čase

bilanční modelování

matematický model procesu nebo zařízení vztahy popisující jeho chování v časevztahy popisující jeho chování v čase diferenciální rovnice, nelineární rovnicediferenciální rovnice, nelineární rovnice

VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE

identifikace modelu - konstanty

aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců

optimalizace, extrém funkce, účelová funkce = kritérium optimalizace

optimalizační proměnné, např. μ, π, YP / X, YP / S

S=∫ ( yM− y E)2⋅dt

optimalizace kultivačních parametrů

teplota optimální růstová teplota kmene, lze využít pro optimální růstová teplota kmene, lze využít pro

změny rychlosti růstu a produkcezměny rychlosti růstu a produkce pH

optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv složení média, indikátor metabolismuvliv složení média, indikátor metabolismu

aerace (řízení DOT) podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v

různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny metabolismumetabolismu

monitoring a automatizace konstrukční součást bioreaktoru senzory a zařízení pro měření základních stavových

veličin pH, teplota, DO, redox, DCO2, odplyny, X, S, PpH, teplota, DO, redox, DCO2, odplyny, X, S, P

měření a řízení základních procesních parametrů otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítokyotáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky

analogové měřící a řídící jednotky DDC (Direct Digital Control) realizované PLC nadřazené monitorovací, archivační a řídící systémy

základní regulace pH – automatizované dávkování H+ a OH-

teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média DO –

otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měničefrekvenční měniče

průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS měřeníregulace podle MS měření

tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SPSP

přítokování - tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji

vážením reaktoru nebo zásobníkuvážením reaktoru nebo zásobníku