Praktikum 4 - dokončení

karyotyp

Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu

fúze buněk

myší myelomová buňka

lidská buňka

Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu

• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.

– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.

Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.

Gen pro enzym B leží na chromozomu X.

Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.

Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených

chromozomů.

Praktická cvičení

str. 22 – 5.8 Úkol 5

Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace

buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi

nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek, které jsou

nezbytné při diagnostice mnoha onemocnění. • testování účinků léčiv a jiných chemických látek,

které by mohly ohrozit zdraví člověka, stanovení genotoxicity

• klinická genetika – prenatální a postnatální vyšetření

• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů

Praktikum 5

Chromozomová analýza

Karyotyp

Vyšetření geneticky podmíněných onemocnění

rodinagenealogické

vyšetření

chromozomy

cytogenetické vyšetření

DNAmolekulárně-

biologické vyšetření

pacient

Test

• 10 otázek (po 1 bodu)

• 15 minut

• Nezapomeňte uvést své jméno, kruh a

verzi, kterou píšete.

• Nepsat „romány“.

Cytogenetické vyšetření• Vyšetření karyotypu

• Stanovení chromozomových aberací– Numerických

• Změny počtu chromozomů

– Strukturních • Změny struktury chromozomů

• Význam – Diagnostika poruch způsobených chromozomovými

aberacemi

– Stanovení rizika pro potomstvo

Cytogenetická vyšetření

• Prenatální

– Vyšetření plodu

• Postnatální

– Vyšetření již narozeného jedince

plo

d

chorion

amnion

pupečník

Biopsie choriových klků

(CVS)

Amniocentéza

Kordocentéza

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.Závěr prenatálních

vyšetření

Týdny těhotenstvíPrenatální vyšetření

Choriové klky

Biopsie choriových klků

od 11. týdne těhotenství

Transabdominální odběr Transvaginální (transcervikální) odběr

Biopsie choriových klků

tkáň choriových klků

prohlídka pod stereomikroskopem

Prenatální vyšetření

Biopsie choriových klků

Amniocentéza

Kordocentéza

11. 16. 20. Těhotenství (týdny)

12.-20. týdenUltrazvuk

Biochemický test v 16.týdnuAFP, hCG, E3, PAPP

24.

ZÁVĚR PRENATÁLNÍCH

VYŠETŘENÍ

Ultrazvukové vyšetření

Provádíme plošně všem těhotným ženám.

Ultrazvukový záznam

Nuchální translucence

normální zvýšená

Možnost postižení plodu Downovým syndromem

Biochemický test

• Vyšetření tzv. biochemických „markerů“

• AFP – alfa-fetoprotein

• hCG – choriogonadotropin

• uE3 – nekonjugovaný estriol

• PAPP – pregnancy associated plasmatic protein

• V současnosti se používají různé kombinace markerů.

• Odchylky koncentrace upozorňují na možné (ne však

jisté) postižení plodu.

Amniocentéza

zpravidla od 15 - 16. týdne těhotenství

Amniocentéza

Odebíráme cca 20 ml plodové vody – po centrifugaci buňky kultivujeme a plodovou vodu použijeme k

biochemické analýze.

Kordocentéza

• Percutaneous umbilical blood sampling.

• Odběr fetální krve z placentálního úponu vena umbilicalis

provádíme od 20. týdne těhotenství

Kordocentéza

Ke všem prenatálním odběrům

musí těhotná žena podepsat

informovaný souhlas (pozitivní

revers), resp. negativní revers.

plo

d

chorion

amnion

pupečník

Biopsie choriových klků

(CVS)

Amniocentéza

Kordocentéza

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.Závěr prenatálních

vyšetření

Týdny těhotenstvíPrenatální vyšetření

Cytogenetická vyšetření

• Prenatální

– Vyšetření plodu

• Postnatální

– Vyšetření již narozeného jedince

Indikace pro postnatální chromozomová vyšetření

• Viz Klinická cytogenetika I.

• str. 54 – 57 subkapitola 9.2

– str. 56 – 9.2.3

Vzorky tkání pro postnatální vyšetření

• Periferní krev

• Fibroblasty z kožní

biopsie

• Kostní dřeň

(hemoblastózy)

• Nádor

• Sekční materiál (v

případě úmrtí pacienta)

Jak odebrat periferní krev pro chromozomové vyšetření?

• Desinfikovat místo

vpichu alkoholem

• Krev do zkumavky s

heparinem, resp.

Lithium-heparinem

• (Do EDTA odebíráme

krev pouze pro izolaci

DNA.)

Kultivace periferní krve

• Viz skripta klinická cytogenetika I., str.57 – 9.2.4

• Fytohemaglutinin – vysoce imunogenní látka – působí proliferaci lymfocytů

Klasické barvení chromozomů

Používáme pouze roztok Giemsa-Romanowski

6 – 12

13 – 15

19 – 20 21 – 22

4 – 5

G-pruhování (GTG)Trypsin + Giemsa

Viz Praktická cvičení – str. 25/obr. 6.1, str. 27/obr.6.3

Každý G-pruh má své číslo

Xq27.3

Chromozom X s očíslovanými G-pruhy

Syndrom fragilního X

Další metody barvení chromozomů

• R-pruhování

• Q-pruhování

• C-pruhování

• Ag-NOR

Viz skripta Klinická cytogenetika I., kapitola 9 (str. 58 – 59)

Metoda HRT

• Speciální kultivační technika

• Umožňuje získání prometafázních chromozomů

• Vhodná pro zjištění strukturních přestaveb malého rozsahu

Úkoly• viz Praktická cvičení• Str. 25

– 6.3 Úkol 1 Pozorování lidských chromozomů (preparát – postup při pozorování stejný jako v předchozích praktikách)

• Str. 26– 6.4 Úkol 2 Určení konstituce pohlavních chromozomů

(fotografie – počítáme akrocentry)

• Str. 27– 6.5 Úkol 3 Sestavení karyotypu (krabička s obrázky

chromozomů – sestavte karyotyp podle předlohy)

Výsledky zkontroluje vedoucí praktika nebo paní Tůmová.

Úkol 2: Určení konstituce pohlavních chromozomů

• Na předložené fotografii lidských chromozomů obarvených metodou G-pruhování zjistěte, zda se jedná o buňku muže nebo ženy.

• Chromozomy lze určit srovnáním s přiloženou předlohou.

• Jednodušší je však spočítat všechny malé akrocentrické chromozomy

Úkol 2

21 22 Y

muž

žena

Úkol 3

• Viz krabička a předloha

Výsledky

Zápis karyotypu podle ISCN 2005

• Normální nález– Muž … 46,XY– Žena … 46,XX

V zápisu uvádíme:

Celkový počet všech chromozomů, konstituci gonozomů

46,XY

Prosíme, vraťte preparáty do krabiček.

Příští praktikum

• Téma: Numerické chromozomové aberace

• Skripta

– Praktická cvičení – str. 28 – 33

– Klinická cytogenetika I. – kapitoly 10, 11

• Test nebude!

Na shledanou!

Obrázek převzat z publikace J. Šmardy: Člověk v proudu dědičnosti, ilustrace Dr. P. Ondrovčíka