22
Analytické metody Vladimíra Kvasnicová 1. SPEKTROFOTOMETRIE 2. CHROMATOGRAFIE 3. POTENCIOMETRIE 4. VOLUMETRIE Spektrofotometrie spektrofotometr Materiál používaný pro analýzu: ROZTOK
Analytické metody
Vladimíra Kvasnicová
1. SPEKTROFOTOMETRIE
2. CHROMATOGRAFIE
3. POTENCIOMETRIE
4. VOLUMETRIE
Spektrofotometrie
spektrofotometr
Materiál používaný pro analýzu:
ROZTOK
PRINCIP
• interakce mezi stanovovaným analytem a
monochromatickým zá řením
• část záření je absorbována
stanovovanou látkou, zbývající
záření je detekováno detektorem
• množství absorbovaného zá ření je p římo
úměrné množství analyzované látky
Spektrofotometrie je kvantitativní metoda :
stanovujeme
KONCENTRACI
↑↑↑↑ koncentrace ≈≈≈≈ tmavší roztok ⇒⇒⇒⇒ ↑↑↑↑ absorpce
Důležité termíny
vzorek = analyzovaný roztok
neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci
standard = vzorek o známé koncentraci
blank = roztok neobsahující analyzovanou látku
chromofor = část struktury chemické látky,
která je schopna absorbovat
záření ur čité vlnové délky
fialová 380 – 450 nm
modrá 450 – 495 nm
zelená 495 – 570 nm
žlutá 570 – 590 nm
oranžová 590 – 620 nm
červená 620 – 750 nm
viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum
Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum (2006)
Používané elektromagnetické zá ření
• barevné vzorky: viditelné (VIS)
• bezbarvé vzorky: UV zá ření
A / λλλλ
„absorp ční spektrum“
Komplementární barvy
SCHÉMA spektrofotometru Které veli činy jsou m ěřeny?
TRANSMITANCE
= poměr intenzity zá ření vystupujícího z kyvety (I)
k intenzit ě záření do kyvety vstupující (I o)
(tj. záření dopadající na detektor / p ůvodní zá ření)
T = I / Io
T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)
Jak se vyjad řuje množství pohlceného záření?
veli čina odvozená od transmitance: ABSORBANCE
A = - log 10 T= - log 10 (I/I0) = log 10 (I0/I) = log 10 (1/T)
A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více)
horní limit závisí na citlivosti detektoru
4.099.990.010.0001
3.099.90.10.001
2.09910.01
1.090100.10
0.350500.50
0.0510900.90
0.0041990.99
001001
Apohlceno (%)prošlo (%)T
4.099.990.010.0001
3.099.90.10.001
2.09910.01
1.090100.10
0.350500.50
0.0510900.90
0.0041990.99
001001
Apohlceno (%)prošlo (%)T
≈≈≈≈ citlivosti detektoru
Zjišt ění koncentrace:
1. Lambert-Beer ův zákon2. Kalibra ční křivka3. Výpočet pomocí hodnot (A, c)
standardních vzork ů
Zjišt ění koncentrace:
Lambert-Beer ův zákonA = εεεε x l x c
neboT = 10- (εεεε x l x c)
A = absorbance (A = -log T)
T = transmitance (T = 10 -A)
εεεε = molární absorp ční („extink ční“) koeficient
l = tlouš ťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace
Kalibra ční křivka
3 a více standard ů
zpracovaných
stejnou metodou
lineární kalibra ční
křivka
A = εεεε x l x cy = kx + q
Výpočet pomocí standard ů
Ast = cst x l x εεεε Avz = cvz x l x εεεε
Ast / cst = l x ε Avz / cvz = l x ε
l x ε = l x ε
Ast / cst = Avz / cvz
cvz = Avz x (cst / Ast)
cvz = Avz x f
f = průměr všech (c st / Ast) použitých p ři experimentu
Cvičení1) Avz = 0,25 Cvz = ?
Ast = 0,40 Cst = 4mg / L[2,5mg/L]
2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, C vz = ? (v mg/L i mmol/L)
MW = 180g[839mg/L = 4,7mM ]
3) standard protein ů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44Porovnejte koncentraci protein ů ve vzorku pacienta se standardem.
[4/3]
Přesnost stanovení
absorpce ostatními látkami p řítomnými
ve vzorku musí být eliminována:
BLANK (slepý pokus)
→ jeho absorbance se ode čte od absorbance
vzorku ⇒⇒⇒⇒ výsledná absorbance odpovídá pouze
koncentraci analyzované látky
Spektrofotometrie v praktickém cvi čení
„Stanovení koncentrace kreatininu v mo či“
analyzovaný vzorek : vlastní mo č
1. bezbarvý kreatinin je p řeveden na barevný
produkt chemickou reakcí
2. koncentrace kreatininu ve vzorku se
zjiš ťuje z nam ěřené absorbance pomocí
kalibra ční křivky
Obrázek převzat z http://www.fredmiranda.com/hosting-data/500/43850455-End-of-the-Rainbow.jpg (říjen 2007)
Chromatografie
chromatograf
Všechny
chromatografické
techniky nejsou
instrumentální...
TLC chromatografie = úkol v praktiku
PRINCIP
Separace sm ěsi různých látek je založena na
rozdílné distribuci látek mezi dv ě
nemísitelné fáze:
• stacionární fáze (pevná nebo kapalná)
• mobilní fáze (kapalná nebo plynná)
Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární f ázi
rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinit ě k fázím.
• pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká,
látka putuje systémem rychleji než látka
s nižší afinitou
• pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi
vysoká, látka je ve stacionární fázi déle
zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji
než látka mající nižší afinitu
Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)
Co je cílem analýzy?
1. rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky
2. identifikovat látky (= kvalitativní analýza)
3. stanovit koncentraci přítomných látek
(= kvantitativní analýza)
Klasifikace chromatografických technik
1) podle mobilní fáze
� kapalinová chromatografie (LC)
� plynová chromatografie (GC)
2) podle uspo řádání
� planární (rovinná) chromatografie
� chromatografie v kolon ě
3) podle fyzikáln ěchemických interakcí
� adsorp ční chromatografie
� rozdělovací chromatografie
� gelová permea ční chromatografie (GPC)
� chromatografie na iontom ěničních (IONEX)
� afinitní chromatografie
Fyzikáln ě-chemické mechanismy separace
adsorpce rozpoušt ěnísítový efekt –
gelová chromatografie
iontová vým ěna specifická interakce-afinitní chromatografie
Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma
kapalinová
v kolon ě
„manuální“
chromatografie
kapalinová
v kolon ě
„instrumentální“
chromatografiekapalinová planární
chromatografie
příklad:
Plynová chromatografie (GC)
Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-6.html
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006) Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Vyhodnocení chromatogramu
Porovnání skvrn se
standardy:
Rf = a /b
Rf = retardační faktor
(„rate of flow“)
a = vzdálenost start-střed skvrny
b = vzdálenost start-čelo mobilní f.
1) planární chromatografie (p ř. TLC)
„b“
„a“
Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
2) chromatografie v kolon ě (HPLC, GC)
Porovnání „pík ů“ se
standardy:
tR = retenční čas
≈ identifikace látek
h = výška píku
≈≈≈≈ koncentrace látek
„píky“
Chromatografie v praktickém cvi čení
„ TLC lipofilních barviv“
= adsorp ční planární kapalinová chromatografie
• mobilní fáze: toluen (nepolární)
• stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)
• stadardy barviv → porovnání Rf
• neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva
„Demonstrace HPLC a GC“
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
(vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
• normální nebo reverzní fáze
• princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.)
GC= Gas Chromatography(plynová chromatografie)
Obrázek převzat z http://images.epilogue.net/users/lorangel/THE_ALCHEMIST.jpg (říjen 2007)
Potenciometrie
potenciometr
PRINCIP
Potenciometrie je elektrochemická metoda
založená na měření nap ětí elektrochemického
článku za bezproudého stavu .
dvě elektrody :
• indika ční (měřící) elektroda
• referentní (srovnávací) elektroda
Schéma: Elektrody
indika ční elektrodajejí potenciál závisí na složení roztoku
referentní elektrodajejí potenciál je stabilní (konstantní, známý)
Měřit přímo potenciál jako takový nelze ⇒ měříme rozdíl potenciál ů (=napětí)
indika ční elektrodyObrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006)
Nernstova rovnice
E = E0 + (RT/nF) ln a M
E = elektrodový potenciálE0 = standardní elektrodový potenciál
R = molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1)F = Faradayova konstanta (96 458 C mol-1)
T = absolutní teplota (25 0C = 298 K)n = náboj stanovovaného iontu (M)
a = aktivita stanovovaného iontu
E = E0 + (RT/nF) ln a M
ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F ⇒
E = E0 + (0.059/n) log a M
! DŮLEŽITÉ !• elektrodový potenciál závisí na teplot ě roztoku,
aktivit ě („koncentraci“) a náboji stanovovaného iontu
• elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat:ke kalibraci potenciometru používáme standardy
Obecná klasifikace elektrod
1) elektrody I. druhu (kovové nebo plynové)
2) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná s ůl)
→ REFERENTNÍ ELEKTRODY
3) redoxní elektrody (Pt, Au)
4) membránové elektrody
→ ISE = iontov ě selektivní elektr.
(stanovení iontů v medicíně: H+, Na+, K+, Cl-,...)
„Standardní vodíková elektroda“ (SHE)
• plynová elektroda
• její potenciál byl definován: ESHE = 0za všech podmínek
REFERENTNÍELEKTRODA,ale v praxi se běžně nepoužívá
Referentní elektrody
kalomelová argent-chloridová
SHE
„Sklen ěná elektroda“
= ISE (H+)
stanovenípH
membránováelectroda
Membránové elektrody na stanovení plyn ů
skleněnáelektroda
referentníelektroda
tělosensoru
vnitřníelektrolyt
permeabilnímembrána
analyzovanéprostředí
skleněnáelektroda
CO (g)2
permeabilnímembrána
analyzovanéprostředí
film elytu
pH-metr
CO +H O HCO +H+2 2 3-
elektroda používaná na stanovení CO 2 v krvi
Potenciometrie v praktickém cvi čení
„ Měření pH fosfátového pufru“
• roztoky fosfátového pufru o r ůzném složení
• stanovení pH pomocí pH-metru
(= upravený potenciometr)
• kalibrace p řístroje pomocí standard ů
• sklen ěná kombinovaná elektroda („dvoj če“)
Skleněnákombinovaná
elektroda
vnějšírefeferentníelektroda
stín ění – přívodk vn ější ref.elektrod ě
vnit řní vodi č – přívodk vnit řní ref.elektrod ě
plnicíotvor
vnit řní referentníelektroda
solný m ůstek (keramická frita)
sklen ěnámembrána
Skleněnákombinovaná
elektroda v praktiku
„A večer nabereme vzoreček krve...“
Obrázek převzat z http://xnet.kp.org/permanentejournal/fall02/images/DracCartoon.JPG (říjen 2007)
Volumetrie (= titrace, odm ěrná analýza)
Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem
byretas odm ěrným
roztokem
titra ční baňka s naředěnýmanalyzovaným vzorkem
titrace= zjištěnípřesné
koncentrace vzorku
PRINCIP
K analyzované látce se pomocí byrety postupn ě přidává
roztok o známé koncentraci , a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického
poměru reagujících látek (= bod ekvivalence )
bod ekvivalence= reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisujícíprobíhající reakci
Odměrný roztok (OR)
• známé, přesně definované složení
• jeho koncentraci lze p řesně stanovit pomocí
stadardu o známé a neměnné koncentraci
• reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez
vedlejších reakcí
• reakci lze popsat chemickou rovnicí
• v bod ě ekvivalence dochází „skokem“
k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno
snadno indikovat
Zjišt ění přesné koncentrace OR
• titrací standardu o přesně známé koncentraci• porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané)
spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou):
Vt / Va = f
• f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100)• aktuální konc. OR (= titr): ca = f x c t
• faktorem při výpočtu koncentrace vzorkunásobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR
Výpočet koncentrace vzorku
• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce
a A + b B → c C + d D
a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n)A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka
a / b = n(A) / n(B)
a / b = n(A) / n(B)
c = n / V → n = c x Vc = molární koncentrace (mol/l)
n = látkové množství (mol)V = objem roztokua, b = stechiometrické koeficienty
a x n(B) = b x n(A)
a x cB x VB = b x cA x VA
a x cB x VB = b x cA x VA
• známe stechiometrii chemické reakce
• známe koncentraci odměrného roztoku a jeho objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence
• známe objem vzorku použitého pro analýzu
jediná neznámá je koncentrace vzorku
cB
Cvičení
1) spot řeba odm ěrného roztoku: 23,8 ml NaOH,(f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H 2SO4; C = ?
[0,12M]
2) spot řeba odm ěrného roztoku: 10ml KMnO 4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO 4 ; C = ? (mol/ L, % ),
MW = 152g[0,25M = 3,8% ]
3) H3PO4 → Na2HPO4vzorek: 20ml H 3PO4 (C = 0,3M ),odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?
[60ml]
Titraci provádí jedna osoba :po kapkách přidává OR z byrety
za stálého promíchávání obsahu titra ční baňky
Indikace bodu ekvivalence
1) pomocí indikátoru� jednoduché, ale subjektivní hodnocení
� bod ekvivalence ≈ objemu OR po jehož přidánízmění titrovaný roztok trvale své zbarvení
� indikuje „první nadbyte čnou kapku “ přidaného OR
⇒ ve skutečnosti je při změně zbarveníroztok „přetitrován“
2) pomocí p řístroje (např. potenciometru)� objektivní� vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA
Titrační křivkatitrace kyseliny hydroxidem
odměrný roztok
indikátoryměřenáveli čina
titrace hydroxidu kyselinou
odměrný roztok
Titrační křivky a pK
• http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz02/2-15.html
• http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz02/2-16.html
Klasifikace titrací
1) neutraliza ční (acidobazické) kyselina /báze• H+ + OH- → H2O
2) oxida čně-reduk ční (redox) ox./red. činidlo• oxidace: red → ox + e-
• redukce: ox → red + e-
3) srážecí př. AgNO 3
• vznik nerozpustné sraženiny
4) komplexometrické př. EDTA• vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny
Titrace v praktickém cvi čení
„Stanovení acidity žalude ční šťávy“
• reaguje HCl ze žaludeční šťávy
• odměrný roztok: NaOH
→ neutraliza ční titrace (= alkalimetrie)
• indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)
• z konc. HCl se vypočítá pH žalude ční šťávy
• zjišťuje se pH před a po stimulaci
(= na lačno a „po jídle“)Obrázek převzat z http://success.shoreline.edu/mlt/DebHitachi9172.jpg (říjen 2007)
Návody na praktika+ teorie metod a zkušební otázky:
http://vyuka.lf3.cuni.cz(Buněčné základy medicíny, č. 112)
Cvičení
1. 0,3 osmol/L MgCl2 = ................. mol/L
2. c(St) = 15,0 mM A(St) = 0,600
c(vz) = ....... mM A(vz) = 0,200
3. c1 = 0,10 mM / 10 x naředěno ⇒ c2 = ....... mM
4. 0,2 mol/L Na2HPO4 = ............... osmol/L
5. T(St) = 0,25 T(vz) = 0,25 / porovnejte koncentrace
6. c1 = 0,2 mM / c2 = 0,002 mM ⇒ ? x naředěno
7. 0,1 mol/L NaCl = ............ osmol/L
8. T(St) = 0,30 T(vz) = 0,60 / porovnejte koncentrace
9. c1 = 0,1 mM / c2 = 0,01 mM ⇒ ? x naředěno
10. 0,1 mol/L NaH2PO4 = .......... osmol/L
Cvičení
11. T(St) = 0,50 T(vz) = 0,30 / porovnejte koncentrace
12. c1 = 0,2 mM / c2 = 0,1 mM ⇒ ? x naředěno
13. 0,24 osmol/L KCl = .............. mol/L
14. c(St) = 10,0 mM A(St) = 0,400
c(vz) = ....... mM A(vz) = 0,200
15. c1 = 0,2 mM / 10 x naředěno ⇒ c2 = ....... mM
16. 0,24 osmol/L NaH2PO4 = ................. mol/L
17. c(St) = 5,0 mM A(St) = 0,300
c(vz) = ..... mM A(vz) = 0,600
18. c1 = 0,2 mM / 100 x naředěno ⇒ c2 = ....... mM
19. 0,2 mol/L MgCl2 = .......... osmol/L
Cvičení
20. T(St) = 10% T(vz) = 40% / porovnejte koncentrace
21. c1 = 0,25 mM / c2 = 0,05 mM ⇒ ? x naředěno
22. 0,24 osmol/L glukóza = .......... mol/L
23. c(St) = 10,0 mM A(St) = 0,400
c(vz) = ....... mM A(vz) = 0,800
24. c1 = 0,20 mM / 5 x naředěno ⇒ c2 = ....... mM
25. 0,3 osmol/L NaHCO3 = ............ mol/L
26. c(St) = 20,0 mM A(St) = 0,800
c(vz) = ....... mM A(vz) = 0,200
27. c1 = 0,10 mM / c2 = 0,05 mM ⇒ ? x naředěno
28. 0,2 mol/L CaCl2 = ............. osmol/L
