21
Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová
Kurz 1
Úvod k biochemickému praktiku
Pavla Balínová
Důležité informace
Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová
• e-mailová adresa:
• místnost: 410
• studijní materiály jsou dostupné v aplikaci
Výuka:
http://vyuka.lf3.cuni.cz/
Osnova semináře
• organizace praktik
• pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
• laboratorní vybavení
• práce s automatickou pipetou
• informace k jednotlivým úlohám praktik
• rozdělení studentů do pracovních skupinek a
přidělení praktické úlohy na první týden praktik
Organizace praktik (lab. kolečko B1 – B4) 4 úlohy / 4 týdny / 8 pracovních stolů
- rozdělení kroužku do 8 pracovních skupin
• SPEKTROFOTOMETRIE - B1
(stanovení koncentrace kreatininu v moči)
• CHROMATOGRAFIE - B2
(TLC lipofilních barviv)
• TITRACE - B3
(stanovení acidity žaludeční šťávy)
• POTENCIOMETRIE - B4
(měření pH fosfátového pufru)
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
jsou dostupná v aplikaci Výuka:
http://vyuka.lf3.cuni.cz/
Laboratorní vybavení,
práce s automatickou pipetou
Informace k jednotlivým úlohám praktik
SPEKTROFOTOMETRIE
(stanovení koncentrace kreatininu v moči)
• analyzovaný vzorek: vlastní moč
1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt
chemickou reakcí v alkalickém prostředí (Jaffého reakce)
2. měření absorbance standardních roztoků kreatininu a vzorku
moče pomocí spektrofotometru ve viditelné oblasti
3. koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené
absorbance pomocí kalibrační křivky
Spektrofotometrie – výpočty v
praktiku
• příprava kalibračních roztoků ze zásobního
standardního roztoku kreatininu (ředění)
• naředění vzorku moči
• přepočet hmotnostní koncentrace na molární
Zjištění koncentrace:
1. Lambert-Beerův zákon
2. Kalibrační křivka
3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních roztoků
Spektrofotometrie
Lambert-Beerův zákon
A = e x l x c nebo T = 10 -(e x l
x c)
A = absorbance (A = -log T)
T = transmitance (T = 10 -A)
e = molární absorpční („extinkční“) koeficient
l = tloušťka kyvety (v cm)
c = molární koncentrace
Spektrofotometrie – kalibrační křivka
3 a více standardů
zpracovaných
stejnou metodou
lineární kalibrační křivka
A = e x l x c
y = kx + q
Spektrofotometrie - výpočet pomocí
hodnot (A, c) standardních roztoků
stand. roztok zkoumané látky vzorek zkoumané látky
Ast
= cst
x l x e Avz
= cvz
x l x e
Ast / c
st = l x e A
vz / c
vz = l x e
l x e = l x e
Ast / c
st = A
vz / c
vz
cvz
= Avz
x (cst / A
st)
cvz
= Avz
x f
f = průměr všech (cst
/ Ast
) použitých při experimentu
Spektrofotometrie - příklady
1) standard: A = 0,600, c = 15,0 mM
vzorek: A = 0,200, c = ?
2) standard: T = 0,30
vzorek: T = 0,60
Je cvz
nižší nebo vyšší než cst?
3) c1 = 0,1 mM c
2 = 0,01 mM
Kolikrát byl vzorek naředěn?
4) vzorek o c = 0,2 mM byl naředěn 100x
Jaká je jeho koncentrace po naředění?
CHROMATOGRAFIE
(TLC lipofilních barviv)
= adsorpční planární kapalinová chromatografie
• mobilní fáze: toluen (nepolární)
• stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)
• standardy barviv → porovnání Rf
• neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva
Chromatografie – vyhodnocení
chromatogramu
planární chromatografie (př. TLC)
Porovnání skvrn se standardy
Rf = a/b
Rf = retardační faktor
a = vzdálenost start – střed skvrny
b = vzdálenost start – čelo mobilní
fáze Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
TITRACE (ODMĚRNÁ ANALÝZA)
(stanovení acidity žaludeční šťávy)
• reaguje HCl ze žaludeční šťávy
• odměrný roztok: NaOH → neutralizační titrace
• indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)
• z koncentrace HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy
• zjišťuje se pH před a po stimulaci (= na lačno a „po jídle“)
Titrace - výpočet koncentrace vzorku
• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce
a A + b B → c C + d D
a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n)
A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka
a / b = n(A) / n(B)
c = n / V → n = c x V
c = molární koncentrace (mol/l), n = látkové množství (mol),
V = objem roztoku, a, b = stechiometrické koeficienty
a x n(B) = b x n(A)
a x cB x V
B = b x c
A x V
A
POTENCIOMETRIE
(měření pH fosfátového pufru)
• elektrochemická metoda založená na měření napětí
elektrochemického článku za bezproudého stavu
• dvě elektrody:
• indikační (měřící) elektroda
• referentní (srovnávací) elektroda
• v praktiku stanovení pH pomocí pH-metru (= upravený
potenciometr)
Potenciometrie
• roztoky fosfátového pufru o různém složení
• kalibrace přístroje pomocí standardů
• skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)
Potenciometrie - pufry
• roztoky schopné vyrovnávat výkyvy pH: po přidání
silné kyseliny nebo zásady změní své pH jen nepatrně
• používají se k udržování stabilní hodnoty pH
• složení pufrů:
„konjugovaný pár: kyselina / zásada“
* slabá kyselina + její sůl např. octanový pufr
* slabá zásada + její sůl např. amonný pufr
* 2 různé soli vícesytné kyseliny např. fosfátový pufr
* amfoterní látky např. proteiny
Potenciometrie – výpočet pH pufrů
Henderson-Hasselbalchova rovnice
• pH = pKa + log (c
s / c
a) (pro kyselý pufr)
• pOH = pKb + log (c
s / c
b ) (pro bazický pufr)
• pH = 14 – pOH
• pK = disociační konstanta slabé kyseliny (pKa) nebo báze (pK
b)
• cs = aktuální koncentrace soli v pufru
• ca = aktuální koncentrace slabé kyseliny v pufru
• cb = aktuální koncentrace slabé báze v pufru
Potenciometrie – výpočet pH fosfátového
pufru
• výpočet pH všech připravených roztoků
pH = pK(H2PO
4-) + log c(HPO
42-) / c(H
2PO
4-)
Výsledná hodnota pH pufru je závislá nejen na koncentraci
složek, ale i na poměru složek pufru po smíchání tj.
poměru objemů obou složek pufru
pH = pKa + log n(HPO
42-) / n(H
2PO
4-)
pH = pKa + log (c
s x V
s) / (c
a x V
a)
