RCSB PDB
Progr. NMR
RCSB PDB
NMR biomakromolekulTypy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR
● proteiny a peptidy
– rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul
● nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy
– omezení malou rozmanitostí chemického složení
● polysacharidy a oligosacharidy
– omezení malou rozmanitostí chemického složení
● kombinace výše uvedených
NMR Proteinů
• Polymery α-aminokyselin, mnoho funkcí v organismu
• Katalytická - enzymy
• Strukturní a pohybové
• Signální
• Zásobní a transportní
• Obranné
• Pomocí NMR spektroskopie studujeme:
• Prostorové uspořádání
• Interakce s jinou molekulou
• Dynamika proteinu
Ala Asp Asn Arg Cys Glu Gln Gly His Ile
Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
Stavba a struktura proteinů
+
Ala1 Ala2 Ala1–Ala2 H2O
+
Vznik peptidové vazby:
helikální struktura (α-helix)
extendovanástruktura (β-sheet)
náhodné klubko (random coil)
Struktura proteinůU proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní
struktura.
● Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k C konci.
● Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovanástruktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb.
● Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu.
● Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.
Zdroje Proteinů• Původní organismus• + přirozená forma včetně všech modifikací• - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy,
složitá izolace,….• Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)• + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení• - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců• Chemická syntéza• + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny• - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se
správným sbalením proteinu• In-vitro translace• + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení• - drahé, posttranslační modifikace
Využívaná jádra v biomakromolekulách
+ vysoké přirozené zastoupení
+ vysoká citlivost (1,00)
− malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)
+ velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm)
− nízké přirozené zastoupení (1,11 %)
− nízká citlivost (1,76.10−4); po 100% isotopovém obohacení 1,59.10−2
• střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm)
− nízké přirozené zastoupení (0,37 %)
− nízká citlivost (3,85.10−6); po 100% isotopovém obohacení 1,04.10−3
• speciální účely
1H
13C
15N
2H
Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR● měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností
prostředí
● sledování průběhu biochemických dějů
● vysoce selektivní odezva na úrovni atomů
Čím jsme omezeni:
● velikost molekuly (ovlivnění T2)
– do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA]
□ lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů
– do 20 kDa [< 180 AA]
□ nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N
– do ~100 kDa
□ 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)
– větší proteiny
□ přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura
● koncentrace vzorku
– alespoň 0,2 mM
● dlouhodobá stabilita vzorku
– několik týdnů
Vzorek proteinu pro NMR měření● nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2–
0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe)
– používá se filtrace přes membrány s mikropóry
(protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné
rozpuštění
● úprava pH pufrem (pH typicky 4–8)
– vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu
amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu
signálů
● přidání redukčních činidel (R–SH)
– zabránění oxidace cysteinů a následného
vysrážení vzorku
● přidání 5–10 % D2O
– referenční jádro pro spektrometr (lock) roztok vzorku
250–300 µl
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorkunaměření NMR
spekter
přiřazení signálů atomům v molekule
přiřazení NMRparametrů
pro výpočetstruktury
obecné informace o molekule (primární
struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnoceníkvality struktur
oprava přiřazení
výpočetsouboru struktur
validace struktur
✓
1. publikované NMR spektrum proteinu
● spektrum proteinu RNasy A, měřeno
40 MHz spektrometrem, 1957
● 40 MHz CW spektrometr
Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood
J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.
První 1GHz NMR spektrometr● instalován firmou Bruker v Centre
de RMN à Très Hauts Champs,
Lyon, France
1H NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem
Nutný krok – potlačení signálu vody● jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O z těchto důvodů:
– jde o fysiologické prostředí
– při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium
● tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O, protože její signál je 104–
105krát intensivnější než signály měřené látky
● spektrum proteinu bez potlačení H2O:
Potlačení signálu H2O – metoda presaturace
selektivní CW-ozařování H2O během relaxační periody
π/2
Δ
zbytkový signál H2O
1H NMR spektrum proteinu po presaturaci vody
● spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole
Potlačení signálu H2O – metoda WATERGATE
(π/2)-y
1
H
Gz
Δ
πy(π/2)
x
sel. sel. Δ(π/2)-y
zbytkový signál H2O
1H NMR spektrum proteinu po WATERGATEexcitační profil selektivníhoπ/2 pulsu
● charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin
– kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)
H alifatické
HN peptidické
H aromatické
HN
postranní Hα
CH3
Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu
AA3AA2AA1
CCNC
NC
C
OH
HH R2
O
HR1
HR3
N
H
C
O
● 1H spinové systémy (3J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami
● 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a
● k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N
Vícedimensionální NMR experimenty● rozlišení informací obsažených v 1D spektrech
– korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N
– propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin
– pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení
http://www.protein-nmr.org.uk
1H
(ppm)
1H
(ppm)
15N
(ppm
)
15N
(ppm
)1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu
● ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních
strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, …
rozložený proteinsbalený protein
1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu● Sledování skládání proteinu – intrinsically disordered proteins
Peptid po 2 dnech po přídavku interakčního partneraSamotný peptid
15N
(ppm
)
1H (ppm) 1H (ppm)
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorkunaměření NMR
spekter
přiřazení signálů atomům v molekule
přiřazení NMRparametrů
pro výpočetstruktury
obecné informace o molekule (primární
struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnoceníkvality struktur
oprava přiřazení
výpočetsouboru struktur
validace struktur
✓ ✓
Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí● přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule
● postup:
1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO)
2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)
● Páteř proteinu postranní řetězce
● je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu
CO
Cα
O
HαCβ
N
HN
Hβ
označení jednotlivých atomů v
aminokyselině
Přiřazení resonancí – atomy hlavního řetězce● pro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních
třídimensionálních korelačních experimentů
– přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí (1J, 2J)
● základní experimenty (je mnoho dalších kombinací):
CC
NC
C
OH
H C
O
HC
N
H
H
H
HNCA
CC
NC
C
OH
H C
O
H
C
N
H
H
H
HN(CO)CA
CC
NC
C
OH
H CO
H
C
N
H
H
H
CBCANH
CC
NC
C
OH
H C
O
H
C
N
H
H
H
CBCA(CO)NH
modrá: jádra excitovaná i detekovanázelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu)červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace
Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA
13Cα
13C'15N
13Cα
13C'
15N
O
O1H
1H 13Cβ
13Cγ
1H
1H 13Cβ
13Cγ
90
11
15
7
55140
55
35
i − 1 i
< 1
13Cα
13C'15N
13Cα
13C'
15N
O
O1H
1H 13Cβ
13Cγ
1H
1H 13Cβ
13Cγ
90
11
15
7
55140
55
35
i − 1 i
< 1
interakční konstanty J v
Hz
HN(CO)CA
– po excitaci HiN je magnetizace je
přenesena na Ni (1JHN,N), dále na Ci−1
(1JN,C) a na Ci−1α (1JC,Cα)
– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα
– každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(Hi
N), ω(Ni), ω(Cα
i−1)}
HNCA
– po excitaci HiN je magnetizace
přenesena na Ni (1JHN,N) a dále současně na Ci
α (1JN,Cα) a Cαi−1
(2JN,Cα)
– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα
– každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(Hi
N), ω(Ni), ω(Ci
α)} a {ω(HiN), ω(Ni),
ω(Cαi−1)}
Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA● 2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých
amidických N
HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCAHN(CO)CAHNCAHN(CO)CA
někdy chybí pík…H
N
C
● různé implementace experimentů TOCSY a COSY
Přiřazení signálů postranních řetězců
Cα
C'
N
Cα
C'
N
O
OH
H Cβ
Cγ
H
H
Cβ
Cγ
H H
H
H H
H
HC(CCO)NH-TOCSY H(C)CH-COSY
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorkunaměření NMR
spekter
přiřazení signálů atomům v molekule
přiřazení NMRparametrů
pro výpočetstruktury
obecné informace o molekule (primární
struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnoceníkvality struktur
oprava přiřazení
výpočetsouboru struktur
validace struktur
✓✓
✓
Interpretace NMR spekter –přiřazení strukturních parametrů
NOE ≡ meziatomová vzdálenost
skalární interakční konstanta ≡ dihedrální úhel
chemický posun ≡ chemické okolí
residuální dipolární interakce ≡ vzájemná orientace vazeb
vodíkové vazby ≡ detailní lokální struktura
Nukleární Overhauserův efekt (NOE)● přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace
● rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1H, σIS:
γH ... gyromagnetická konstanta 1H
τc ... korelační čas molekulyω ... Larmorova frekvencerIS ... vzdálenost interagujících jader
H H
dosah interakce do 5–6 Å
●NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule.●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů.●Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity.●Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å.
X-editované NOESY experimenty● excitace pouze 1H atomů vázaných
na atomy 15N nebo 13C, přenos
magnetizace vlivem NOE na blízké
atomy 1H, detekce
1HN
1
H
řez 3D spektrem v rovině 1HN–1H na pozici 122 ppm v 15N doméně = signál Tyr66
Skalární interakce – zjištění dihedrálních úhlů● peptidová vazba tvoří rovinu definovanou
atomy O–Cα–N–HN
● vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformacepáteře proteinu je určena dihedrálními úhly φ a ψ– φ (C–N–Cα–C) a ψ (N–Cα–C–N)
● Karplusova rovnice
– závislost velikosti interakce 3J na
dihedrálním úhlu (θ)
– konstanty A a B zjištěny pro různé
kombinace interagujících jader
● problém: jedné hodnotě 3J mohou
odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního
úhlu
N
C'
C
N
C'
3J
[Hz]
10
8
6
4
2
0-120 600 120
H–N–Cα–H
CO–N–Cα–H
H–N–Cα–CβH–N–Cα–CO
θ [deg]
Chemický posun● chemický posun některých jader je
charakteristicky závislý na
sekundární struktuře
přiřazení resonancí
hlavního řetězce(Hα, Cα a C')
výpočet indexů chemického posunu (CSI)
odhad sekundární struktury podle
lokální hustoty CSI
náhodnéklubko
δ(Hα)
α-helix β-sheet
klesá roste
chemický posun
Histogram indexu chemického posunu jader Hα, Cα a C'
CN
−1
0+1
sekvence proteinu
helixI
helixII
helixIII
helixIV
Residuální dipolární interakce (RDC)● přímá dipól–dipólová interakce dvou jader
– v isotropním roztoku nedetekovatelná
– pozorovatelná v neisotropním prostředí u
molekul částečně orientovaných vůči
magnetickému poli
● tvorba neisotropního prostředí
– kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny
(virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý
polyakrylamidový gel
– samotné vnější magnetické pole
● příspěvek ke skalární interakci ⇒ snadná
měřitelnost
● velikost interakce DIS závisí na orientaci vazby
vůči směru B0
I
S
rIS
Θ Θ...úhel mezi vektorem I–S a B0
fosfolipidové bicely
orientované v magnetickém
poli
Vodíkové vazby● identifikace:
– výměnné experimenty H ↔ D
– teplotní závislosti chemických posunů
● charakterizace:
– měření skalární interakce (J) přes H-vazbu
● stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorkunaměření NMR
spekter
přiřazení signálů atomům v molekule
přiřazení NMRparametrů
pro výpočetstruktury
obecné informace o molekule (primární
struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnoceníkvality struktur
oprava přiřazení
výpočetsouboru struktur
validace struktur
✓✓
✓
✓
Přiřazení resonancía) páteřb) postranní řetězce
Strukturní omezení z NMR parametrů
✔vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální)
✔dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant
✔relativní orientace vazeb z dipolárníchkaplingů
✔případně další omezení
Výpočet trojrozměrné struktury
molekulová mechanika
+ simulované žíhání
Identifikace prvků sekundární struktury
Výpočet struktury proteinu● Přímý výpočet energie všech možných konformací proteinu je příliš
výpočetně náročný
● molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy
pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)
energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu
V případě proteinu se jedná o plochu
závislou na n proměnných (n je počet
optimalizovaných souřadnic/úhlů).
–použití všech dostupných
experimentálních omezení,
minimalizace celkové energie systému
–simulované žíhání: molekula se ohřeje
na vysokou teplotu (103 K) a nechá se
postupně chladnout. Po každém
ochlazení se vypočítá nová energie
systému. Cílem je překonat lokální
energetická minima a najít (nejlépe) to
globální.
–přidáme nové energetické členy pro
experimentální omezení: čím bližší
bude shoda vypočítané struktury s
experimentálními údaji, tím nižší bude
celková energie
Molekulová dynamika
Vypočítané struktury● obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi
– Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale
o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale
jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur,
které by se ovšem měly lišit jen nepatrně.
– Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem
experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.
● struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru
soubor strukturvybraná reprezentativní strukturaRMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)
Interakce proteinu s ligandem• Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace• Interaguje specificky?• Kde interaguje?• Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)
• Farmaceutický průmysl• Proteomické studie
• Metody pro měření interakce pomocí NMR• Sledování změn chemických posunů• Intermolekulární NOE• Transferred NOESY• Mapování H-D chemické výměny NH skupin• Mapování pomocí paramagnetické látky• Sledování změny dynamiky proteinu
Změny chemických posunů• Titrace proteinu ligandem• Sledování změn chemických posunů skupin
(nejčastěji HN)• Interakční povrch• Disociační konstanta
STD – Saturation transfer difference• Interakce protein-malá molekula• Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce• Přebytek ligandu• Zjistíme, která část ligandu interaguje• Odhad KD
koff
kon
protein
ligand ligand
STD-NMR princip
1H NMR (off-resonance)
© Lukáš Vrzal
koff
kon
ligand ligand
Excitace
protein
on-resonance
koff
kon
ligand ligand
protein
Přenos magnetizace
koff
kon
ligand ligand
protein
Přenos magnetizace
koff
kon
ligand
1H NMR (off-resonance) on-resonance
Relaxace signálů proteinu
protein
on-resonance off-resonance
STD-NMR (diferenční spektrum)
93%
73%
91%100%
1H NMR STD-NMR (difference spectrum)
STD – Saturation transfer difference
Intermolekulární NOE
• NOE efekt mezi dvěma molekulami
• U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE
• Rozdílné izotopové značení
• 13C filtrované 13C editované NOESY
Studium dynamického chování molekul● molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách
– různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují
● funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě
– regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace
● vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů – možnost
charakterizace
časové škály pohybů
– různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních
pohybů
ps ns μs ms s > s
relaxaceR1, R2, het. NOE
relaxaceR1ρ, CPMG
analýza tvaru signálu
saturation transfer, NOESY
výměna H/D
pohyb N–Hrotace CH3
pohyb smyček
pohybdomén
transport,katalýza, další biologické děje...příklady
jevů
metodystudia
lokální pohyby globální pohyby
Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze
Analýza směsí a kvantitativní NMR● NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích
jednotlivých atomových skupin
– navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin
● NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek
● integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit
– u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině
– u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek
• Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně
počet bodů
d1
90y
akvizice
d1
90y
akvizice13C
ozařování dekapling1H
Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qNMR)
● úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d1 = 5–10x T1)
● stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů)
● zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce–NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý
● dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů)
● dostatečný poměr signál/šum
● konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)
k konstanta přístroje
c koncentrace vzorku (měřených jader)B90 délka π/2-pulsu
T teplota
integrální intenzita NMR signálu, S
● pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí
– hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí
– pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze
● překryv signálů
– dekonvoluce
– integrace celé skupiny signálů
Zpracování a vyhodnocení spekter
Zpracování a vyhodnocení spekter● při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících
k signálu
● koncentrační standardy
– bez přidaného standardu
o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací
o zjištění relativního zastoupení složek
– vnější standard
o zatavená kapilára s referenční látkou
– vnitřní standard
o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem
● lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5–20 mM)
Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek● Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu
● molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb
● translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D
– Stokesova-Einsteinova rovnice
– platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně
– nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem
● vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole
– metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole(PGSE, pulse gradient spin echo)
● aplikace
– rozlišení molekul ve směsi
– oligomerizace molekul (proteiny)
– výpočet translačního difusního koeficientu
k Boltzmannova konstanta
T termodynamická teplotaη visozita rozpouštědla
RH hydrodynamický poloměr molekuly
Spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole, PGSE
90
y
180
y
excitace
kódování molekul podle pozice v ose z dekódování
vývoj, volná difuse akvizice
g
z
1
H
τ τ
B = B0+ g
zz
z
Δ
D
2
úbytek (kódované)
magnetizace v jednotlivých z-
vrstvách vlivem difuse
ztráta koherence
vlivem gradientu magnetického pole v
ose z
koherentní
magnetizace všech spinů
obnovení koherence
aplikací stejného gradientu po spinovém echu
D
1
D
3
D3 > D1 >
D2
intenzita signálů:
měření série spekter za různých intenzit gz
δ δ
1H (ppm)
1.3
4.7
7.9
g
z
Analýza naměřených spekter – metoda DOSY● Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY
– série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu gz
– pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2D spektru na příslušné pozici D
©C
arlo
sC
obas, h
ttp://n
mr-
analy
sis
.blo
gspot.c
om
10−4
10−5
10−6
10−7
10−802468
1H (ppm)
D(c
m2
s−
1)
Inverzní laplaceovatransformace
DOSY – náhradní sladidlo CanderelM
-A
.Dels
uc
(2008) 2
3rd
NM
R V
altic
e
Překryv signálů vede k jejich
špatnému rozlišení podle difusního koeficientu.
K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování.
LC-NMR● propojení kapalinové chromatografie (HPLC, GPC) a NMR spektroskopie
– Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru.
– speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek
– Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo.
– dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku
– měří se 1H spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2D formě
1H
[ppm]ča
s
[min
]
LC-NMR – analýza oleje ze semínek černého rybízu
k. stearová
k. palmitová
k. olejová
k. linolová
k. γ-linolenová
k. α-linolenová
kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5
ml/min
CH3CN–CDCl3 90:10 (v/v); 1–28 min
AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s
Jan S
ýkora
, ÚC
HP, A
V Č
R,
v.v
.i.
Průmyslové aplikace – obsah vody/oleje – NMR relaxometrie● Využívá výrazně odlišné doby
relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi
● Není potřeba vysoké rozlišení – stačí levný spektrometr s trvalým magnetem
● Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15%
● Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá)
● emulze „olej ve vodě“
– Relaxační čas T2 volného oleje je mnohem kratší než T2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG),
– Po odečtení převažující dlouhorelaxujícíkomponenty (H2O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor.
Relaxometr fi. Bruker
Průmyslové aplikace – kvalita džusu● současné sledování mnoha ukazatelů
● identifikace a kvantifikace
– cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa…)– kyselin (citronová, jablečná…)
– indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná)
– způsobu zpracování
§ phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-D-glukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů
● ověření země původu
– viz SNIF-NMR
http://www.bruker-biospin.com
x
y
z
NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy
● Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)
● Hlavní využití:
– Průkaz zakázané látky
§ Návykové látky
§ Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí)
§ Problém „legálních drog“ (látky účinné, ale dosud nezakázané)
– Průkaz falšování potravin
§ Ověření původu
§ Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky
Průkaz zakázaných látek● Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí
metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)
● Prokázání přítomnosti látky
● Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl
§Použití při vyšetřování původu látky
● Klasické experimenty 1H, 13C, vícerozměrné experimenty, posunová činidla
● Knihovny spekter známých látek
Fencyklidin
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR
● sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly
● Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/H vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování H2O a HDO.
● SNIF-NMR: určení poměru D/H
● odchylka isotopů (isotope deviation), δ
● alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení 13C/12C)
● použití: ověření pravosti a původu potravin
V.SMOW = Vienna
Standard Mean OceanWater
Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. Havelec z Celní laboratoře MF ČR.
Distribuce isotopů 13C a 2H v přírodě
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR● Metoda schválena pro (H/D):
– Ovocné šťávy
§ Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol
§ Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin
– Víno
– Vanilin
– Kyselina octová
• V kombinaci s 13C/12C je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování tequilly)
• Měření 2D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu
• Při zjišťování zastoupení 13C/12C integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru
• Alternativa – MS spektroskopie (hlavně 13C/12C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR
• Příklad 2D spektra ethanolu
• Při zjišťování zastoupení 13C/12C integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru
