Spektrální metody NMR I

opakování

Využití NMR• určování chemické struktury – přírodní látky, organická syntéza

konstituce, konformace, konfiguraceověření čistoty

• studium dynamických procesůreakční kinetikachemické a strukturní rovnováhy

• určení prostorové strukturypeptidy a proteinyoligonukleotidy a DNA, RNAkomplexypolysacharidy

• navrhování léčiv – drug designStructure-Activity-Relationship

• fyzika – struktura materiálů

• lékařstvízobrazování měkkých tkání – anatomie, patologiefunkční zobrazováníin vivo spektroskopie

• potravinářstvíquality control – spektroskopie, zobrazovánífalšované potraviny (alkohol, džusy, med,...)

• metabolomika

Vlastnosti jader

Jádro hmotnost

magnetický moment

náboj

nukleonové (hmotové) číslo

protonové (atomové) číslo

spin

sudé

sudé

sudé

liché

liché

nulový 0

celočíselný 1, 2, 3, ...

poločíselný 1/2, 3/2, 5/2, ...

I = 0I = 1/2

I = 5/2

I = 3/2I = 3

I = 1

I = 1

Jaderný spin a magnetický moment

jaderný moment hybnosti

magnetický moment

průmět do libovolné osy je kvantován

magnetické kvantové číslo

Energie magnetického momentu v magnetickém poli

I = 1/2

m = -1/2

m = +1/2

I = 1

m = -1

m = -1

m = 0E E

Jádro v magnetickém poli

magnetický moment spin (moment hybnosti)

Klasický popis

B0 Larmorova precese

smysl otá čení

Jádra v magnetickém poliSoubor neinteragujících jader

Magnetizace = součet magnetických momentů

B0B0 = 0

Boltzmanovo rozdělení

velikost magnetizace úm ěrná rozdílu obsazenosti hladin

Energie a obsazení hladin

Boltzmanovo rozdělení

NMR je principiáln ě málo citlivá metoda

Magnetizace

- makroskopická veličina

úměrná rozdílu obsazenosti

hladin,

udává intenzitu NMR

signálu

Pulsní NMR

90°

excitace detekce

Základní experiment

NMR spektrumsignál volné precese - FID

Fourierovatransformace

Larmorova precese

rezonanční podmínka

radiofrekvenční puls

0BRF γγγγωωωω ====

B1

B0

frekvence ovlivn ěnalokálním magnetickým polem

NMR frekvence

0 100 200 300 400 500 600

1H13C 31P15N 19F2H

Chemický posun

14.1 T

Chemický posun

Stínění jádra elektrony

lokální magnetické pole

Pozměněná rezonanční podmínka

„holé“ jádro jádro v molekule

E

rezonan čnífrekvence

ppm

parts per milion

high δlow field

downfield

paramagnetic shift

deshielding

low δhigh field

upfield

diamagnetic shift

shielding

stínění elektrony

ppm, frekvence

NMR spektrum

1H chemické posuny

http://www.chemistry.ccsu.edu/glagovich/teaching/316/index.html

Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ

13C chemické posuny

Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ

Chemický posun a elektronegativita

Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ

vyšší elektronegativita = vyšší chem. posun (deshielding)

2510-21-2.413C [ppm]

4.253.052.702.160.41H [ppm]

4.03.02.82.52.1Elektronegativita

CH3FCH3ClCH3BrCH3ICH4

pozor na efekt t ěžkého atomu

Chemický posun a rezonan ční efekt

Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ

7.28, 128.5

OCH3

EDG, +M efekt

160 zvýšená e- hustotav ortho a para pozicích6.88, 114

7.26, 129

6.92, 121

upfield shift

HH

H H

HH

H

O

CH3

6.115.29 6.52 HH

H O

CH3

3.74 3.93

EWG EDG

elektron-akceptorní elektron-donorní

121

131 84

Chemický posun a anizotropní efekt

+ +

_

nesymetrické rozložení elektron ů stínící efekt není všude stejný

+ vyšší δ- nižší δ

+-

-CC+ +

-

-CC+

-+

+- CC

kruhový proud v aromatickém systému

Chemický posun a vliv okolních substituent ů

predikce dle empirických vztahů

(Shooleryho pravidla a pod.)

experiment (ppm)

základ pro CH2

J vazbaNepřímá spin-spinová interakce scalar coupling

interakce zprost ředkovaná vazebnými elektrony

jádro „cítí“ spinový stav okolních jader

I S

ννννS

ννννS ννννI

ννννI

ννννIννννS ννννIννννS

ννννS+J/2

ννννS-J/2

ννννI+J/2

ννννI-J/2I S

EJ = h J mI mS

příspěvekk energii

J J

m = -1/2

m = +1/2

dublet triplet kvartet

1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1

J vazba v 1H spektrechsignály jsou štěpeny vodíky, které jsou „různé“

O

OH

H

H

H

H

H

H

H

1.05.0 2.04.0 3.0

„stejné“ vodíky se navzájem neštěpí

Štěpení jedním vodíkem dvěma vodíky třemi vodíky

J vazba a systém št ěpeníŠtěpení n ekvivalentními vodíky

1 singlet s

1 1 dublet d

1 2 1 triplet t

1 3 3 1 kvartet q

1 4 6 4 1 pentet p

n

1

2

3

4

Pascalův trojúhelník

J1 = J2 J1 > J2 J1 >> J2

J1 J1

J2

t dd dd

J vazba - dosah

C

H

H

X

Y

C C

H

H

R

R

2JHHGeminální

5 – 20 Hz 0 – 2 Hz

CR

H

C

R

H

RR

3JHHVicinální

6 – 8 Hz

bez konforma čnípreference

H

H

R

R

H

R

H

R14 – 18 Hz 7 – 12 Hz

trans cis

„long range“přes více vazeb

Karplusova k řivka

závislost 3JHH na dihedrálním úhlu

Analýza št ěpení

Určete strukturu a konformaci,zapište spektrum

C4H7Cl

CH3 CH2 Cl

H H

1.58 (d, J=7.5Hz, 3H)4.00 (d, J=8.5Hz, 2H)5.45 (dq, J=10.1, 7.5Hz, 1H)6.29 (dt, J=10.1, 8.5Hz, 1H)

Řád spektra

∆ν∆ν∆ν∆ν >> J

∆ν∆ν∆ν∆ν = 0 A2

AA’

AB

AX spektrum 1. řádu

spektrum vyššího řádu

„pseudo-první řád“

stříškový efekt

I OH

O rozdíl chem. posuvů 0.11 ppm

J vazba 7 Hz

-40 -20 0 20 40

-40 -20 0 20 40

-40 -20 0 20 40

-40 -20 0 20 40

-40 -20 0 20 40 60

30 MHz

60 MHz

120 MHz

300 MHz

600 MHz

J vazba – velikost štěpení nezávisí na B0

rozdíl chemických posunů roste s B0

Vliv magnetického pole

J interakce s jinými jádry

R F

H

H

HF

2JHF = 44-81 Hz

3JHF = 3-25 Hz

4JHF = 0-4 Hz

3JHF = 6-10 Hz

4JHF = 5-6 Hz

5JHF ≈ 2 Hz

orto

meta

para

3JPH

1JPH

2JPH

CHCl3 1H

208 Hz

1H-19F

1H-31P 1H-13C

Spinový systém

úplná množina NMR aktivních jader, ve které jsou členové provázáni J-interakcemi

CH3

CH2O

CH2CH2

CH3

CH3 NHCH NH

CH3

O

O

H2C

Chemická ekvivalence

Jádra jsou chemicky ekvivalentní, pokud existuje operace symetrie,

která je na sebe převádí

CH3 vodíky jsou ekvivalentní díky rychlé rotaci

Chemicky ekvivalentní jádra mají stejný chemický posun

HD

Ph Ph

HH

Ph Ph

DH

Ph Ph

vodíky jsou homotopické

HD

Ph CH3

HH

Ph CH3

DH

Ph CH3

vodíky jsou enantiotopické

jsou chemicky ekvivalentní

∗∗∗∗ ∗∗∗∗

HH

Ph

NH2

O

OHH

HD

Ph

NH2

O

OHH

DH

Ph

NH2

O

OHH

vodíky jsou diastereotopické

nejsou chemicky ekvivalentní

∗∗∗∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗ ∗∗∗∗

∗∗∗∗

Chemická ekvivalence

různé chemické posuny

Magnetická ekvivalenceJádra jsou magneticky ekvivalentní, pokud

jsou chemicky ekvivalentní

mají stejné geometrické postavení k ostatním NMR aktivním jádrům(mají s nimi stejnou J vazbu)

a zároveň

Cl Cl

CH3

H

H

H

mezi magneticky ekvivalentními jádry se ve spektru neprojevuje

J vazba

H H

CH3

H

Cl

H

spektra chemicky ekvivalentních a magneticky neekvivalentních jader nelze

analyzovat dle pravidel 1. řádu

Informace v 1H spektrech

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

4.10

1.20

CH3 O CH3

O

• Počet signálů

• Chemický posun

• Intenzita signálů

• Systém štěpení

150 100 50

21.61

61.2568.79

173.07

O OCH3

CH3OH

13C spektrum a dekapling

• Počet signálů

• Chemický posun

90°

excitace detekce

CW nebo WALTZ161H:

13C:

saturace

nukleární Overhauser ův efekt

rychlé p řeskoky

efektivn ě nulový spin

NE kvantitativní kvůli NOE a obvykle nedostatečné relaxaci kvartérních uhlíků

Multiplicita uhlíkových signál ů= rozlišení uhlíků podle úpočtu navázaných vodíků

Spektrum bez 1H dekaplingu(nebo off-resonance)

APT experiment

DEPT experiment

C, CH2

CH, CH3

CH2

CH, CH3

O OCH3

CH3OH

!!!

NMR spektrometr

supravodivý magnet

konzole s rf elektronikou

řídící počítač

NMR spektrometr – schema

RFsyntetizátor

programátorpulsní sekvence

ADC

brána zesilovač

duplexer

přijímač/mixer

počítač

sonda

zesilovač

(komplexní FID)

kvadraturnídetekce

rozlišení znaménkaprecese

Digitální detekce a spektrumNyquistovo kritérium

Počet bodů

Spektrální rozlišení

spektrální šířka

Akviziční dobaoffset pulsu

spektrální šířka

absorp ční signál

reálná část imaginární část

disperzní signálLorentzova křivka

Fázová korekce – optimalizace tvaru spektra do absorpčního signálu

NMR vzorekRozpoušt ědlo - deuterované Standardy chemického posunu – TMS, DSS

Stabilita a homogenita magnetického poleField-frequency lock Shim

stabilita v čase homogenita přes vzoreksledování

„nezávislého“ jádra

- deuterium

Koherentní st ředování

NMR relaxace

obnovení z-ové složky vymizení x,y složek

změna energie ztráta koherence

prodleva mezi m ěřeními šířka čáry

T1 T2podélná (spin-mřížková) příčná (spin-spinová)

B0 B0

Příčina - interakce s okolímfluktuující lokální magnetické pole

přímá dipól-dipólová interakceanizotropie chemického stín ění

přeskoky mezi E hladinami různé Larmorovy frekvence

Bloc = B + B

inversion recovery: 180-t-90-acq spinové echo: 90-t/2-180-t/2-acq

T1 T2≥

Interpretace NMR relaxací

fluktuující lokální

magnetické pole

a relaxace

přímá dipól-dipólová interakceanizotropie chemického stín ění

pohyb molekul

nebo jejich částí+ =

rychlémalé

vysoké

pohybymolekulyteploty

pomalévelkénízké

C

H

„model-free“ analýza

globální pohyb[ns]

lokální pohyb[ps]

(Lipari-Szabó)

Dynamické procesy

Chemická reakce – sledování in situ, změny spektra v čase jak reakce probíhá

Chemická vým ěna

jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky

• chemický posun• J vazba• relaxa ční čas• transla ční difuze

+k1

k-1

k1

k-1

Keq Kassoc

Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna

Transla ční difuze

pomocí NMR lze stanovit difuzní koeficient a tak i „efektivní“ velikost molekul

experiment DOSY – rozdělení spekter směsi podle velikosti molekul

Chemická vým ěna

dimethylformamide

2

νπ ∆=k

ν∆k

pomalá

rychlá

koalescence

vážený průměrchemických posunů

• analýza tvaru spektra

• titrační experiment

2D NMR spektroskopie

příprava

vývoj

směšování

2Ddetekce

2D FT

contour plot

homonukleární

heteronukleární

COSY, NOESY

HSQC, HMQC, HMBC

Korelace

po chemických vazbách

přes prostor

COSY, HSQC, HMQC, HMBC

NOESY

2D NMR spektroskopieCOSY

HSQC a HMQC

HMBC

NOESY

homonukleární 1H-1H korelace přes obvykle 3 chem. vazby

korelační pík se objeví pokud existuje J-interakce mezi danými vodíky

přiřazení vodíkových signálů

heteronukleární 1H-13C korelace přes jednu chem. vazbu

založeno na 1JCH okolo 140 Hz

přiřazení uhlíků nesoucích vodík

heteronukleární 1H-13C korelace přes 2 a více vazeb

založeno na 2,3JCH okolo 8 Hz

přiřazení kvartetních uhlíků, spojení fragmentů

homonukleární 1H-1H korelace přes prostor

korelační pík pro vodíky vzdálené do 5 Å

založeno na přímé dipól-dipólové interakci – NOE

určení prostorové struktury

Řešení NMR spektra

Postup

• identifikovat signály, jejich počet, pozici a intenzitu

• rozdělit vodíky do skupin

• analyzovat jemné štěpení, identifikovat jaké skupiny budou vedle sebe

• dokončit identifikaci funkčních skupin s přihlédnutím k chem. posunům

a dalším informacím (13C spektrum, APT/DEPT)

• spojit funkční skupiny do molekuly

• znovu ověřit, zda molekula odpovídá spektru

C3H6O2

1 23

triplet(štěpení od 2 vodík ů)

kvartet dublet ů(štěpení od 3 vodík ů + 1 další)

J vazba= sousední skupiny

kvartet(3 navázané vodíky)

triplet(2 navázané vodíky)

dublet(1 navázaný vodík)

posun typický pro karboxyl

(zřejmě NE aldehyd, ten bývá okolo 190ppm)

CH

CH2

CH3

CH3CH2

zřejmě CH

zřejmě J vazba

posun typický pro vodík vedle kyslíku

typický posunmethylu

posun typickýpro uhlík

s kyslíkem

H-C=OO

O

O

CH3 O O

H

malé Jpřes 4 vazby

Písemná zkouška

2x řešení spektra 2 x 15 bodů

4 otázky 4 x 5 bodů

Celkem 50 bodů

analýza integrace 1 bod

analýza štěpení 5 bodů

identifikace funkčních skupin 5 bodů

konečné řešení a jeho vysvětlení 4 body

Celkem 15

1 43 – 50

2 37 – 42.9

3 30 – 36.9

X < 30

Celkové hodnoceníHodnocení spekter