Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti

LC-NMR 1

Jan Sýkora

LC/NMR

Jan Sýkora (ÚCHP AV ČR)

Dimethylcyklosiloxany(D3,D4,D5)

C18, 100% ACN, Vinj = 20ul, at = 1s, nt = 4, d1 = 0s, pad = 1s

On-flow Stop-flow

mez detekce 1 mg/ml 0.01 mg/ml

nástřik 20 µl 20 µg0,1 µmol

200 ng0.001 µmol

průtok* 0,5 ml/min -

NMR parametry

at = 1snt = 4

rel = 0 s

at =2 snt = 4 - 1000

rel = 1 s

pseudo 2D NMR spektrum „On-flow“ módu a jeho vrstevnicová projekce

1H NMR (500 MHz)

mez detekce ~ 1 mg/ml(5 µmol látky)

NMR parametrydoba měření (at) ~ 2 spočet skenů (nt) ~ 4 - 1000 relaxační prodleva (rel) ~ 1 s

LC - NMR

LC – MS

mez detekce ~ ng - pg

nástřik 1-2 µl

průtok 0,4 - 1 ml/min*

*solventy bez jakýchkoli organických látek

*solventy bez anorganických solí

NMR spektroskopie je založena na měření frekvencí jader atomů. Nejlépe se měří jádra se spinem ½, ty poskytují ve spektru jednu linii(1H-99,9 %, 13C-1 %, 29Si-4 % atd.). Frekvence jádra každého atomu závisí na jeho chemickém okolí a odráží především to, jak je jádro „stíněno“ elektrony ve svém okolí. Frekvence je vztažena k frekvenci standardu a podělena frekvencí spektrometru. Uvádí se jako chemický posun v jednotkách ppm. Případná interakce s okolními jádry se projevuje štěpením signálu na multiplet.

převzato z Bruker Almanach

Cyclohexanefor GC residual analysis (Scharlau)at = 1sd1= 1snt = 64

Acetonitrile for UV Spectroscopy (Fluka)at = 1sd1= 1snt = 4

Methanol CHROMASOLV®

(Sigma-Aldrich)at = 1sd1= 1snt = 32

AcetoneHPLC grade(Sigma-Aldrich)at = 1sd1= 1snt = 4

Stabilizátory & Nečistoty v rozpouštědlech

Analýza extraktu kopřivy dvoudomé80% HPLC Acetonitrilu v CDCl3

*

sitosterol

HPLC rozpouštědla s chemicky i magneticky ekvivalentními vodíkovými atomy poskytují v 1H NMR spektru pouze 1 signál.1 signál rozpouštědla je pro LC-NMR nejvýhodnější, blokuje pouze úzkou část NMR spektra. Rozpouštědla nemusí býtnutně deuterovaná jako u klasického NMR. Důležitáje čistota, jakékoli další látky obsahující vodíkovéatomy blokují další oblasti a znemožňují detekciv danéčásti spektra.

Z hlediska čistoty jsou v současné doběk dispozici pouze tři rozpouštědla v čistotě vhodné pro LC-NMR...

D2O (99,9% D) ~ 10.000,- Kč / lCDCl3 (99,5% D) ~ 3.000,- Kč / lCH3CN ~ 3.000,- Kč / l

tabulka převzata z katalogu firmy Phenomenex

Potlačení signálu rozpouštědlaSignály rozpouštědel jsme v

současné době schopni efektivně potlačovat.

Poloautomatický software je schopen potlačit až 7 signálů.

Po potlačení dále následuje digitální filtrace dané

frekvence. Citlivost se tak posunuje až o několik řádů.

Většina signálůměřených látek je dokonce méně intenzivní nežjsou signály uhlíkových satelitů

obklopujících signál rozpoutědla (0.5% celkového

signálu, dáno 1% výskytem izotopu 13C), proto je často

nutné zapojit dodatečný decoupling těchto signálů. V

normálních 1H NMR spektrech tyto signály většinou kvůli

vysoké koncentraci měřenélátky často nevidíme nebo

nevnímáme.

V případě gradientové eluce je třeba nastavit potlačení signálů

rozpouštědel před každou akumulací 4 skenů. Jak se mění

poměry rozpouštědel, mění se v mnoha případech i poloha

jejich signálů. Každé spektrum potom pořídíme během 15-ti sekund. U isokratické eluce

stačí nastavit potlačení jednou na začátku měření. Spektra pak

snímáme každých 5 sekund.

H2O - THF

chininMw=324.4 1.5 umol … 0.5 mg

Stop-flow experiment

SpinasterolC29H48O1

c = 6 mg/mlNástřik 0,1 mg

(20 ul)

nt = 128t ~ 7 minut

nt = 16ni = 256

t ~ 1,5hod.

nt = 200ni = 128

t ~ 15hod.

COSY

HSQC

nt = 1000t ~ 1 h.

Peak 1

Peak 2

Peak 3

COSY ~ 24 h. HSQC ~ ∞∞∞∞

ClNH

MeMe

Me

MeCl

ClNH

MeMe

Me

Sibutramine hydrochlorideSibutramine desmethyle

Sibutramine hydrochloride in CDCl3

Sibutramine in CDCl3

Sibutramine desmethyle in D2O-CH3CN

Sibutramine desmethyle hydrochloride in D2O-CH3CN

7 6 5 4 3 2 ppm1

Impurity in Sibutramine sampleStop-flow mode, nt = 1000

-NCH3

Největší uplatnění nachází LC-NMR ve výzkumu farmaceutických firem.Nejčastěji se využívá k identifikaci nečistot doprovázejících aktivní látku.

Určení nečistoty v generiku známého anorektika:Výsledky měření LC-MS naznačovaly, že nečistota bude pravděpodobnědesmethylovaná. Na HPLC se však desmethyl sibutramin eluuje jasněprvní, jak se ukázalo na vzorku standardu. Pomocí LC-NMR bylo změřenoprotonové spektrum nečistoty. Vzorek byl bohužel příliš zředěný, takžebyla část signálů překryta a špatný poměr signálu k šumu znemožňovalintegraci a měření 2D spekter (korelace vodíku s uhlíkem). Jedná se nic-méně o autentické NMR spektrum látky při dané separaci s charakteristi-ckým posunem –NCH3 skupiny. Po dodání standardu sibutramine desmethylu bylo naměřeno identické spektrum během simulace podmínekseparace (poměry rozpouštedel a koncentrace pufru) po přidání HCl.Sibutramin desmethyl byl tedy ve vzorku přítomen jako hydrochlorid..

LC-NMR farmak

GPC-NMR

start 12 min

100% CDCl3inj. 50 µl

Extrakce superkritickým CO2Extrakce superkritickým CO2 je velmi účinný zdroj nepolárních přírodních látek z různých částí rostlin. Extrakty neobsahují žádná rozpouštědla ani další příměsi. CO2 se uvolňuje při závěrečné expanzi na výstupu z extraktoru. Obsah přítomných látek se stanovuje pomocí HPLC nebo GC-MS.Identifikace závisí na počtu standardů a rozsahu knihovny MS spekter. Pro identifikaci neurčených látek (obsah kolem 5%)nastupuje LC-NMR.Příklad dominantní látky v extraktu routy vonné(obsah kolem 20%, m/z= 356). Pro předseparaci byla použita gelová kolona 100% CDCl3 (separace se dá provádět v libovolném rozpouštědle). Z 1H NMR a 2D NMR spektrer se podařilo poskládat hlavní fragmenty molekuly. Tyto fragmenty v kombinaci s kumarinovým skeletem a znalostí celkové hmoty poskytly strukturu rutamarinu; hlavní složky routy vonné(ruta graveolens) s terapeutickými účinky podobnými papaverinu.

5 x CH3 skupin

1,2 3

4 5

6

7,8

9

4 5 6

CHCl3

7,81,2,9

rutamarin

3