Osnova

biologické axiomy

organisace buněčného metabolismu,

experimentální přístupy ke studiu klíčových reakcí,

turn-over proteinů,

ultracytochemie mikroorganismů,

Biologické axiomy Život na Zemi nebyl vždy, ale vznikl z neživých organických látek.

Současné formy života vznikly evolucí z jediného společného prapředka.

Vývoj probíhal přirozeným výběrem z variet celé populace, kdy variabilita vznikala náhodnými změnami v genomu jedince (mutacemi) nebo rekombinacemi genetického materiálu dvou jedinců.

Obecným trendem evoluce je strukturální komplexita, růst obsahu a organizace informace systému.

Všechny současné organismy mají základní biochemické procesy stejné. U všech je nositelem programu činnosti nukleová kyselina, nástrojem činnosti bílkovina.

Všechny organismy se skládají z buněk.

Identita biologického druhu je dána specifitou nukleových kyselin a bílkovin.

Živá hmota je konstruovanána principu maximální

molekulární úspornosti.

Organismy vytvářejí a udržují vysoký stupeň organizovanosti v málo

organizovaném prostředí na úkor tohoto prostředí, jehož stupeň

uspořádanosti se tím zmenšuje.

Živá hmota je isothermální chemický stroj. Energie přijatá z prostředí je

přeměněna na energii chemické sloučeniny, a ta je použita k práci

chemické, mechanické (pohyb), osmotické, při čemž teplota je v celé

buňce (organismu) konstatntní.

Katalyzátory, které katalyzují reakce probíhající v živé hmotě jsou bílkovinné

makromolekuly – enzymy. Od běžných katalyzátorů chemických reakcí

se liší a během reakcí nevznikají vedlejší reakční produkty.

Jeden enzym je kódován jedním genem.

Životní procesy se realizují interakcemi molekul.

Specifita molekulárních interakcí je výsledkem vzájemné strukturní

komplementarity zúčastněných molekul.

V buňce v tomtéž okamžiku probíhají tisíce chemických reakcí

vycházejících z různých látek a vedoucích k různým produktům.

• Řád v nich je dán – specifitou katalyzátorů

- uspořádáním reakcí do sekvencí

- účinností regulačních mechanismů

V daném okamžiku a v daném prostředí je

aktivní jen část celé genetické informace ,

jenž je určena samotným genetickým

programem a okolnostmi vnějšího prostředí.

Jedná se o regulaci genové exprese.

Jak regulace probíhá?

Genetická informace je jednorozměrná, živá

buňka je trojrozměrná včetně jejích komponent,

které vznikají v důsledku překladu struktury DNA

do struktury bílkovin.

Fyzikální vlastnosti bílkovin a NK mohou být

dostatečnou podmínkou pro jejich uspořádání ve

funkční supramolekulární komplexy. Uspořádání

se uskutečňuje na principu komplementarity a

slabými vazebnými interakcemi.

.

Cytoplasma není neuspořádaný vysoce koncentrovaný

roztok enzymů.

• Jednotlivé oblasti buňky jsou vysoce organizované v určité struktury, které jsou

stabilizovány interakcemi molekul bílkovin.

• Koncentrace intracelulárních bílkovin in vivo je mnohem vyšší než jejich koncentrace in vitro, např. v případě jejich studia.

• Síly jimiž jsou proteiny vázány in vivo do organizovaných intracelulárních struktur, po

izolaci bílkovin z buňky mizí.

Pro organizaci enzymů účastnících se následných reakcí do

určitých struktur byl navržen termín „metabolon“ může

obsahovat volně nebo přechodně vázané globulární

bílkoviny.

• Výhodou takovéhoto uspořádání je snadný průběh dějů

metabolické dráhy přechodem intermediátů mezi sousedními

enzymy bez zbytečné difuse do okolí.

• Celý proces „channeling“ má pro buňku několik výhod:

- chrání nestabilní metabolity udržováním ve stavu vázaném na

bílkoviny

- umožńuje udržovat koncentrační gradient

- udržuje ředící kapacitu vody přítomné v buňce

- kinetické výhody

- rychlé přizpůsobení buňky podmínkám prostředí

Bílkoviny a NK a další složky buněk mají velice často

kratší dobu života než sama buňka

• Uspořádání struktur, ale i funkční místa bílkovin

jsou dána evolucí.

• Molární koncentrace některých enzymů

(glykolytických) jsou velmi vysoké a mnohem

vyšší než interacelulární koncentrace substrátů.

Tato skutečnost je umožněna přímým

předáváním intermediátů mezi jednotlivými

enzymy. Vytvářené koncentrační gradienty

mohou v takovém uspořádání existovat i bez

účasti membránových struktur.

Pro organizaci enzymů účastnících se následných reakcí do

určitých struktur byl navržen termín „metabolon“ může

obsahovat volně nebo přechodně vázané globulární

bílkoviny.

• Výhodou takovéhoto uspořádání je snadný průběh dějů

metabolické dráhy přechodem intermediátů mezi sousedními

enzymy bez zbytečné difuse do okolí.

• Celý proces „channeling“ má pro buňku několik výhod:

- chrání nestabilní metabolity udržováním ve stavu vázaném na

bílkoviny

- umožńuje udržovat koncentrační gradient

- udržuje ředící kapacitu vody přítomné v buňce

- kinetické výhody

- rychlé přizpůsobení buňky podmínkám prostředí

Marjory Stephenson

• 1885 – 1948

• Vedoucí osobnost studia biochemie mikroorga-

nismů, jmenovitě organizace a řízení biochemic-

kých procesů v buňkách, byla zakládající

osobností při tvorbě chemické mikrobiologie a

biochemie mikroorganismů, jedna z předchůdců

molekulární biologie.

• „Holding Hands with Bacteria“ Springer,

• Autor Soňa Štrbáňová

Bioenergetika Energie a enzymy První a druhý zákon termodynamiky v

biologických systémech

Tvorba energie Katabolismus, anabolismus a ATP

Energie biosyntéz Konstrukce komplexnějších molekul a

struktur z menších, jednoduchých

prekursorů

První zákon termodynamiky • Energii nelze ani vytvořit ani zničit

dU = dQ - dW

• Celková energie vesmíru zůstává konstantní

• Energie lze přerozdělit buď uvnitř souboru látek

(matter) označovaných jako systém, nebo mezi

systémem a jeho okolím.

• První termodynamický zákon je zákonem

kvantitativním, který říká, že všechny druhy energie

jsou kvantitativně ekvivalentní (rovnocenné) a

vzájemně je lze transformovat.

Druhý zákon termodynamiky • Fyzikální a chemické procesy probíhají takovým

způsobem, který vede ke zvýšení maximálního možného chaosu vesmíru

• Druhý termodynamický zákon je kvalitativní, uvádí jak probíhají tepelné děje v případě, že je tepelnou energii možno přeměňovat s určitým omezením. Je empirický a pravděpodobnostní.

Entropie dS = dQ/T 0

dQ je dodané teplo

T - teplota. Je zřejmé, že změna entropie systému při konstantní hodnotě tepla je větší při nižší teplotě.

• Pro reversibilní procesy a rovnovážné stavy platí, že změna entropie je nulová dS = 0.

Pro spontánní proces v systému pak platí dS > 0. Můžeme říci, že entropie se nikdy samovolně nezmenšuje.

Energie v mikrobiální buňce

1. Buňky musí účinně přenášet

energii ze svých energii

zachycujících systémů do

systémů, které aktuálně

vykonávají práci

2. Buňky musí také užívat

různé metabolické procesy k

nahrazení energie užité pro

práci

3. Měnovou jednotkou energie

je ATP adenosin 5-trifosfát

Energetický náboj (energy charge)

EC= (ATP+0,5 ADP )/(ATP+ADP+AMP)

Klebsiella aerogenes v chemostatu

(mol/g suché hmoty)

ATP ADP AMP EC

Aerobic 6,5 2,2 1,4 0,75

Anaerobic 3,7 3,9 1,1 0,65

Typy buněčné práce mikroorganismů

1.Chemická práce – syntéza komplexních

molekul

2.Transportní práce – příjem živin, exkrece

odpadů, iontová rovnováha

3. Mechanická práce – vnitřní a vnější

pohyby

4.Elektrická práce – přenos signálů, pH

kontrola

Metabolism as Energy Game

Generation of Energy

Overview of the reactions of cellular synthesis

and biodegradation

Zisk ATP při glykolyse

1. Výtěžek ATP glykolysy a aerobní

respirace je závislý na typu organismu,

ale má teoretické maximum 38 mol

ATP na molekulu katabolizovné

glukosy.

2. Anaerobní organismy využívající

glykolysu mohou tvořit pouze dvě

molekuly ATP z molekuly

katabolizované glukosy.

Anaerobní respirace

A. Užívá jiné anorganické molekuly než je

kyslík jako terminální akceptor

elektronů, tak vzniká dodatečný ATP pro

buňku, ale nikdy v takovém množství,

jaké vzniká při aerobní respiraci.

B. Nejčastějšími akceptory elektronů jsou

nitráty, nitrity, sulfáty, a CO2 ale také

některé kovy mohou být redukovány.

Základní metabolické dráhy jsou univerzální

• Nápadným znakem metabolismu mikroorganismů je podobnost základních metabolických drah u velmi vzdálených druhů.

• Na př. soubor karboxylových kyselin, kterými jsou intermediáty cyklu kyseliny citronové je přítomen ve všech organismech tak odlišných jako je jednobuněčná bakteria Escherichia coli a ohromný mnohobuněčný organismus jako je slon.

• Tyto nápadné podobnosti v metabolismu jsou pravděpodobně výsledek vysoké účinnosti těchto drah a jejich brzkého objevení v evoluci.

Dělení bakterií z hlediska metabolismu

Podle nároků na výživu dělíme bakterie :

1) Autotrofní - zdrojem C jsou anorganické látky (zdroj uhlíku

CO2, zdroj dusíku N2, NH4+, NO3

- )

2) Heterotrofní - zdrojem C jsou organické látky, a to :

a) prototrofní (jednoduché org.látky - ethanol, sacharidy a p.)

b) auxotrofní (vyžadují složité org.látky - např. vitaminy)

Podle nároků na kyslík dělíme bakterie :

1) Aerobní - vyžadují vzdušný kyslík (mají aerobní metabolismus)

2) Anaerobní - vzdušný kyslík působí inhibičně (mají anaerobní

metabolismus)

3) Fakultativně anaerobní – jsou vybaveny pro oba typy

4) Mikroaerofilní – vyžadují redukované množství kyslíku a

zvýšený obsah oxidu uhličitého

Energetický metabolismus bakterií

Z hlediska energetického metabolismu rozlišujeme

tři základní typy metabolismu bakterií :

1) chemoorganotrofie- Zdrojem energie je oxidace redukované

organické látky. Tato látka je současně zdrojem uhlíku.

2) chemolithotrofie - Zdrojem energie je oxidace redukova-

né anorganické látky. Zdrojem uhlíku je CO2. Patří sem např.:

a) sirné bakterie - Zdrojem energie je oxidace síry a sirných

sloučenin.

b) nitrifikační bakterie - Zdrojem energie je oxidace dusíku

c) železité bakterie - Zdrojem energie je oxidace železnatých

iontů

d) ostatní chemolithotrofní bakterie

3) fototrofie - Zdrojem energie je světlo a zdrojem uhlíku je CO2

(fotoautotrofie) nebo organická látka (fotoorganotrofie).

chemolithotrofie

• U chemolithotrofů, sloučeniny - donory

elektronů - jsou oxidovány v buňkách, a

elektrony se včleňují do respiračních

řetězců, které končí tvorbou ATP. Akceptorem elektronů je kyslík (u aerobních

bakterií), ale mikroorganismy používají velké

množství dalších akceptorů elektronů, jak

organických tak anorganických,v závislosti na

druhu.

Ukázky bakterií užívajících jednak kyslík nebo siru

jako akceptor elektronů

• Železité bakterie oxidují železnatý iont (Fe2+) na železitý iont (Fe3+)

• Nitrifikační bakterie oxidují amonný iont na nitrit nebo na nitrát.

• Purpurové sirné bakterie a některé chemolithotrofní oxidují sulfidy

na síru. Užívají kyslík jako akceptor elektronů.

• Sirné bakterie užívají oxidované sloučeniny síry k tvorbě sulfidů.

Mohou také užívat celou řadu dalších různě oxidovaných sloučenin

síry (např. sulfáty, thiosulfáty, thionáty, polysulfidy, sulfity). Tady je

akceptor elektronů síra.

• Vodíkové bakterie oxidují vodík na vodu.

• Karboxydotrofní bakterie oxidují oxid uhelnatý na oxid uhličitý.

Bakterie užívající jiný akceptor eletronů než

kyslík

• Methanogeny jsou Archaea schopné oxidace vodíku za použití redukce oxidu uhličitého na methan.

• Thiobacillus denitrificans je jednou z mnoha sirných

bakterií, které oxidují redukované sirné sloučeniny s

použitím nitrátu místo kyslíku.

• Nedávno objevená Anammox oxiduje amonium za

využití nitritu jako akceptoru elektronů a tvoří plynný dusík.

• Fosfitové bakterie PO3 2- oxidují fosfit na fosfát.

Užívají sulfát jako akceptor elektronů, a redukují jej na sulfid.

Typy lithotrofie

• Lithoheterotrofy nemohou fixovat oxid uhličitý a musejí využívat přídavné organické sloučeniny, rozkládat je a používat tento uhlík. Velmi málo bakterií je plně heterolithotrofních.

• Lithoautotrofy jsou schopné používat oxid uhličitý ze vzduchu jako zdroj uhlíku,stejným způsobem jako rostliny.

• Mixotrofy přijímají a utilizují organické látky na doplnění fixace oxidu uhličitého (směs=mix mezi autotrofií a heterotrofií). Mnoho lithotrofů je řazeno jako mixotrofní vzhledem k jejich C-metabolismu.

Transkripce DNA do RNA enzymem RNA-

polymerasou

Buňka uskutečňuje své genetické informace teprve transkripcí a

translací DNA do RNA a pak do bílkovin. Nejprve dojde

k rozvolnění určitého úseku dvojšroubovice DNA, pak jeden

z uvolněného úseku slouží jako matice (templát) pro tvorbu RNA.

RNA-polymerasa

-faktor

místo rozepnutí

dvojšroubovnice DNA

RNA-transkript

místo opětného spojení

RNA polymerasa – objevena v roce 1961

• Katalyzuje vazbu ribonukleosidtrifosfátů

ATP, CTP, GTP, a UTP na templátu DNA

U prokaryot je holoenzym RNA polymerasa složen z

podjednotek – α2 ββ´ω σ .

Zahajuje transkripci vazbou na oblast 40 až 60 párů bazí (bp), která

obsahuje dva konservované promotorové úseky:

-10 sekvence (Pribnow box) se strukturou TATAAT

- 35 sekvence se strukturou TTGACA

Pro iniciaci je zásadní σ faktor.

sigma faktor - σ faktor

• σ faktor je protein nutný pouze pro iniciaci

transkripce . Jedná se bakteriální iniciační

faktoe transkripce, který umožňuje specifickou

vazbu RNA polymerasy na promotor genu. Je

homologní s archaelárním transkripčním

faktorem B a s eukaryotickým TFIIB.

Výběr promotorů RNA polymerasou je závislý

na typu sigma faktoru se kterým je propojena.

struktura podjednotky α2ββ′ holoenzym α2ββ′σ

Typy sigma faktorů

• σ70(RpoD) – σA – "housekeeping" sigma faktor také

označovaný jako primární sigma faktor, přepisuje

většinu genů v rostoucích buňkách.

• σ32 (RpoH) – sigma faktor „heat shocku“, nastupuje

tehdy, když jsou bakterie vystaveny teplu.

• σ38 (RpoS) – sigma faktor při hladovění/stacionární

fáze.

Po iniciaci mění σ podjednotka typ vazby k holoenzymu,

který provádí syntézu RNA ve směru od 5´konce k 3´.

• Získaný RNA transkript u prokaryot nepotřebuje další

úpravy.

• 3 fáze transkripce: iniciace, elongace a terminace.

• DNA se rozplétá od promotoru na dva řetězce, RNA

polymerasa pak používá vlákno označované

„antisense“, nebo také minus (-).

• Vzniklá RNA má tedy stejnou sekvenci jako

netemplátový řetězec „sense“ (+) s vyjímkou obsahu U

místo T.

“Protein turnover” je rovnováha mezi syntézou a

degradací proteinů

• Syntéza převažuje při anabolismu , naopak při katabolických procesech převažuje degradace.

• Degradaci zajišťují proteasy, široké spektrum enzymů.

• Proteasomy- nitrobuněčné proteolytické struktury tvořené „self-assembly“ proteasami a ATPasami. U eukaryot – ubikvitin

• Prokaryotní proteasomy u Archaea - Methanosarcina thermophila, Thermoplasma acidiphilum

• Bakteriální – Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus erythropolis

• Degradace pomocí proteasomů je zásadní pro mnoho buněčných procesů, včetně buněčného cyklu, regulace exprese genů, a odpověď na oxidativní stress.

• Význam proteolytické degradace uvnitř buněk a role ubikvitinu při proteolytických procesech byla zhodnocena roku 2004 Nobel Prize -

• za chemii: Aaron Ciechanover, Avram Hershko a Irwin Rose.

Proteasomy jsou proteinové komplexy u všech eukaryot a

archaebakterií, a také u některých bakterií.

• U eukaryot, jsou lokalizovány v jádře a v cytoplasmě.

• Hlavní funkcí proteasomů je degradace nepotřebných

nebo poškozených proteinů proteolysou a chemickými

rekcemi, které rozbíjejí peptivé vazby.

• Enzymy provádějící tyto reakce jsou označovány jako

proteasy.

• Proteasomy jsou součástí hlavního mechanismu, kterým

buňky regulují koncentraci určitých proteinů a degradují

špatně složené proteiny.

Proteasom

Hlavní metabolické dráhy – E.coli

PRPP – fosforibosylpyro-

fosfát

Hlavní metabolické dráhy – Buchnera sp.

Gama- proteobakterie, 600 genů

Sdílení genů

• ..

Studium metabolismu mikroorganismů

• Celé buňky

• Protoplasty a sféroplasty

• Homogenáty buněk

• Jednotlivé frakce homogenátů

• DNA

• RNA

Sledování kvantity jednotlivých složek media

• Zdroje C – glukosa, další cukry,polysacharidy,

uhlovodíky, org.kyseliny,

Zdroje N – NO3, NH4, aminokyseliny

Zdroj P - fosfáty

Elektronová mikroskopie

• Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)

- viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, které prošly studovaným vzorkem, nebo které ve vzorku difraktovaly.

- proud elektronů prochází tzv. elektronovou čočkou, kterou tvoří el. pole zvláštního kondenzátoru, nebo mag. pole cívky. tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát).

- vrstva preparátu musí být velmi tenká, přibližně 1µm, aby nepohlcovala elektrony.

- pracuje se ve vakuu – neumožňuje pozorovat živé organismy

• Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM)

- rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz

- studování povrchových struktur

Jádro E. coli v elektronovém a

světelném mikroskopu

Staphylococcus aureus

Elektronová mikroskopie → metody přípravy vzorku

• chemická cesta A/ přímá metoda, kdy do mikroskopu vkládáme celý studovaný objekt

zbavený vody

B/ metoda nepřímá, kdy v mikroskopu pozorujeme repliku studovaného objektu, ne samotný objekt.

- fixace - stabilita vzorku

- zalití do pryskyřice

• fyzikální cesta - mrazicí metody

TEM (imerzní kryofixace, sprejová metoda, jet freezing, mražení pomocí kovového zrcadla, mražení při vysokém tlaku)

SEM (Kryofixace, mrazové lámání, mrazové leptání, mrazové sušení)

- mikrovlny

• ostatní - metoda negativního kontrastu (TEM)

- pokovení materiálu (SEM) – zvýšení povrchové vodivosti

Ultratenký řez

Ultratenký řez bakterie

Caryophanon latum G+

PHB- poly-β-hydroxybutyrát

3 μm průměr, 10 - 40 μm délka

Caryophanon latum G+

Pseudomonas putida - transmisní

elektronová mikroskopie poly P a PHA

Bacillus subtilis – lipidové spirály

Mikroskopie atomárních sil

• Mikroskopie atomárních sil (AFM z anglického atomic

force microscopy) je mikroskopická technika, která se

používá k trojrozměrnému zobrazování povrchů. Prvně

ji realizovali v roce 1986 Binnig, Quate a Gerber.

• Obraz povrchu se zde sestavuje postupně, bod po

bodu. Metoda dosahuje velmi vysokého rozlišení.

Techniku AFM lze použít nejen k zobrazování, ale také k

tvorbě struktur či zpracování povrchů v nanometrové

oblasti.

Spory Aspergillus oryzae

Dormantní spora klíčící spora

Konfokální mikroskopie • Konfokální mikroskopii - rozlišení a kontrast vyšší než u ostatních

metod světelné mikroskopie.

• Výhodou je především potlačení signálu z rovin nad a pod rovinou

zaostření a možnost snímání sérií optických řezů, jejichž skládáním

lze rekonstruovat pozorovaný objekt v 2,5D projekci.

Tím jsou dané vysoké nároky na komplexní provoz, tj. technické

vybavení a rychlost PC. Předností a zároveň omezením metody je

využití laseru jako zdroje světla, protože intenzivní osvětlení vzorku

přispívá k rychlejšímu vysvícení použitých fluorochromů nejen v místě

snímání, ale i v místech kudy paprsek prochází k místu zaostření.