FM styrylové sloučeniny/barvičky(fy. Mol.Probes) fluoreskují po

zapojení do membrány.Internalizují se endocyózou.

Optimální je pro rostlinné buňky FM4-64

Cytokinese a endocytóza

GFP či YFP-AtEB1 a CLIP170 značí + konce MTs.GFP či YFP- MAP4 značí celéMTs.

http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pub

medid=15831100

Videa, která stojí za vidění jako Suppl. Data na konci článku.

KAT1 draselný vtokový kanál a změny objemu

svěracích buněk průduchů.

Měření membránové kapacitance

Genom Arabidopsis obsahuje celý komplement genů kódujících a regulujících klatrinové obaly

Various receptors and clathrin protein coats recognize vesicle types, and these are delivered (along cytoskeleton pathways?) to appropriate target sites in the cell.

Other recognition molecules, such as (vesicle) v - snares and (target) t-snares are involved in targeting vesicles with one set of contents to one site, and another set of vesicles to another site.

Fig. 13-6 Clathrin coated vesicles. Deep freeze etching EM of inner surface of plasma membrane of cultured fibroblast cells.

• Aktivovaný receptor (př. receptorovákináza) může stabilizovat vznikající

• „obalené jámy“.

v

Internalizace obsazeného receptoru nemusí být jen krok, vedoucí k

jeho destrukci (a oslabení signalizace), ale v některých

případech signalizace pokračuje v endosomu –signalizační

endosom. (př. signal. brassinosteroidy – BRI1).

Při endocytóze PM velmi pravděpodobně může také docházet k internalizaci (modifikaci a posléze recyklaci) části pektinů a

xyloglukanů buněčné stěny.

Internalizace AGP, které silně interagují s pektiny.

Po přidání BFA (B) jsou téměř všechny xyloglukany internalizoványdo BFA kompartmentu.

U rostlinřada

otazníků!

Endosomy

Odlišný osud obsazených/aktivovaných transferrinovýcha opioidníchreceptorů – z časného endosomu jdou transferrinové rec. přes recyklující endosomzpět do PM, zatímco opioidní rec. putují do lysosomu/vakuoly přes „late“ endosom.

Příklad z živočišné buňky.

Nějak podobně je pravděpodobně regulována lokalizace PIN auxinových přenašečových komplexů. Auxin také blokujeblokujeblokujeblokuje endocytózua tak automaticky zvyšuje výskyt výtokových přenašečů na PMTo je pravděpodobně klíčovou součástí procesu kdy auxin reguluje svůjvlastní transport.

Homolog RabF/Rab5 Ara6 je lokalizován v časném endosomu.

GTPázy-lipidy : zákl. regul. smyčka endomembránového systému

• Lokální specifické domény membránových fosfolipidů jsou klíčovou součástí udržování identity nejen organel, ale také sub- doménna organelách.

• Proto zvl. Arf, ale i Rho a Rab GTPázyregulují některé aktivity - kinázy, fosfolipázy, flipázy! které vytvářejí lokalizované membránové domény.

• PI(4)P (blue) -concentrated on Golgi

• PI(3)P (green) - early endosomes

• PI(4,5)P2 -plasma membrane

• PI(3,5)P2 - multi-vesicular endosomes

Distribution ofphosphatidylinositidesin cells:

Roth 2004

Structures of PI(3)P-binding Modules

Lemmon 2003

Two RabA of pea have different subcellular localization (detail)

toto pozorování ukazuje na různorodost endosomů v jedné buňce.

GTPázy-lipidy : zákl. regul. smyčka endomembránového systému

• Lokální specifické domény membránových fosfolipidů jsou klíčovou součástí udržování identity nejen organel, ale také sub- doménna organelách.

• Proto zvl. Arf, ale i Rho a Rab GTPázyregulují některé aktivity - kinázy, fosfolipázy, flipázy! které vytvářejí lokalizované membránové domény.

• Endosomy se mohou pohybovat také mechanismem aktinové komety. Pohyb je závislý na polymeraci aktinua nezávislý na myosinu.

Důležitým nástrojemstudia sekreční dráhy je brefeldin A

BFA

Obsah BFA kompartmentuodhaluje bílkoviny PM, které

cyklují mezi PM a recyklujícímendosomem.

GDP

GTP

ARF-GEF

Vesicle budding in Golgi is ARF1-dependent;ARF1 undergoes recruitment to Golgi membraneby ARF-GEF-promoted GTP for GDP exchange;ARF1 recruits protein coats (green) needed forvesicle budding; brefeldin A binds at ARF1-GDP/ARF1-GEF interface and inhibits GTP exchange/membrane recruitment of ARF1 and coats; Golgistack is disrupted and protein trafficking through the Golgi is inhibited, ALE I DALŠÍ KOMP.Arf-GEFy p ůsobí na několika „stanicích“ endom. Syst.

Research tool for membrane trafficking: BFA

• NE KAŽDÝ ARF GEF JE CITLIVÝ K BFA!!

BFAonGA

V rostlinných buňkách se po působení BFA objevují min.dva nové kompartmenty(v různých buňkách různě):1. Hybridní cisGA-ER(podobně jako u živočichů).2. Tzv. „BFA„BFA„BFA„BFA----

compartmentcompartmentcompartmentcompartment““““ – transGA-endosom.

Problém interpretace vlivu BFA

1. V buňce je (podle stavu diferenciace) několik GEFů (8x u At) pro několik ARFů(12x u At), různě silně

exprimovaných a různě lokalizovaných.2. Některé ARF-GEFy (u At 3x) nejsou!!!inhibovány BFA.

C, F, I – linieodolná k BFA

Polární transport IAA je závislý na polární lokalizaciPIN auxinových výtokových přenašečů.Jejich lokalizace je závislá na polarizované sekreci a aktinovém cytoskeletu.

Recyklace PIN1je závislá na aktinu

• Recyklace IAA přenašeče PIN2 je závislá na jiném typu endosomu– obsahujícím „sorting nexin 1“, který je citlivý k wortmanninu(inhibitor PI-3-Kin, PI3kin)

•CytokineseCytokineseCytokineseCytokinese a a a a

endocytózaendocytózaendocytózaendocytóza

Uspo řádání MT během bun ěčného cyklu rostlinné bu ňkyUspo řádání MT během bun ěčného cyklu rostlinné bu ňky

Po PPB zbývá „actin depleted zone“ a bílkovina TANGLEDTANGLEDTANGLEDTANGLED.

Před nástupem mitózy se tvoří v místě zaostřujícícho se PPB pás zvýšené

endocytózy.

F až K – EMTs (endplasmic MTs)Dorustají do oblasti předchozího PPB a tak se setkávají s endosomy, které po nich putují v minus-směru.

Inhibitortransportuauxinu NPA(naphthylphtha-lamic acid)narušuje tvorbuPPB a orientacibuněčnépřepážky.(viz. také video)

• Endocytóza je intenzivní v místech kde se endoplasmatické MTs setkávají s PPB.

• Pás endosomů proto leží v těsné blízkosti PPB a je zachován i po rozpadu PPB při tvorbě mitotického vřeténka.

• Kyselina naftylftalamová (NPA) – inhibitor polárního výtoku auxinu - působí anomální PPBsa následně posuny v rovině buněčného dělení.

Dynamiky cytoskeletu a endomembránového systému jsou neoddělitelně recipročně

provázány.

či spíše vakuoly

Protoplast aleuronukukuřice

V1=PSVV2=LV

Topologicky je to extracytoplasmatický

kompartment a také se velmi rychle vyrovnává se změnami

osmotických poměrů v apoplastu.

ESCRT complex

Prevacuol. comp.Multi Vesicular Body

Sort. rec. BP-80

Vakuolární lokalizační signály

NPIR

NPIR

Třídění do lytické vakuoly přes BP-80/ELP receptory.

Prolaminy

Agregace jako třídící mechanismus v ER - PB.Lokalizovaná translace na spec. doménách ER.

Od ER odvozená PB jsou obklopována a pohlcována vakuolami.

PROBLÉM HOMOTYPICKÉ FÚZE.

PEP12 je prevakuolární t-SNARE u Arabidopsis

Podstatnou součástí třídění leguminů je jejich postupná agregace v periferních oblastech

GA.

CVV, které vznikají na PB dom. GA pravděpodobně odtřiďují složky, které do

PSV nepatří.

Tvorba MVB

Třídění bílkovin z MVB do vakuoly je řízeno třemi komplexyESCRT - u Arabidopsis jsou některé podjednotky známy díkyanalýze mutantů hyade.

Vesicular traffic and the role of Golgi apparatus (body) as a “traffic controller”. Protein modifications take place in the Golgi, which result in acquisition of appropriate signals, and hence packaging into correct vesicles. Hydrolytic enzymes are sent to lysosome, export vesicles to plasmalemma and ER membranes and proteins are recycled back to ER (Fig 13-21).

Retromerpomáhárecyklovatz PVCdo TGN

Homology jsou také u rostlin a je pravděpodobné, že funguje podobně.

• Rostliny jsou schopny přežívat fáze nedostatku živin mj. také díky bohatě rozvinuté schopnosti autofagie - degradace cytoplasmatickýchčástí ve speciální vakuole.

Autofagická vakuola

4 dráhy

Bílkoviny řídící tvorbu autofagických vakuol jsou dobře evolučně konzervovány.Celá dráha je aktivována TOR kinázou a pak procesem podobným ubiquitinaci.Důležitou roli hraje PI3K - VPS34, která je inhibována wortmanninem.

• PI(4)P (blue) -concentrated on Golgi

• PI(3)P (green) - early endosomes

• PI(4,5)P2 -plasma membrane

• PI(3,5)P2 - multi-vesicular endosomes

Distribution ofphosphatidylinositidesin cells:

Roth 2004

Ve vakuole dochází k nespecifickédegradaci řady

substrátů včetně lipidů, polysacharidů a bílkovin.

Arabidopsis s postiženou tvorbou autofágníchvakuol rychleji stárne a hůře odolává hladovění.

•Vakuoly jsou Vakuoly jsou Vakuoly jsou Vakuoly jsou

centrální pro centrální pro centrální pro centrální pro

pochopení života pochopení života pochopení života pochopení života

rostlinné rostlinné rostlinné rostlinné buňky.buňky.buňky.buňky.

• Robinsonovy

shrnující

• modely

• 2005