Centrální dogma molekulární biologie

Alexandr Sember

Genetika (2009)český překlad originálu Principles of Genetics 5th edition (Snustad a Simmons, 2009)

Molecular Biology of the Gene 6th edition (2008) J. D. Watson et al.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.TOC&depth=2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.TOC&depth=2

• cca. 15% celkové hmotnosti buňky (55% sušiny) tvoří proteiny

70%voda

30%ostatní

malé mol.ionty 4%fosfolip. 2%DNA 1%

RNA 6%

proteiny 15%

polysach. 2%

nu

kleov

ékys.

• Buňka má informaci o syntéze proteinů uloženou v DNA

Složení buňky

Centrální dogma MB

• Francis Crick (1956) • Směr přenosu genetické informace: chromozomální DNA funguje jako templát

pro RNA, která se poté přemístí do cytoplasmy, kde funguje jako templát pro proteosyntézu

• základní myšlenka stále platná, pouze později doplněna o možnost reverzní transkripce (Temin, Baltimore, 1970 – objevení reverzní transkriptázy u viru Rousova sarkomu, 1975 NC); pochopitelně je i možné přepsat RNA do další RNA

DNA jako genetický materiál1868 – Johann Friedrich Miescher- Izolace nukleinu z buněčných jader- obvazy z gangrén nasáklé hnisem (leukocyty)- Hrubé extrakty DNA (několik desítek bp)- Unikátní poměr P/N, chybí S

1869 – 1940 – Phoebus Aaron Theodor Levene - pracoval na složení NK- zjistil, že DNA má 4 základní kameny (báze) - Naměřil,že jejich poměr je 1:1:1:1 - tetranukleotidová hypotéza – pořadí nukleotidů

je neměnné, tetranukleotid se pravidelně opakuje, proto nemůže vyjadřovat žádnou genetickou informaci; NK je lešení, na němž jsou navěšené proteiny; chemickou podstatu genu je třeba hledat ve struktuře proteinů

DNA jako genetický materiál1928 – Frederick Griffith- pokus se Streptococcus pneumoniae (zápaly plic u člověka; smrt u myší)- nebezpečnost souvisí s obalením do polysacharidového pouzdra

S-kmen - aktivní gen, který kóduje enzym pro syntézu kapsulárního polysacharidu - hladký vzhled (S = smooth, hladký)

R-kmen (R= rough, drsný vzhled), nemají pouzdro a nejsou proto virulentní

DNA jako genetický materiálGriffithův experiment – došlo k přenosu genetického materiálu mezi dvěma kmeny bakterií procesem transformace

1. virulentní S - kmen způsobí smrt myši; 2. nevirulentní R – kmen, myš přežije; 3. – mrtvé virulentní kmeny – nic se neděje; 4. – mrtvé virulentní kmeny smíchané s živými nevirulentními → myš zemřela; izolace živých virulentních kmenů

1944 – Avery, McLeod, McCarty

Transformační princip – komponenta mrtvé bakterie zodpovědné za transformaci

• Opakování Griffithova experimentu• Využití rozkvětu enzymologie (proteázy, RNázy, DNázy)• Pouze při působení DNáz experiment přestal fungovat • Definitivní důkaz - DNA = gen. materiál

DNA jako genetický materiál

1941 – William Atsbury• jako první izoloval opravdu vysokomolekulární DNA• první difrakční obrazce

1950 Erwin Chargaff• množství všech 4 bází není ekvimolární• relativní podíl bází není náhodný (A=T, C=G)• AT se nerovná GC, zastoupení u různých organismů se liší = vyvrácení

tetranukleotidové hypotézy• Chargaffovo pravidlo: poměr pur/pyr se rovná vždy 1 nezávisle na tom, z jakého

zdroje DNA pochází

DNA jako genetický materiál

• Chargaffovo pravidlo: obsah pyrimidinů = obsah purinů

DNA jako genetický materiál1952 – Alfred Day Hershey, Martha Chase (NC)• Je DNA genetickým materiálem i u virů?• analýza různých složek bakteriofága T2• využití pokroku (radioizotopy, izolace fágů,

mikrobiologie E. coli)• Kapsidy fágů zůstávají na povrchu x genetický

materiál jde do bakterie

• kultura E. coli s bakteriofágy → kultivace na médiu s radioaktivním P+S• S → chybí v DNA• P → chybí v proteinech (výjimky: fosforylace)

2 experimenty – v jednom případě značena pouze DNA a ve druhém pouze proteiny• značené proteiny virového obalu zůstaly mimo buňku• značená DNA viru se dostávala do buňky + vznik nového fágového potomstva• definitivní důkaz, že za přenos dědičné informace je zodpovědná DNA i u virů

• RNA jako genetický materiál byla objevena roku 1957 u viru tabákové mozaiky TMV (Fraenkel-Conrat + Singer)

Rentgenová difrakční analýza

William Atsbury, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin

Rentgenová difrakční analýza – molekuly měřené struktury dokážou vychýlit rentgenový paprsek v závislosti na struktuře a molekulární hmotnosti (typu atomů)

1951 – Rosalind Franklinová – nejlepší difrakční obrazce

1953 – James Watson, Francis Crick- trojrozměrný model struktury DNA- Syntéza z cizích výsledků (Franklin, Chargaff..)- Důležitý ne přímo ten model, ale hlavně návrh, jak

by se DNA mohla replikovat!!- 1962 Nobelova cena za fyziologii a lékařství (spolu s

Wilkinsem, ale bez Franklinové – zemřela ve 37 letech na rakovinu vaječníků, NC se neuděluje in memoriam)

kříž = šroubovice

chybějící 4. řada pruhů ukazuje, že DNA je double helix

Báze vrstveny kolmo k ose

Vzdálenost mezi bázemi = 3,4 Å1 otočka = 34 Å = 10 bp (ve skutečnosti 10,4)

Průměr šroubovice = 20 nm

1 nm = 10-9 metru1 Ångström (Å) = 0,1 nm

Struktura NKPrimární struktura = posloupnost nukleosidtrifosfátů (NTP, dNTP) pospojovaných fosfodiesterovou vazbou (resp. pořadí bází);Nevětvené lineární molekuly

Nukleotid v se skládá z:1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza) DNA: 2-deoxy-β-D-ribózaRNA: β-D-ribóza 2) Dusíkatá baze – adenin, guanin, thymin, cytosin, uracilPurinové baze: A, GPyrimidinové baze: C, T, U

3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné

Nukleotid = nukleosid (cukr+báze) + fosfát

Struktura NKNukleotid v se skládá z:1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza) DNA: 2-deoxy-β-D-ribózaRNA: β-D-ribóza 2) Dusíkatá baze – adenin, guanin, thymin, cytosin, uracilPurinové baze: A, GPyrimidinové baze: C, T, U

3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné

N-glykosidická vazba

Pozice na cukru se označují tzv. „s čarou“ (na bázích ne)

Největší rozdíl mezi DNA a RNA je 2´OH skupina RNA

Struktura NK

Nukleotidy:

adenosinguanosinthymidin mono-di-tri -fosfátcytidinuridin

AMP – ADP – ATPdATP x ATP

Struktura NK

Puriny: aromatické heterocyklické báze, rovinný (= planární) dvojcyklus, v poloze 9 je navázán cukr

Adenin = 6-aminopurin (analog je mutagenní 2-aminopurin)Guanin = 2-amino-6-ketopurin

Struktura NK

Pyrimidiny: aromat. heterocykly, jednoduchý cyklus, v poloze 1 je navázán cukrCytosin = 2-keto- 4-aminopyrimidin (O= na C2 a NH2 na C4)Thymin = 2,4 – diketo – 5 – metylpyrimidin (O =na C2 a C4, metyl na C5)Uracil = 2,4 – diketopyrimidin (O= na C2 a C4)

Thymin je vlastně 5-metyluracilDeaminací cytosinu vzniká uracilDeaminací 5-metylcytosinu vzniká thymin

Zapamatujte si uracil a máte vyhráno

Tautomerismus bázíPřeskakování vodíku mění uspořádání donor/akceptor vodíkové vazby – jiné preference párování

Stabilní formy bází = keto (T, G, U), amino (A, C)

Méně stabilní izoformy = enol (T, G, U), imino (A, C)

Nukleotidy mohou mít i jiné funkce…

Kofaktory enzymů

Druzí poslové v signalizaci

Zdroj metylu pro metylaceATP = zdroj energie v živých systémech

Kofaktorenzymů

Sekundární struktura DNA= 2 molekuly ssDNA spojené vodíkovými vazbami (Watson-Crickovské párování bází)Báze jsou komplementární (donor/akceptor vodíkové vazby)

A-T 2 vodíkové vazbyG-C 3 vodíkové vazby

Páry AT a GC jsou stejně široké (překryv C1 deoxyribózy = N-glykosidická vazba, symetrie helixu)

Vodíková vazba = interakce mezi silně elektronegativním atomem (O, F, N) a vodíkemNH2 = donor H-vazby=O, N = akceptor H-vazby

28 typů párování nukleotidů volně v roztokupř. Hoogsteenovo párování – rekombinace, G-kvartet; wobble párování – využití při čtení genetického kódu

Polarita řetězců dána fosfodiesterovou vazbou

5´ ATTGCCA 3´3´ TAACGGT 5´

5´-P a 3´OH

Watson-Crickovské párováníAntiparalelní uspořádáníPravotočivá dvojšrouboviceBáze jsou uvnitř, cukr-fosfátová kostra vně

Malý a velký žlábek

Sekundární struktura DNA = pravotočivá/levotočivá dvojšrouboviceTerciální struktura DNA= lineární, kružnicová, nadšrouboviceKvarterní struktura DNA = pouze ve smyslu nějakého komplexu s proteiny

Malý a velký žlábek Důvody:1) páry bází neprocházejí přesně

středem podélné osy dvoušroubovice

2) N-glykosidické vazby nevycházející z páru bází pod úhlem 180°. Úhly mezi oběma vazbami jsou 120° (malý žlábek) a 270° (velký žlábek)

Důsledek:Jiná nabídka chemických

skupin - v malém žlábku chybí

metyl – rozpoznání pouze páru AT nebo GC

- Ve velkém žlábku rozpoznání konkrétní báze (využití regulačními proteiny, regulace transkripce x TBP vazba do malého žlábku)

120°

270°

Stabilita DNA1) Stacking interakce• hlavní příspěvek ke stabilitě DNA• Vrstvení bází na sebe (hydrofobní a van

der Waalsovy interakce)• splývání oblastí výskytu delokalizovaných

π-elektronů sousedících aromatických kruhů

• GC páry mají mnohonásobně silnější stacking interakce mezi sebou

(než AT páry)

2) Hydratační obal• Primární (pouze voda) a sekundární (+ ionty)• Primární obal: 20 molekul vody / 1 nt• Zeslabení odpuzování sousedních fosfátů• Hydrofobní interakce (posiluje stacking)• Doplnění dalších vodíkových můstků

3) Vodíkové vazby mezi bázemi• Velmi malý příspěvek ke stabilitě• Význam spíše pro specifitu párování

Konformace DNA/RNAKonformační polymorfismus- Různá hydratace a koncentrace solí- Modifikace bází (př. 5-metylcytosin u Eukaryot)- Alternativní párování bází, vrtulovité zkroucení bází apod.- Konformační flexibilita ribózy a N-glykosidické vazby- Sekvenční polymorfismus – závislost struktury na lokální sekvenci

3D struktura molekuly: Popis torzními (dihedrálními) úhly – jejich součet = 180°0° = syn180° = anti

Máme atomy ABCD, které jdou ve vazbách za sebou; torzní úhel je úhel mezi vazbami AB a CD podle vazby BC, která tvoří jakoby pant mezi nimi

N – glykosidická vazba• Všechny nukleotidy preferují anti• Pouze G preferuje aspoň z 15% syn Konformace ribózy• Pokud jsou C4, O4 a C1 v jedné

rovině, sledujeme, co je nad a pod rovinou cyklu

• V DNA obvykle C2-endo, fosfáty pohodlně daleko od sebe (70 Å)

• V RNA a hybridech DNA/RNA obvykle C3 – endo (kvůli 2´OH skupině)

Konformace DNA/RNA

• Ribóza ve C3-endo• RNA, hybrid DNA/RNA• Báze vytlačeny od

středu, uprostřed kanál

• C2-endo, klasická forma DNA

• Žlábky pěkně vykreslené

• C2-endo, G v syn• Schodovitá struktura,

opakování dvou párů bází• Levotočivá!!

Elektrické vlastnosti NK• záporný náboj, pohyb v elektrickém poli • chovají se jako polyanionty (dsDNA má dva mínus náboje/1bp)• separace na agarózovém nebo PAA gelu = elektroforéza (anionty jako např. NK jdou k

kladné elektrodě, tedy k anodě), vizualizace např. ethidiumbromidem (interkalační činidlo)• dělení podle velikosti a topologie, menší molekuly procházejí rychleji

Denaturace NK• Reverzibilní narozdíl od proteinů• Denaturace teplotou, pH (pod 3, nad 11), formamidem (interference H-můstků),

močovinou, enzymaticky (helikáza)• Denaturace a reasociace (repetitivní sekvence rychleji)• Stabilita duplexů klesá v řadě RNA/RNA DNA/RNA DNA/DNA• Tání duplexů lze sledovat pomocí měření absorbance v UV-oblasti• NK mají absorpční maximum při vlnové délce 260 nm, proteiny při 280 nm

• Tm = teplota tání = teplota, při které je polovina duplexu denaturována; je tím vyšší, čím je větší obsah GC

• Hyperchromní efekt = zvýšení absorbance i přesto, že koncentrace DNA se nemění (při denaturaci volné báze lépe absorbují UV)

• dsDNA má absorbanci o 40% menší než dvě ssDNA

Hybridizace

cílová DNA

sonda

denaturace hybridizac

e

FISH = Fluorescence in situ hybridization

XSouthern, Northern blot= hybridizace in vitro

Rozdílné vlastnosti DNA/RNA v extrémním pH

Silně kyselé pH

DNA: bude snáze docházet k depurinacím, DNA zdenaturuje, ale i zdegraduje

RNA: pouze zdenaturuje (stabilní při pH 4 – 5,2)

Silně zásadité pH

DNA: bude pouze denaturovat

RNA: deprotonace 2´OH skupiny – nukleofilní atak fosfodiesterové vazby– vznikne 2´- 3´cyklický fosfát - rozpad na směs 3´ +2´ monofosfátů = denaturace+degradace

Struktura RNA- Vyšší flexibilita, strukturní a funkční

mnohotvárnost- Často ssRNA, menší velikost- Rozmanité sekundární struktury

(vlásenky, bubliny…)- Terciální struktury (pseudozel..)

- Stabilita: intramolekulární interakce (za přispění 2´OH a nekonvenčního párování pází), stacking interakce, vazba dvojmocných kationtů, stabilní tetraloops (rRNA), mnoho modifikovaných bází a případná metylace 2´OH, tautomerie bází

16S rRNA

Využití 2°struktury (vlásenka, SECIS) k inkorporaci selenocysteinu do proteinu

Využití 3°struktury (4 pseudouzly) k oddělení funkčních tRNA-like a mRNA-like domén ve struktuře tmRNA (záchrana ribozomu z aberantní mRNA u bakterií)

Funkce RNAFce. RNA- Čtení genetického kódu- Primery pro replikaci DNA - Genom mnoha virů - Strukturní (ribozom, SRP…)- Ribozymy (katalytická fce.)- Riboswitch (metabolite-sensing)- RNA interference (siRNA, miRNA,

piRNA…)

Typy RNA 1) mRNA2) „udržovací“ (housekeeping) RNA- tRNA, rRNA, snRNA,snoRNA, telomerázová

RNA, SRP RNA, RNasaP, RNAsa MRP, tmRNA…

3) regulační RNA- miRNA (micro), siRNA (short interfering),

piRNA (piwi interacting), riboswitch, sRNA 4)„parazitické“RNA (retrotranspozony, viroidy,

virusoidy, RNA virů) 5) jiné RNA (guide RNA)

Červeně: ribozymová aktivita (u snRNA a rRNA jen některé – U2+U6 snRNA, 23S rRNA)

RNA Tie Club (24 členů s kravatou báze nebo AMK)(foto: zleva Crick, Rich, Orgel, Watson)

Adaptorová hypotéza:• informace v DNA není převáděna do

polypeptidu přímo• vodíková vazba mezi nt+AMK je

nepravděpodobná• existuje tRNA = adaptorová molekula,

která se kovalentně váže k AMK a nekovalentně k NK

Mimo klub: 1953 – Zámečník a kol.• Užití cell-free extraktů, radioaktivně

značených AMK a ultracentrifugy• Objev rozpustné S (soluble) RNA (což byla

tRNA)• Na S-RNA se nejdříve váže AMK a až pak se

AMK dostanou do proteinů

• rRNA (85% RNA v buňce), je v ribozomech = templát??• NE – uniformní délka + kompozice bází (GC-bohaté) u různých

organismů

• objev mRNA na základě infekce E. coli fágem T4• fágová RNA má velmi podobnou kompozici bází jako fágová DNA • RNA se neváže s ribozomálními proteiny za tvorby ribozomálních

partikulí• pohybuje se napříč povrchem ribozomu • templát, který určuje pořadí AMK v proteinu• variabilita v délce a kompozici bází

Objev rRNA a mRNA (1960)

Severo Ochoa – 1959 NC za syntézu RNA- polynukleotid fosforyláza (PNPáza) – in vivo u bakterií štěpí RNA na mononukleotidy, ale přidá k nim navíc ještě 1 fosfát – vznikají nukleosiddifosfáty

1. Kodon – Phe (Nierenberg, Matthaei, 1961; NC roku 1968)Užití PNPázy na syntézu poly -U templátu z nukleosiddifosfátůTranslace in vitro z poly-U mRNA- produktem byl polyfenylalanin…pak CCC, AAA…(GGG nefungoval)

4 báze a kód je tripletový = 3 báze kódují 1 aminolyselinu (AMK) = 43 kombinací = 64 kodonů, z toho 61 kóduje AMK, 3 stop kodony; kodon pro methionin je zároveň iniciační

Degenerovaný kód = více různých kodonů kóduje stejnou AMK

Univerzální = až na výjimky je stejný u všech organismů

Nepřekryvný = báze 1,2,3 kódují 1AMK, báze 4,5,6 kódují další, není tam překryv

Genetický kód

tRNA

22

13

23

12

25

10 9

antikodon20.2

D20.120.2

A G

G*

17.1 D

16 R A

25

36 35 34

38 Y*

R* U

U* *

30 40

29 41

28 42

A C C

R

Y

47.17

46 45

44

Y47.18

47

5´

3´

extra rameno

antikodonové rameno

D- rameno

někdy nejsou semiinvarianty

polohy s pravi-delně modifiko-vanými basemi invarianty

TC rameno

akceptorové rameno

65

49

62

52

X*

R

X

C R

A*

C

59

Y

T G

64

50

63

51

47.1

7

6 67

4 69

3 70

2 71

73

1 72

5 68

31 39

27 43

66

Modifikované báze

Wobbling inosinu v antikodonu

Ribozymy – objev (80.léta, NC 1983)

GI intron ve 26S rRNA Tetrahymena thermophila (Thomas Cech)

Rnáza P – sestřihnutí 5´konce prekurzoru tRNA u E. coli (Sidney Altman)

Ribozymy

Hammerhead ribozym u viroidů a virusoidů

Ribozymy obecně často něco štěpí (s výjimkou např. ribozomu, který syntetizuje), štěpení probíhá v jednovláknové oblasti, obvykle je přímo či nepřímo zůčastněna 2´OH skupina, proteiny udržují správnou konformaci ribozymu, pro funkci je dále důležitá vazba kationtů

Ribozymy

Centrální dogma MB

Genetika - český překlad (2009) Principles of Genetics 5th edition (Snudtad, Simmons, 2009)

Riboswitch

• Ribozymy a riboswitche – náznak, že původní svět mohl být založen na RNA

• DNA – stabilnější (bez 2´OH, T místo U) – přesun odpovědnosti za uložení genetické informace

• Proteiny – převzaly většinu katalytických rolí

• Chybí důkazy RNA světa (fosílie)

RNA svět

Děkuji za pozornost..