熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System · 2018. 8. 9. · Kumamoto...

熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title 杜仲葉の抗肥満作用と有効成分に関する研究

Author(s) 平田, 哲也

Citation

Issue date 2011-06-22

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/22945

Right

熊本大学熊本大学熊本大学熊本大学学位学位学位学位論文論文論文論文

杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉のののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用とととと有効成分有効成分有効成分有効成分にににに関関関関するするするする研究研究研究研究

２０１１２０１１２０１１２０１１

平田平田平田平田哲也哲也哲也哲也

Studies on anti-obesity effect and active compounds of

Eucommia ulmoides leaves

Tetsuya Hirata

Studies on anti-obesity effect and active compounds of Eucommia ulmoides leaves

Tetsuya Hirata

Eucommia ulmoides Oliv. belongs to a single species and genus in the plant family Eucommiaceae. The

bark has been used traditionally in analgesics, tonics and hypotensives in China. Moreover, the Chinese

medical book “Bencao gangmu” describes fresh Eucommia leaf as “consumed as a vegetable.” The

product “Tochu-cha” available on the Japanese market is the roasted Eucommia leaf, which has also been

used in beverages containing geniposidic acid and asperuloside among the iridoid glucosides, and

chlorogenic acid, a coffeic acid derivative, as major ingredients. From Eucommia leaf powder (ELE),

eight iridoids were isolated, together with 14 known compounds. Spontaneously hypertensive rats (SHR)

fed Eucommia leaf extract exhibited a dose-dependent anti-hypertensive effect. Moreover, follow-up

studies have confirmed that Eucommia leaf extract decreases systolic blood pressure (SBP) in humans

after long-term intake, and these anti-hypertensive effects are presumed to be due to the activity of

geniposidic acid, a so-called Eucommia leaf glycoside. The extract from Eucommia leaves containing

Eucommia leaf glycoside is used as the food supplement for the food for specified health uses (FOSHU).

Obesity, which can lead to metabolic syndrome, has recently gained attention as a factor that

dramatically increases the risk of arteriosclerotic disease. According to Japanese diagnostic criteria,

obesity and metabolic syndrome (MS) are considered conditions requiring prevention and/or treatment due

to the high risk of complications, including hyperglycemia, hyperlipemia and hypertension, based on

accumulation of visceral fat. In short, various beneficial and harmful adipocytokines excreted from

visceral fat have been found to be involved in MS. In this paper, based on the hypothesis of mediation of

anti-obesity effects of Eucommia leaves by decrease in amount of visceral fat induced by intake of

Eucommia leaves and reanalysis of research data, use of Eucommia leaves for MS was planned. Initially,

the anti-obesity effects of Eucommia materials with different procedures of processing were examined and

their mechanisms of action were clarified. Next, the ingredients of Eucommia green leaf which exhibited

strong effects were determined, and pharmacological studies were conducted to indentify active

compounds, which led to interesting findings. The findings obtained are summarized below:

In the studies described in the 1st chapter, the author used a MS-like rat model, produced by feeding a

35% high-fat diet (HFD), to examine potential anti-obesity and anti-metabolic syndrome effects and

mechanisms of effects of chronic administration of ELE or Eucommia green leaf powder (EGLP). Eighty

rats in ten groups were studied for 90 days. Both forms of Eucommia leaves minimized increases in body

weight and visceral fat in dose-dependent fashion. Our results showed that ELE and EGLP have strong

protective effects against the obesity caused by HFD, and also exert weak effects upon normal diet-fed rats.

Increases in plasma levels of triglyceride (TG) and free fatty acids (FFA) and insulin resistance secondary

to HFD were lessened by both forms of Eucommia leaf. Concomitantly, an increase in plasma adiponectin

levels and suppression of plasma resistin and TNF-α levels were confirmed. Real-time PCR studies

showed that both forms of Eucommia leaf enhanced metabolic function in several organs, including

diminution of ATP production (white adipose tissue), acceleration of β-oxidation (liver) and increase in

the use of ketone bodies/glucose (skeletal muscle), all of which may exert anti-obesity effects under HFD

conditions. These findings suggest that chronic administration of either form of Eucommia leaves

stimulates the metabolic function of several organs in rats. The anti-obesity and anti-metabolic syndrome

activity in this rat model may be maintained through secretion and regulation of adipocytokines that

depend on the accumulation of visceral fat to improve insulin resistance or hyperlipemia.

In the studies described in the 2nd

chapter, detailed investigation of the constituents of EGLP led to the

isolation of six iridoids (asperuloside, asperulosidic acid, scandoside 10-O-acetate, deacetyl asperulosidic

acid, geniposidic acid, aucubin), five flavonoids (isoquercitrin, quercetin 3-O-sambubioside, rutin,

astragalin, kaempferol 3-O-rutinoside) and chlorogenic acid. Three additional new iridoids were obtained,

and 2 of them (eucomoside B and

eucomoside C) were isolated by

condensation of geniposidic acid and

amino acids (phenylalanine and

tryptophan, respectively), while the

other (eucomoside A) was an acetal compound with a linkage from C-3 of the iridoid to C-2 of the glucose

unit, each of which was the first natural compound.

In the studies described in the 3rd

chapter, the author examined the anti-obesity effects of EGLE divided

into five fractions with high porous polystyrene gel, and of the compounds isolated, geniposidic acid,

asperuloside and chlorogenic acid. A metabolic syndrome-like clinical model in mice was generated by

feeding a 40% high-fat diet to examine the anti-obesity effects of chronic

administration of test substance. After 4 weeks, body weight, white adipose tissue

weight, plasma triglyceride levels and total cholesterol levels in the model mice were

significantly inhibited by the 30% MeOH fraction (which contained much higher

levels of asperuloside than the other fractions), and these effects were similar to those

of EGLE. Chronic administration of isolated asperuloside in Eucommia leaves suppressed increases in

model mouse body weight, WAT weight, plasma TG levels and FFA levels. Chronic administration of

asperuloside enhanced the basal metabolic rate in rats fed a HFD and decreased respiratory quotients

significantly more than in the HFD control group, suggesting acceleration of lipid metabolism.

Our animal studies, based on previous research on Eucommia leaf, clarified the anti-obesity effects of

the Eucommia green leaf, and isolated asperuloside as the main active compound of the Eucommia green

leaf. Our study is the first to indicate the anti-obesity effects of asperuloside as iridoids. Our study findings

are expected to be available to new health application of Eucommia leaf developed as a food for specified

health uses.

O

OGlc

H

H

O

AcO

O

Asperuloside

論文要旨

杜仲葉の抗肥満作用と有効成分に関する研究

平田哲也

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）は中国中央部起源の 1 属 1 種の落葉性木本類で、樹高は 20 m に達

する中高木である。樹皮は生薬・杜仲で、中国最古の薬物書である「神農本草経」に、長く服用しても副

作用がなく長寿を助ける「上品」に分類・収載されている。また、数百年前に出版された「本草綱目」には、

高血圧症など具体的な疾患に対する有効性が記載されているほか、葉を「野菜として食する」とする記述

がある。一方、我が国では葉を焙煎により茶用として 1970 年代に発案された「杜仲茶」が、健康維持の目

的で幅広く飲用されている。近年、葉について成分探索の研究が進み、乾燥葉および焙煎葉など原葉の

成分検索が行われ、geniposidic acid を含む 8 種のイリドイド化合物のほか、14 種の化合物が得られてい

る。さらに、薬理試験が進み、副交感神経を介した血圧降下作用が明らかとなり、geniposidic acid を主

成分とする杜仲葉配糖体飲料が、「血圧が高めの方に適した食品」の表示許可を得、特定保健用食品と

して市販されるに至っている。一方、欧米型中心の食事と標準的な摂取カロリーを超える食生活の変化

に伴い、我が国ではメタボリックシンドローム（MS）が問題視されている。高血圧、脂質代謝異常、耐糖能

異常を伴う動脈硬化易発症病態を包括的に捉えた疾患観念である MS は、病態の基盤に内臓脂肪蓄

積が存在するとされている。すなわち、内臓脂肪より分泌される善悪の様々なアディポサイトカインが MS

に関与することが解明されてきている。本論文では、杜仲葉の食経験と研究データの再解析から導き出さ

れた内臓脂肪減少による抗肥満作用の仮説に基づき、杜仲葉の MS に対する保健用途への適合を計

画した。先ず、加工方法の異なる杜仲葉原料について、抗肥満作用に対する有効性の確認および作用

機序を明らかにし、次に、効果の高かった杜仲緑色葉の成分探索および有効成分を特定する薬理試験

を行い興味深い知見を得た。以下に得られた知見を概説する。

第 1 章では、先ず、加工方法の異なる杜仲葉の抗肥満試験を実施した。採取した生葉を乾燥・焙煎後

に熱水抽出処理した杜仲葉エキス（ELE）および生葉を乾燥処理後に粉末にした杜仲緑色葉粉末

（EGLP）を被験物質として、高脂肪食（HFD）および普通食（ND）に混餌し、それぞれを４週齢の SD 雄

性ラットに 90日間の経口投与を実施した。その結果、HFD に ELE および EGLP を混餌して摂取するこ

とにより体重および白色脂肪組織（WAT）重量の増加を有意に抑制し、その効果はいずれも用量依存的

であった。一方、ND 混餌群ではこれらを抑制する効果がみられなかったことから、HFD が起因する肥満

に対して杜仲葉は、高い効果があることが示唆され、ND においては影響が少ないことが考えられた。

HFD の実験において、血中脂質は、いずれの被験物質でも中性脂肪（TG）濃度が減少した。血糖は、い

ずれの投与群でグルコース値を正常値に維持しながらインスリン濃度の低下を示し、インスリン抵抗性の

改善が確認された。アディポサイトカインは、アディポネクチン濃度の上昇、ＴＮＦ-α およびレジスチンの

低下と、MS に関与する生理活性物質のバランスが整うことが示唆された。これらの抗肥満作用は、加工

方法の異なる被験物質に共通性があることから、どちらにも共通して含有する成分が関与していることが

示唆された。次に、投与終了後のラットの組織を摘出し、リアルタイム PCR 法で定量し、遺伝子発現量

の増減より、脂質、糖質の代謝メカニズムを予測した。ELE および EGLP を摂取することによって、肝臓

における β 酸化（carnitine palmitoyltransferase 1α、および 2 の mRNA 発現増加）の活性化が認められ

た。また、その作用は ND および HFD いずれでも維持された。このことから、生成されたケトン体は骨

格筋で積極的に利用（succinyl-CoA synthetase および peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase の mRNA

発現増加）されているとことが示唆された。また、骨格筋において糖を利用した TCA サイクル（isocitrate

dehydrogenase 3 (NAD＋) α および dihydrolipoamide succinyltransferase の mRNA 発現増加）と電子

伝達系（NADH dehydrogenase flavoprotein 1 および 5： Comp. I および Comp. V の mRNA 発現増加）

の活性化を認め、この作用は EGLP では HFD 負荷下でも維持された。腎周囲 WAT に対する

ELE および EGLP の効果は、被験食の脂質負荷状態によって異なり、HFD 条件下は WAT 細胞内に

TG の貯蔵を増加させ、大きな脂肪細胞を形成させる。一方、ELE および EGLP は脂肪細胞での ATP

産生を低下（Comp. I、V の mRNA 発現低下）させ、大きな脂肪細胞の形を維持するのに必要な ATP 不

足による脂肪細胞の崩壊を誘導していることが推測された。以上の結果、杜仲葉は全身レベルでの代謝

を活性化（肝臓や白色脂肪組織での脂質代謝の促進及び骨格筋での糖の利用促進）し、内臓脂肪の蓄

積抑制により、内臓脂肪を小型化させ肥満を改善していると推察された。

第２章では、抗肥満作用が確認された成分未検索の EGLP の分離精製を行い、6 種のイリドイド化合

物（asperuloside、asperulosidic acid、scandoside 10-O-acetate、deacetyl asperulosidic acid、geniposidic

acid、aucubin）、5 種のフラボノイド化合物（isoquercitrin、quercetin 3-O-sambubioside、 rutin、 astragalin、

kaempferol 3-O-rutinoside）および chlorogenic acid を含む 12 種の既知化合物ならびに 3 種の新規イリド

イドを得た。そのうち 2 種（eucomoside B、eucomoside C）は、イリドイドのカルボン酸とアミノ酸のアミノ基が

縮合した化合物、1 種（eucomoside A）

は、イリドイドの 3 位とグルコースの 2

位がアセタール結合を持つ、何れも天

然物最初の例である。

第３章では、EGLP を熱水抽出し、エキスを high porous polystyrene gel によるカラ

ムクロマトにより５つに分画、各画分の抗肥満試験を実施した。その結果、30％ MeOH

画分に強い抗肥満効果が認められ、その効果は、エキスに類似していた。また、この画

分の主要物質はイリドイド化合物 asperuloside であった。次に、単離精製された

asperuloside を HFD 負荷マウスに投与すると強い体重および内臓脂肪蓄積抑制効果

が確認された。さらに、asperuloside を HFD 負荷ラットに投与すると、基礎代謝量増加

および脂肪燃焼亢進が高められたことから、脂肪を積極的にエネルギーとして消費していることが示唆さ

れた。

以上、これまでの杜仲研究の集大成として、杜仲緑色葉の抗肥満作用を動物実験で明らかにし、有効

成分として杜仲緑色葉の主要成分 asperuloside を同定した。本研究で asperuloside に抗肥満作用が

認められたことはイリドイド化合物として最初の例である。本研究の知見は、特定保健用食品として開発さ

れている杜仲葉に新たな保健用途への応用が可能なものとして期待される。

O

OGlc

H

H

O

AcO

O

Asperuloside

略語集略語集略語集略語集

本論文において次の略語を使用した。

ATP : adenosine 5’-triphosphate

ASP : asperuloside

BAT : brown adipose tissue testicular circumference

BMR : basal metabolic rate

C: M: W : CHCl3: MeOH: H2O

13C-NMR : carbon-13 nuclear magnetic resonance

Comp. I : NADH dehydrogenase flavoprotein 1

Comp. V : ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, delta

subunit

Cpt1α : carnitine palmitoyltransferase 1α

Cpt2 : carnitine palmitoyltransferase 2

Cs : citrate synthase

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose

DMSO : dimetyl sulfoxide

ELE : Eucommia leaf extract

EGLE : Eucommia green leaf extract

EGLP : Eucommia green leaf powder

FA : fatty acid

FATP : fatty acid transport protein

FFA : free fatty acid

Fig. : figure

Fr. : fraction

Gck : glucokinase

glc : glucose (glucopyranose)

GLUT4 : solute carrier family 2 member 4

HFD : high-fat diets

HFD-Cont. : high-fat diets control

HMBC : heteronuclear multiple bonds correlation

HMQC : heteronuclear multiple quantum coherence

1H-NMR : proton-1 nuclear magnetic resonance

HPLC : high performance liquid chromatography

HR negative ESI-MS : high resolution negative electrospray ionization mass spectroscopy

HR positive FAB-MS : high resolution positive ion fast atom bombardment mass spectrometry

HR positive ESI-MS : high resolution positive electrospray ionization mass spectroscopy

HSL : hormone-sensitive lipase

ICR : Institute of Cancer Reseach

Idh3α : isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) α

ND : normal diets

ND-Cont. : normal diets control

NOE : nuclear overhauser effect spectroscopy

Ogdh : dihydrolipoamide succinyltransferase

P3KCoT : peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase

Pk : pyruvate kinase

Positive ESI-MS : positive electrospray ionization mass spectroscopy

Positive FAB-MS : positive ion fast atom bombardment mass spectrometry

PPARγ : peroxisome proliferator activator receptor γ

rha : rhamnose (rhamnopyranose)

RQ : respiratory quotients

SBP : systolic blood pressure

SCoS : succinyl-CoA synthase

SE : standard error

SHR : spontaneously hypertensive rats

TG : triglyceride

TLC : thin-layer chromatography

TNFα : tumor necrosis factor α

UCP : uncoupling protein (ATP synthase)

UV : ultra-vaiolet

WAT : white adipose tissue

WATr : white adipose tissue renal circumference

WATt : white adipose tissue testicular circumference

xyl : xylose (xylopyranose)

本論文は、学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

1） Studies on the chemical constituents of green leaves of Eucommia ulmoides Oliv.

Chika Takamura, Tetsuya Hirata, Yasuyo Yamaguchi, Masateru Ono, Hiroyuki

Miyashita, Tsuyoshi Ikeda, Toshihiro Nohara

J. Nat. Med., 61, 220–221 (2007).

2） Iridoids from the Green Leaves of Eucommia ulmoides.

Chika Takamura, Tetsuya Hirata, Taro Ueda, Masateru Ono, Hiroyuki Miyashita,

Tsuyoshi Ikeda, Toshihiro Nohara

J. Nat. Prod., 70, 1312–1316 (2007).

3） Chronic administration of Eucommia leaf stimulates metabolic function of rats

across several organs.

Takahiko Fujikawa, Tetsuya Hirata, Atsunori Wada, Naomi Kawamura, Yasuyo

Yamaguchi, Katsuyuki Fujimura, Taro Ueda, Yutaka Yurugi, Hideaki Soya, Sansei

Nishibe

Br. J. Nutr., 104, 1868–1877 (2010).

4） Anti-obesity compounds in green leaves of Eucommia ulmoides.

Tetsuya Hirata, Takeo Kobayashi, Atsunori Wada, Taro Ueda, Takahiko Fujikawa,

Hiroyuki Miyashita, Tsuyoshi Ikeda, Sachiko Tsukamoto, Toshihiro Nohara

Bioorg. Med. Chem. Lett., 21, 1786–1791 (2011).

目次目次目次目次

序論序論序論序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

本論本論本論本論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5

第第第第１１１１章章章章杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉のののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用とととと機序機序機序機序・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5

1-1 これまでの杜仲葉有効性研究経過・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5

1-2 ELE および EGLP の長期投与による抗肥満作用試験・・・・・・・・・・・・・・ 6

1-2-1 試料調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6

1-2-2 投与量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6

1-2-3 実験動物および飼育方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7

1-2-4 経口投与法および測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7

1-2-5 統計処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8

1-2-6 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8

1-2-6-1 ND-Cont.群および HFD-Cont.群間の比較・・・・・・・・・・・・ 8

1-2-6-2 体重・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9

1-2-6-3 WAT 体重・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 11

1-2-6-4 血中グルコース量および血中インスリン量・・・・・・・・・・・・ 12

1-2-6-5 血中脂質量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 14

1-2-6-6 血中アディポサイトカイン量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 17

1-2-7 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 20

1-3 ELE および EGLP の長期投与による遺伝子発現試験・・・・・・・・・・・ 22

1-3-1 試料調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-2 投与量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-3 実験動物および飼育方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-4 経口投与法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-5 測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-5-1 測定部位・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-5-2 RNA 精製と逆転写・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

1-3-5-3 遺伝子発現解析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24

1-2-6-4 ∆∆Ct 法による相対的定量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24

1-3-6 統計処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24

1-3-7 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26

1-3-7-1 グルコース代謝に関連する遺伝子発現・・・・・・・・・・・・・ 26

1-3-7-2 脂質代謝に関連する遺伝子発現・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 29

1-3-7-3 ケトン体代謝に関連する遺伝子発現・・・・・・・・・・・・・・・ 29

1-3-7-4 PPARγおよびアディポネクチンの遺伝子発現・・・・・・・ 29

1-3-7-5 脱共役タンパク質の遺伝子発現・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 30

1-3-8 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 30

第 1 章の小括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 34

第第第第２２２２章章章章杜仲杜仲杜仲杜仲緑色緑色緑色緑色葉葉葉葉のののの成分研究成分研究成分研究成分研究・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 36

2-1 これまでの杜仲葉成分研究経過・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 36

2-2 抽出・分離・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37

2-3 既知化合物の化学構造・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38

2-3-1 EU-1（1）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38

2-3-2 EU-2（2）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38

2-3-3 EU-3（3）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 39

2-3-4 EU-4（4）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 40

2-3-5 EU-5（5）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 40

2-3-6 EU-6（6）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 41

2-3-7 EU-7（7）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43

2-3-8 EU-8（8）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43

2-3-9 EU-9（9）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 44

2-3-10 EU-10（10）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 45

2-3-11 EU-11（11）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 46

2-3-12 EU-12（12）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 48

2-4 新規化合物の化学構造・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 48

2-4-1 EU-13（13）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 48

2-4-2 EU-14（14）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 50

2-4-3 EU-15（15）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 54

2-5 各成分の含有量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 60

2-5-1 各成分の収量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 60

2-5-2 3D HPLC による主成分分析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 61

第２章の小括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62

第第第第３３３３章章章章杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉のののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用にににに関与関与関与関与するするするする成分成分成分成分のののの特定特定特定特定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63

3-1 杜仲緑色葉分画物の抗肥満試験・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63

3-1-1 試料調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64

3-1-2 成分含量測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64

3-1-3 投与量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64

3-1-4 実験動物および飼育方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64

3-1-5 経口投与法および測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 65

3-1-6 統計処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 65

3-1-7 結果および考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 65

3 - 2 主要３成分の長期投与による抗肥満試験・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7 0

3-2-1 試料調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 70

3-2-2 投与量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 70

3-2-3 実験動物および飼育方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 70

3-2-4 経口投与法および測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 71

3-2-5 統計処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 71

3-2-6 結果および考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 71

3-3 主要３成分の長期投与による代謝活性試験・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

3-3-1 試料調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

3-3-2 投与量・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

3-3-3 実験動物および飼育方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

3-3-4 経口投与法および測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 76

3-3-5 統計処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 76

3-3-6 結果および考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 76

第３章の小括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 78

総括総括総括総括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 79

実験実験実験実験のののの部部部部・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 83

引用文献引用文献引用文献引用文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 99

謝辞謝辞謝辞謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 103

1

序論序論序論序論

杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv.) は中国中央部起源の 1 属 1 種の落葉性木

本類で 1)、樹高は 20m に達する中高木である(Fig. 1)。杜仲の特徴は、雌雄異株で

あり、花被が風媒受精のため存在せず、花糸、葯および子房が側枝の腕芽部分より

新芽と同時に直接分化する。種子は受精後、子房部位が成長し、風による飛散のた

め遡果となっている。杜仲は被子植物の中では比較的初期に発生したと考えられて

おり、各国の化石の発掘から鮮新世の初期には世界中にトチュウ属が存在していたと

推定されている 1)。現存種のみに衰退したのは、度重なる氷河期が原因と考えられて

おり、メタセコイアなどと同じく中国中央部に残存したものと考えられている 2)。

杜仲樹皮の薬用・食用経験は、中国をたどると約 2000 年前に発刊された中国の

薬物書「神農本草経」に、長く服用しても副作用がなく長寿を助ける「上品 (じょうぽ

ん)」に分類・収載されているほか、数百年前に出版された「本草綱目」1)には、高血圧

症など具体的な疾患に対する有効性が記載されており、現在でも樹皮が生薬として

利用されている。また、本書には葉を「野菜として食する」と記されており、普段の健康

維持のため食用されていたと考えられる。中国の少数民族「チャン族」は、葉を茶や粥

として食用し 2)、現在も一部の地域では保健目的で住居の近くに植えているようである

(Fig. 1)。

我が国における杜仲の伝来は、遣唐使の取り扱った木簡に記述が見られることや

正倉院の薬物保管庫から杜仲が発見されていることから、この時代に伝わったと考え

られている 2)。現在、我が国における杜仲の利用は、その利用部位により大きく分けて

樹皮と葉に大別される。無承認医薬品の「1-a」に収載される樹皮は、江戸時代からつ

づく薬用酒「養命酒」に代表されるように薬用としての活用がなされている。一方、食

品素材として取り扱いを受けている葉は、焙煎により嗜好性を高めたいわゆる「杜仲

茶」として 1970 年代に発案されて以来、健康茶として幅広く飲用されている(Fig. 2)。

2

杜仲の含有成分に関する研究は、樹皮について出山 3)によって同定され、リグナン

配糖体やイリドイド配糖体の存在が証明されている。一方、葉については Bianco ら 4)

の eucommiol の確認以来、加藤ら 5,6)はイリドイド配糖鉢とフラボノイド類、難波ら 7)は

フェノール類を、野原ら 8)のグループは geniposidic acid、中村ら 9,10)はイリドイド配糖

体、フラボノイド化合物、フェノール誘導体を同定している。

杜仲の薬理研究は、樹皮に滋養強壮、血圧降下、更年期障害などの薬理効果が

見出されている。近年、葉の薬理研究が進み、血圧降下 11)、利尿促進、抗ストレス作

用 12)、抗高脂血作用 13,14,15,16）など有効性が示されてきた。特に、血圧降下について

はヒト臨床試験により有効性の確認がなされ、さらに作用機序が明らかとなり、杜仲葉

配糖体が有効成分として特定されてきている 17)。この杜仲葉の血圧降下に関して特

筆すべき点は、ヒト試験において正常高値血圧者および軽症高血圧者で顕著な降

圧作用 18)を示すのに対して、正常血圧者で変化がみられない 18,19)、いわゆる血圧調

整機能である。これらの特徴は「食の第三次機能」で定義される「生体調節」を保健機

能として世界で始めて導入がなされた「特定保健用食品制度」の概念に適し、「血圧

が高めの方に適した食品」として杜仲葉配糖体含有食品が厚生省 (現在、表示許可

は消費者庁に移行)より最初に表示許可された食品となった(Fig. 2)。

さて、我が国の死因の第一位を占める心血管疾患(心筋梗塞、脳梗塞など)の主要

な原因は、肥満症、糖尿病、高脂血症、高血圧が重複する、いわゆるメタボリックシン

ドロームと考えられている。メタボリックシンドロームは、高血圧、脂質代謝異常、耐糖

能異常を伴う動脈硬化易発症病態を包括的に捉えた疾患観念で、病態の基盤に内

臓脂肪蓄積が存在するとされている 20)。また最近では、生活習慣病の重積のみなら

ず、その発症と合併症の進展順序 (生活習慣の乱れからインスリン抵抗性、そして心

血管イベントの発症)を総合的に簡便に把握する概念として「メタボリックドミノ」が提唱

されている 21)。メタボリックドミノは血圧上昇や耐糖能の異常が高血圧や糖尿病の基

準には達しない境界域の状態であっても、それらの病態が重積すると心血管イベント

3

のリスクが高くなることを示した概念であるとも言える。これらのことからも、その上流に

位置する『生活習慣の乱れ』による肥満症の発症前後レベルでの予防及び治療の重

要性が示唆されている。2005 年 4 月 8 日に日本内科学会総会でメタボリックシンドロ

ームの診断基準が発表されたが、その当時の厚生労働省発表の平成 16 年国民健

康・栄養調査結果の概要によると、メタボリックシンドロームの有病者数は約 940 万人、

予備群者数が約 1,020 万人、併せて約 1,960 万人と推定されており、最近発表の平

成 20 年国民健康・栄養調査でも 40 歳以上 74 歳以下では、男性の 2 人に 1 人、女

性の 5 人に１人が、メタボリックシンドロームが強く疑われる人または予備群と考えられ

る人と推定されている。これらの問題克服のため、政府は特定健診・特定保健指導制

度の導入によるセルフメディケーション意識の啓発を進め、増大する医療費問題の対

策を進めている状況にある。

筆者は、杜仲葉の食経験と研究データの再解析から導き出された内臓脂肪減少

による抗肥満作用の仮説に基づき、杜仲葉のメタボリックシンドロームに対する保健用

途への適合を計画した。本研究は、加工方法の異なる杜仲葉原料について抗肥満

作用に対する有効性の確認および機序を明らかにするとともに、杜仲緑色葉粉末の

成分探索および関与成分を特定する薬理試験を行った。

4

Tea (leaves) Beverages

Food for specified health uses (FOSHU) Dietary Supplement

Fig. 2. Eucommia ulmoides Oliv. leaves products

Fig. 1. Eucommia ulmoides Oliv.

Tree

Cortex (market of naturalmedicine)

Garden tree (health uses)

5

本論本論本論本論

第第第第１１１１章章章章杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉のののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用とととと機序機序機序機序についてについてについてについて

1111----1111 これまでのこれまでのこれまでのこれまでの杜仲葉有効性研究経過杜仲葉有効性研究経過杜仲葉有効性研究経過杜仲葉有効性研究経過

我が国の死因の第 1 位を占める心血管疾患 (心筋梗塞、脳梗塞など)の主要な原

因は、肥満症、糖尿病、高脂血症、高血圧が重複する、いわゆるメタボリックシンドロ

ームと考えられている。メタボリックシンドロームは、高血圧、脂質代謝異常、耐糖能

異常を伴う動脈硬化易発症病態を包括的に捉えた疾患観念で、病態の基盤に内

臓脂肪蓄積が存在するとされている 20)。

杜仲葉のメタボリックシンドロームに関する有効性研究は、1970 年代の前半から

中国において不足する樹皮の代替品として活用する際に、高血圧に対する有効性

を評価する臨床試験が実施されている 22,23)。難波らは、杜仲葉水抽出画分の薬効

薬理に関する研究を行い、一過性の降圧作用を認め、作用機序は副交感神経系

へのアゴニストであることを報告している 11)。中澤らは、焙煎処理をした杜仲葉エキス

を与えた自然発症高血圧ラット(spontaneously hypertensive rats: SHR)において用

量依存性の抗高血圧作用を認め、ヒトへの長期摂取により収縮期血圧 (systolic

blood pressure: SBP)の低下を誘発することを確認している。これらの抗高血圧作用

は、ゲニポシド酸によるものと推測している 2)。脂質代謝異常の改善に関して、

Metori らが杜仲葉水抽出物 (3 g あるいは 6 g /kg-体重 /日 )を与えた 12%ラード脂肪

食負荷ラットにおいて白色脂肪組織 (white adipose tissue: WAT)重量の減少を認め

た 13)。また、Choi らは杜仲葉水抽出物 (15.5 mg/日 )を与えたハムスターにおいて脂

肪酸およびコレステロールの抑制を認め、HMG-CoA 還元酵素の抑制による作用と

報告している 16)。一方、Park らは糖負荷 C57BL/KsJ-db/db マウスにおいて、杜仲

葉水抽出物投与により血糖値の改善を報告している 15）。

6

1111----2222 ELE、、、、ELP およびおよびおよびおよび EGLP のののの長期投与長期投与長期投与長期投与によるによるによるによる抗肥満作用試験抗肥満作用試験抗肥満作用試験抗肥満作用試験

杜仲葉は、我が国では焙煎品が「杜仲茶」として発案され、茶葉を煮出して飲用

されている。一方、中国では生葉を食用としていた背景がある。本試験では、杜仲

葉の抗肥満作用に着目し、加工方法が異なる杜仲葉の影響について検討した。す

なわち、採取した生葉を乾燥・焙煎後に熱水抽出処理した杜仲葉エキス

(Eucommia leaf extract： ELE)および生葉を乾燥処理後に粉末にした杜仲緑色葉

粉末 (Eucommia green leaf powder： EGLP)を被験物質として高脂肪食 (high-fat

diets： HFD)および普通食 (normal diets： ND)に混餌し、それぞれを４週齢の SD

雄性ラットに 90 日間の経口投与を試みた。投与期間中の体重増加量、投与終了

後の WAT 重量、糖代謝の指標成分としてグルコースおよびインスリンを、脂質代謝

の指標成分として血中中性脂肪 (triglyceride： TG)、総コレステロールおよび遊離

脂肪酸 (free fatty acid： FFA)を測定した。また、アディポサイトカインとして、アディポ

ネクチン、TNF-α、レジスチンおよびレプチンを指標として抗肥満試験を実施した。

1111----2222----1111 試料調製試料調製試料調製試料調製

中国四川省産の杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv.)から採取した生葉を用いた。

ELE は、生葉を蒸気温度 100～110℃で蒸熱処理し、熱風により水分量を 10%以下

に乾燥後、130℃で 20～30 分間焙煎した 2 t の杜仲葉を 90 ℃の熱水 10 t で１時間

抽出し、それをろ過、濃縮、静置、冷却した後、さらにろ過、再濃縮、真空乾燥して

茶褐色の粉末を得た(収率：18%)。EGLP は、生葉を蒸気温度 100～110℃で蒸熱

処理し、熱風により水分量を 10%以下に乾燥後、粉砕して緑色の粉末を得た。

1111----2222----2222 投与量投与量投与量投与量

飼料の組成を Table 1 に示した。飼料は、MF 粉末試料 (オリエンタル酵母 )を基本

に、ラードが 5%配合された ND(ND-Control： ND-Cont.)あるいは 30%増量した

7

Experimental group Based diet (Fat) EGLP

ND-Cont. MF (5%)

ND-ELE

ND-3% ELE MF (5%)

ND-9% ELE MF (5%)

ND-EGLP

ND-3% EGLP MF (5%) 3%

ND-9% EGLP MF (5%) 9%

HFD-Cont. MF (35%)

HFD-ELE

HFD-3% ELE MF (35%)

HFD-9% ELE MF (35%)

HFD-EGLP

HFD-3% EGLP MF (35%) 3%

HFD-9% EGLP MF (35%) 9%

(% of content)

9%

ELE

3%

9%

3%

HFD(HFD-Control： HFD-Cont.)を作製した。また被験物質はそれぞれの飼料に、

ELE および EGLP を 3%あるいは 9%混餌して作製し、90 日間自由摂取させた(投与

量として 2-6 g/kg/day)。

1111----2222----3333 実験動物実験動物実験動物実験動物およびおよびおよびおよび飼育方法飼育方法飼育方法飼育方法

実験動物として４週齢の雄性 SDラット(日本 SLCから購入 )を使用した。飼育は全

て、室温 23-26℃、湿度 50-65%、明暗周期 12時間 (午前 8時点灯、午後 8時消灯 )

のサイクル条件下で行い、2 週間の予備飼育後、実験に使用した。

1111----2222----4444 経口投与法経口投与法経口投与法経口投与法およびおよびおよびおよび測定方法測定方法測定方法測定方法

予備飼育終了後、体重を指標に各群 8 匹になるよう群分けした。飼料は、各群そ

れぞれ水とともに 90 日間自由摂取させ、週間毎に体重と摂餌量を測定した。投与

開始 90 日後、12 時間絶食させたラットを、ストレスをかけることなく断頭を行い、その

後 WAT として腎周囲 (white adipose tissue perirenal： WATp)および精巣周囲 (white

Table 1. Composition of the diet.

8

adipose tissue epididymal： WATe)を摘出して重量を測定するとともに、血液サンプルを

採取した。血液は遠心 (3,000 rpm、 15 min.)を行い、血中を分離し測定までは

-80℃で保存した。解凍後の血液は、糖代謝の指標成分としてグルコースおよびイン

スリンを、脂質代謝の指標成分として総コレステロール、血中 TG および FFA を測定

した。また、アディポサイトカインとしてアディポネクチン、TNF-α、レジスチンおよびレ

プチンを測定した。総コレステロール、血中 TG および FFA は E-テストワコー(和光純

薬工業 )、血中インスリンはモリナガ超高感度ラットインスリン測定キット(森永乳業 )、

血中アディポネクチンはマウス/ラットアディポネクチン ELISA キット(大塚製薬 )、血中

TNF-αはラット TNF-α測定キット(免疫生物研究所 )、血中レジスチンはレジスチン

ELISA キット(BVL)、血中レプチンはレプチン ELISA キット(LIC)を用いて、ELISA

法にて測定を行った。ホルモン測定以外のパラメーターは、日立 7180 型自動分析

装置 (日立製作所製 )を用いて測定した。

本実験全ての事項について、「実験動物の飼養および保管ならびに苦痛軽減に

関する基準 (環境省 )」および「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン(日本学

術会議 )」を遵守したうえで行った。

1111----2222----5555 統計処理統計処理統計処理統計処理

すべてのデータは平均値±標準誤差 (SE)で表した。統計処理は対応のない t-検

定あるいは Tukeyの方法に基づき多重比較検定をし、危険率 5%未満を有意差あり

とした。統計解析ソフトはＳＰＳＳ13.0 を使用した。

1111----2222----6666 結果結果結果結果

1111----2222----6666----1111 ND-Cont.群群群群およびおよびおよびおよび HFD-Cont.群間群間群間群間のののの比較比較比較比較

Table 2に ND-Cont.群および HFD-Cont.群間の体重、WATおよび血液指標の差

異についてまとめた。ND を摂取した ND-Cont.群および HFD を摂取した HFD-Cont.

9

Fainal body weight (g/rat) 482.8 ± 17.9 548.6 ± 16.8 **

Food intake (g/day/rat) 38.3 ± 3.6 25.3 ± 3.0 *

Weight of WAT (g/rat)

Perirenal 3.2 ± 0.3 9.9 ± 0.8 ***

Epididymal 5.3 ± 0.3 18.3 ± 0.7 ***

Glucose (mg/L) 1398.0 ± 42.0 1520.0 ± 57.0

Insulin (ng/mL) 2.9 ± 0.4 6.6 ± 0.5 ***

TG (mg/L) 1076.0 ± 132.0 2100.0 ±532.0

Free fatty acid (µEq/L) 561.4 ± 44.7 610.4 ± 78.8

Total cholesterol (mg/L) 907.0 ± 36.0 780.0 ± 27.0 *

Adiponectin (µg/L) 39.0 ± 6.0 27.0 ± 3.0

TNF-α (pg/mL) 376.5 ± 45.8 178.5 ± 22.6 **

Resistin (ng/mL) 136.3 ± 12.1 187.6 ± 15.9 *

Leptin (ng/mL) 4.2 ± 0.8 6.8 ± 0.4 **

ND-Cont. HFD-Cont.Item

群を比較すると、90 日間 HFD を摂取したラットの体重は有意に増加した(p<0.01)。

また、WAT 重量 (WATp および WATe)は有意に増加した(それぞれ p<0.001)。血液

指標について ND-Cont.群と比較すると、HFD-Cont.群は血中インスリンおよび総コ

レステロールの有意な増加が認められた(血中インスリン： p<0.001、総コレステロー

ル： p<0.05)。血中 TG および FFA は増加する傾向にあったが、有意な差は認めら

れなかった。アディポサイトカインについて ND-Cont.群と比較すると、HFD-Cont.群

は血中 TNF-αの有意な低下、血中レジスチンおよび血中レプチンの有意な増加が

観察された (血中 TNF-α： p<0.01、血中レジスチン： p<0.05、血中レプチン：

p<0.01)。これにより、HFD の長期摂取によりメタボリックシンドローム病態ラットが形

成されていることが確認された。

1111----2222----6666----2222 体重体重体重体重

ELE および EGLP の 3%あるいは 9% を ND に混餌しラットに投与した群

Table 2. Comparison between ND-Cont. and HFD-Cont.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from

ND-Cont., *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student's t-test).

10

Fig. 3. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on body weight in ND or

HFD-fed rats. Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different

from ND or HFD, * p<0.05 (Tukey t-test). Significantly different from HFD-3%

EGLP, # p<0.05 (Tukey t-test).

Time (days)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 30 60 90

(C)HFD-Cont.

HFD-3% ELE

HFD-9% ELE

*

*

*

*

*

*

Body weight (g)

0

Time (days)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 30 60 90

(A)ND-Cont.

ND-3% ELE

ND-9% ELE

Body w

eight (g)

0Time (days)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 30 60 90

(B)ND-Cont.

ND-3% EGLP

ND-9% EGLP

Body w

eight (g)

0

Time (days)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 30 60 90

(D)HFD-Cont.

HFD-3% EGLP

HFD-9% EGLP

*

*

*

*

** #

#

Body w

eight (g)

0

(ND-3%ELE群、ND-9%ELE群、ND-3%EGLPおよび ND-9%EGLP)は、ND-Cont.

群と比較して観察期間中の体重に有意な差は認められなかった(Fig. 3 A、B)。

11

Table 3. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on WATp

and WATe weghit in ND-fed rats.


ND, not significantly different (Tukey t-test).

Experimental group

ND-Cont. 3.2 ± 0.3 5.3 ± 0.3

ND-ELE

ND-3% ELE 2.6 ± 0.3 4.7 ± 0.4

ND-9% ELE 2.3 ± 0.3 4.3 ± 0.3

ND-EGLP

ND-3% EGLP 2.7 ± 0.3 4.8 ± 0.3

ND-9% EGLP 2.3 ± 0.3 4.3 ± 0.3

WATp (g) WATe (g)

ELE および EGLP の 3%あるいは 9% を HFD に混餌しラットに投与した群

(HFD-3%ELE 群、HFD-9%ELE 群、HFD-3%EGLP および HFD-9%EGLP)は、

HFD-Cont.群と比較して 30 日、60 日および 90 日後の体重が有意に減少した(それ

ぞれ p<0.05、Fig. 3 C、D)。さらに HFD-9%EGLP 群は、HFD-3%EGLP 群と比較し

て 60 日および 90 日後の体重が有意に減少し、用量依存性が観察された(p<0.05、

Fig. 3 D)。自発行動量および異常行動に著しいものは認められなかった。

1111----2222----6666----3333 WAT 重量重量重量重量

ND-3%ELE 群および ND-9%ELE 群は、ND-Cont.群と比較して 90日間の投与に

より WATp および WATe のいずれも WAT 重量の有意な変化は認められなかった

(Table 3)。また、ND-3%EGLP 群および ND-9%EGLP 群も同様に、ND-Cont.群と比

較して 90 日間の投与により WATp および WATe のいずれも WAT 重量の有意な変

化は認められなかった(Table 3)。

一方、HFD-3%ELE 群および HFD-9%ELE 群は、HFD-Cont.群と比較して 90 日

間の投与により WATp および WATe のいずれも WAT 重量が有意に減少した

12

Table 4. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on WATp

and WATe weghit in HFD-fed rats.

Experimental group

HFD-Cont. 10.0 ± 0.8 18.3 ± 0.7

HFD-ELE

HFD-3% ELE 5.6 ± 0.4 *** 13.9 ± 0.6 ***

HFD-9% ELE 3.5 ± 0.6 *** 5.8 ± 0.4 *** +++

HFD-EGLP

HFD-3% EGLP 5.1 ± 0.5 †† 7.9 ± 0.4 †††

HFD-9% EGLP 3.3 ± 0.5 †† 5.6 ± 0.4 †††　‡

WATp (g) WATe (g)

(p<0.001、Table 4)。さらに HFD-9%ELE 群は、HFD-3%ELE 群と比較して WATe 重

量が有意に減少し、その減少は用量依存的であった(p<0.001)。HFD-3%EGLP 群

および HFD-9%EGLP 群は、HFD-Cont.群と比較して 90 日間の投与により WATp

および WATe のいずれも WAT 重量が有意に減少した(p<0.01、p<0.001、Table 4)。

さらに HFD-9%EGLP 群は、HFD-3%EGLP 群と比較して WATe 重量が有意に減少

し、その減少は用量依存的であった(p<0.05)。

1111----2222----6666----4444 血血血血中中中中グルコースグルコースグルコースグルコース量量量量およびおよびおよびおよび血中血中血中血中インスリンインスリンインスリンインスリン量量量量

ND-Cont.群と比較して ND-9%EGLP 群は、90 日間の投与により血中グルコース

量が有意に減少した(p<0.01、Table 5)。また、ND-9%EGLP 群は、ND-3%EGLP 群

と比較して血中グルコース量が有意に減少した(p<0.05)。一方、ND-Cont.群と比較

して ND-3%ELE 群、ND-9%EGLP 群および ND-9%EGLP 群は、90 日間の投与に

より血中インスリン量が有意に減少した (ND-3%ELE 群および ND-3%EGLP 群：

Each value represent the mean±SE (n=8). Significantly different from

HFD, *** p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from HFD-3%

ELE, +++ p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from HFD, ††

p<0.01, ††† p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from

HFD-3%EGLP, ‡ p<0.05 (Tukey t-test).

13

Table 5. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on glucose

and insulin in ND-fed rats.


ND, ** p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different from ND, †† p<0.01,

††† p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from ND-3%EGLP, ‡

p<0.05, ‡‡‡ p<0.001 (Tukey t-test).

Experimental group

ND-Cont. 1398 ± 42 2.9 ± 0.4

ND-ELE

ND-3% ELE 1344 ± 38 2.2 ± 0.3

ND-9% ELE 1395 ± 52 1.9 ± 0.1 **

ND-EGLP

ND-3% EGLP 1346 ± 46 2.2 ± 0.4 ††

ND-9% EGLP 1111 ± 51 ††‡ 1.1 ± 0.1 ††† ‡‡‡

Glucose (mg/L) Insulin (ng/mL)

p<0.01 、 ND-9%ELE 群： p<0.001 、 Table 5) 。また、 ND-9%EGLP 群は、

ND-3%EGLP 群と比較して血中インスリン量が有意に減少した(p<0.001)。これにより

血中インスリン量においては、ND-Cont.群と比較して、HFD-3%EGLP 群および

HFD-9%EGLP 群で用量依存的な減少が確認された。

HFD-Cont.群と比較して、HFD-9%ELE 群および HFD-9%EGLP 群は、90 日間の

投与により血中グルコース量が有意に減少した (それぞれ p<0.05、Table 6)。

HFD-3%ELE 群、HFD-9%ELE 群、HFD-3%EGLP 群および HFD-9%EGLP 群は、

血中グルコース量に顕著な変化はみられなかった。一方、血中インスリン量において

は、HFD-Cont.群と比較して HFD-3%ELE 群および HFD-9%ELE 群で有意に減少

した(HFD-3%ELE 群： p<0.01、HFD-9%ELE 群： p<0.001)。また、HFD-9%ELE 群

は、HFD-3%ELE 群と比較して血中インスリン量が有意に減少し(p<0.01)、その変化

には用量依存性が認められた。HFD-3%EGLP 群および HFD-9%EGLP 群は、

HFD-Cont.群と比較して血中インスリン量が有意に減少した (p<0.001)。また、

HFD-Cont.群と比較して HFD-9%EGLP 群で血中インスリン量の有意な減少が観察

され(p<0.001)、その変化には用量依存性が認められた。

14

Table 6. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on glucose

and insulin in HFD-fed rats.


HFD, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 (Tukey t-test). Significantly

different from HFD-3%ELE, ++ p<0.01 (Tukey t-test). Significantly

different from HFD, † p<0.05, ††† p<0.001 (Tukey t-test). Significantly

different from HFD-3%EGLP, ‡‡‡ p<0.001 (Tukey t-test).

Experimental group

HFD-Cont. 1520 ± 17 6.6 ± 0.5

HFD-ELE

HFD-3% ELE 1458 ± 5 4.2 ± 0.5 **

HFD-9% ELE 1433 ± 17 * 2.4 ± 0.3 *** ++

HFD-EGLP

HFD-3% EGLP 1469 ± 31 4.2 ± 0.3 †††

HFD-9% EGLP 1458 ± 17 † 1.8 ± 0.2 ††† ‡‡‡

Glucose (mg/L) Insulin (ng/mL)

1111----2222----6666----5555 血中血中血中血中脂質量脂質量脂質量脂質量

血中 TGおよび総コレステロールは、NDを混餌した全ての群において ND-Cont.

群と比較して 90日間の投与後に有意な減少が認められた(ND-3%ELE群： p<0.01、

ND-9%ELE 群、ND-3%EGLP 群および ND-9%EGLP 群： p<0.001、Table 7)。総コ

レステロールの変化は、血中 TG とは異なり、用量依存性は認められなかった(Table

7)。ND-9%ELE 群および ND-3%EGLP 群は、ND-Cont.群と比較してより強く FFA を

低下させた(p<0.001、Table 7)。

HFD-Cont.群と HFD-3%ELE 群、HFD-9%ELE 群、HFD-3%EGLP 群および

HFD-9%EGLP 群を比較すると、血中 TG 量は HFD-9%ELE 群および

HFD-9%EGLP 群で有意な低下がみられ、その変化には用量依存的な傾向があっ

た(p<0.01、Table 8)。一方で、FFA、総コレステロールでは、有意に減少している群

もあったが、用量依存性は認められなかった(p<0.001、Table 8)。

15

Experimental group Total cholesterol (mg/L)

ND-Cont. 1076 ± 132 561.4 ± 44.7 907 ± 36

ND-ELE

ND-3% ELE 795 ± 27 * 604.9 ± 42.7 626 ± 10 ***

ND-9% ELE 566 ± 49 *** 262.5 ± 21.3 ***+++ 976 ± 40 ***

ND-EGLP

ND-3% EGLP 533 ± 10 ††† 353.1 ± 33.8 †† 721 ± 7 †††

ND-9% EGLP 375 ± 8 †††‡ 574.5 ± 27.3 ‡‡ 659 ± 32 †††

FFA (µEq/L)TG (mg/L)

Table 7. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on plasma TG, FFA and total cholesterol in ND-fed rats.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from ND, * p<0.05, *** p<0.001 (Tukey t-test).

Significantly different from ND-3% ELE, +++ p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from ND, †† p<0.01, †††

p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from ND-3% EGLP, ‡ p<0.05, ‡‡ p<0.01 (Tukey t-test).

16

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from HFD, ** p<0.01 (Tukey t-test). Significantly

different from HFD-3% ELE, ++ p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different from HFD, † p<0.05 (Tukey t-test).

Significantly different from HFD-3% EGLP, ‡‡ p<0.01 (Tukey t-test).

Experimental group Total cholesterol (mg/L)

HFD-Cont. 2100 ± 532 610.4 ± 78.8 780 ± 27

HFD-ELE

HFD-3% ELE 1101 ± 150 450.8 ± 33.8 655 ± 28 **

HFD-9% ELE 605 ± 41 **++ 493.4 ± 26.2 725 ± 15

HFD-EGLP

HFD-3% EGLP 1169 ± 15 478.0 ± 21.6 758 ± 26

HFD-9% EGLP 631 ± 10 †‡‡ 484.3 ± 30.9 826 ± 8

TG (mg/L) FFA (µEq/L)

Table 8. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on plasma TG, FFA and total cholesterol in HFD-fed rats.

17

1111----2222----6666----6666 血中血中血中血中アディポサイアディポサイアディポサイアディポサイトカイントカイントカイントカイン量量量量

ND を摂取したラットの血中アディポサイトカインに対する ELE および EGLP の 90

日投与の効果について Table 9に示す。血中アディポネクチン量は、ND-Cont.群に

対して ND-3%ELE 群および ND-9%ELE 群を比較したとき、ND-9%ELE 群で有意

に増加した(p<0.05)。また、ND-9%EGLP 群において ND-Cont.群と比較して血中ア

ディポネクチン量の有意な増加がみられた(p<0.01)。

血中 TNF-α量は、ND-Cont.群に対して ND-3%ELE 群および ND-9%ELE 群を

比較したとき、ND-9%ELE 群で有意に減少した(p<0.05)。また、ND-9%EGLP 群に

おいて ND-Cont.群と比較して血中 TNF-α量の有意な減少がみられた(p<0.01)。

血中レジスチン量および血中レプチン量は、ELE 群では ND-Cont.群と比較して

減少傾向を示したものの有意な差は認められなかった。一方 EGLP 投与群では、

HFD-9%EGLP 群で HFD-Cont.群と比較して有意に減少した(血中レジスチン量：

p<0.05、血中レプチン量：p<0.01)。

次に、HFD を摂取したラットの血中アディポサイトカインに対する ELE および

EGLP の 90 日投与の効果について Table 10 に示す。血中アディポネクチン量は、

HFD-Cont.群に対して HFD-3%ELE 群および HFD-9%ELE 群を比較したとき、

ND-9%ELE 群で有意に増加した (p<0.01) 。また、ND-9%EGLP 群において

ND-Cont.群と比較して血中アディポネクチン量の有意な増加がみられた(p<0.01)。

血中 TNF-α量は、HFD-Cont.群に対して HFD-3%ELE 群および HFD-9%ELE

群を比較したとき、HFD-9%ELE 群で有意に減少した(p<0.01)。また、HFD-9%ELE

群において HFD-3%ELE 群と比較して血中 TNF-α量が有意に減少し(p<0.001)、

用量依存性が示唆された。HFD-9%EGLP 群は、HFD-Cont.群と比較し血中 TNF-

α量が有意に減少し(p<0.05)、HFD-3%EGLP 群と比較して血中 TNF-α量の有意

な減少が認められたことから(p<0.01)、用量依存性が示唆された。

18

Experimental group Leptin (ng/mL)

ND-Cont. 40 ± 6 376.5 ± 45.8 136.3 ± 12.1

ND-ELE

ND-3% ELE 42 ± 4 294.3 ± 24.4 128.3 ± 5.6

ND-9% ELE 56 ± 3 * 219.3 ± 7.4 * 122.9 ± 8.7

ND-EGLP

ND-3% EGLP 38 ± 3 315.4 ± 26.7 123.4 ± 5.1

ND-9% EGLP 47 ± 4 †† 199.8 ± 20.8 †† 107.9 ± 4.1 † ††

Resistin (ng/mL)

4.2 ± 0.8

3.3 ± 0.4

3.2 ± 0.1

2.8 ± 0.4

1.6 ± 0.2

TNF-α (pg/mL)Adiponectin (µg/L)

Table 9. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on plasma adipocytokine in ND-fed rats.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from ND, * p<0.05 (Tukey t-test). Significantly different from ND,

† p<0.05, †† p<0.01 (Tukey t-test).

19

Experimental group Leptin (ng/mL)

HFD-Cont. 27 ± 3 178.5 ± 22.6 187.6 ± 15.9

HFD-ELE

HFD-3% ELE 42 ± 4 137.1 ± 15.1 175.9 ± 15.9

HFD-9% ELE 53 ± 4 ** 63.5 ± 8.3 **+++ 111.4 ± 11.0 **++

HFD-EGLP

HFD-3% EGLP 39 ± 3 147.5 ± 16.9 184.1 ± 16.9

HFD-9% EGLP 48 ± 5 †† 99.3 ± 6.4 †‡‡ 117 ± 7.4 ††‡‡ 7.6 ± 0.6

6.8 ± 0.4

5.9 ± 0.7

6.7 ± 0.8

6.0 ± 0.5

Resistin (ng/mL)TNF-α (pg/mL)Adiponectin (µg/L)

Table 10. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on plasma adipocytokine in HFD-fed rats.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from HFD, ** p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different

from HFD-3% ELE, ++ p<0.01, +++ p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from HFD, † p<0.05, †† p<0.01 (Tukey t-test).

Significantly different from HFD-3% EGLP, ‡‡ p<0.01 (Tukey t-test).

20

血中レジスチン量は、HFD-Cont.群に対して HFD-3%ELE 群および HFD-9%ELE

群を比較したとき、HFD-9%ELE 群で有意に減少した(p<0.01)。また、HFD-9%ELE

群において HFD-3%ELE 群と比較して血中レジスチン量の有意な減少が認められ

(p<0.01)、用量依存性が示唆された。HFD-9%EGLP 群は、HFD-Cont.群と比較し

血中レジスチン量が有意に減少し(p<0.01)、HFD-3%EGLP 群と比較して血中レジ

スチン量の有意な減少が認められたことから(p<0.01)、用量依存性が示唆された。

血中レプチン量は、ELE 群および EGLP 群では HFD-Cont.群と比較して有意な

差は認められなかった。

1111----2222----7777 考察考察考察考察

著者は、高脂肪性の餌を与えることによりメタボリックシンドローム様の病態ラットを

作成し、抗肥満効果およびメタボリックシンドロームのいくつかの指標を杜仲葉が改

善するかどうかを検討した。

先ず ND を摂取させたラットと比較して HFD を摂取させたラットは、体重の増加に

加え、WAT の顕著な蓄積がみられ、メタボリックシンドロームの病態の基盤である内

臓脂肪蓄積による肥満を呈した。また、血液指標においても、高インスリン血症、高

中性脂肪血症が確認され、アディポサイトカインの代表であるアディポネクチンの低

下、レジスチンの増加がみられた。これらはいずれも、メタボリックシンドローム病態の

主要なサインであり、この結果、HFD 負荷によりメタボリックシンドローム病態ラットが

作成されることが示唆された。

これに対して、ELE および EGLP を投与することにより、次の結果が得られた。体

重は、ELE および EGLP ともに体重増加を抑制する効果が認められ、特に HFD に

混餌した群が顕著であった。効果はいずれも用量依存的であった。ND をベースに

投与した群にも若干の体重増加を抑制する効果が見られたが、有意差は確認でき

ず程度は小さいと思われた。同様に WATp および WATe についても ELE および

21

EGLP を投与することにより増加を抑制する効果が認められ、特に HFD 負荷群が顕

著に抑制した。このことから、高脂質が原因で起こる肥満に対して杜仲葉は、高い効

果があることが示唆され、通常の食事においては影響が少ないことが考えられた。

糖代謝については、血中グルコース値は HFD 負荷下、ELE 投与群および EGLP

投与群で低下が認められた。一方、ND 負荷下、ELE 投与群では顕著な変化がみ

られなかったが、EGLP 群では低下が確認された。ELE および EGLP の成分の違い

から糖代謝改善のメカニズムにも違いがあると予想される。ただし、このモデルでは血

中グルコース値が充分に上昇しているとは言えず、血中グルコース値の上昇を抑え

る効果の強弱については言及できない。Leeらは、杜仲葉の水抽出物が 1型糖尿病

モデルラットおよび、2 型糖尿病モデルマウス(C57BL/KsJ-db/db mice)において、血

中グルコース値の改善効果を報告しており 14）、血中グルコース値が上昇した状態で

あれば効果がみられる可能性は高い。一方で血中インスリン値においては、HFD 負

荷により顕著に増加し、その増加を ELE および EGLP の投与により大幅に抑制して

おり、その効果は用量依存的であった。血中グルコース値の抑制効果と同様に

EGLP の方がより強い効果があり、ND 群でもインスリン値の低下が見られている。こ

のことから、ELE および EGLP は高脂肪食によるインスリン抵抗性を改善させることが

明らかとなった。この作用メカニズムの違いについては今後詳細に検討したい。

脂質代謝については、ELE、EGLP いずれも血中 TG 値の上昇抑制が確認できた。

Lee らはモルモットを使った研究で、肝臓の脂質代謝を亢進し、血中 TG 値およびコ

レステロール値を抑制する効果を報告している 14）。今回の結果も、ND摂取よりHFD

摂取のほうに効果が顕著であることから、餌由来の TG の吸収を抑える働きや、脂質

代謝を亢進する効果が関与している可能性が考えられる。一方で、FFA および総コ

レステロール値については、全体的には低下傾向にあるが、用量依存性が確認でき

ないことや、測定値のばらつきが大きいこともあり、明確な効果については言及でき

ない。

22

アディポサイトカインについては、内臓脂肪組織から特異的に分泌され、抗動脈

硬化効果やインスリン抵抗性改善効果があるといわれる血中アディポネクチンが 24)、

ELE および EGLP いずれも用量依存的に増加している。この効果は、HFD 負荷下

で特に顕著であり、ND 負荷時のレベルに類似していたことから、正常な状態に近づ

けるものと考えられる。また、インスリン抵抗性を惹起するとされる血中レジスチンは

25)、特に EGLP の投与で低下している。このようなアディポサイトカインの変動が高イ

ンスリン血症の改善につながると推測される。今回、炎症反応に関与し、インスリン

抵抗性を惹起するとされる TNF-αが、HFD の投与によって血中レベルが下がるとい

う現象がみられた。この理由は定かではないが、ND 投与群内、もしくは HFD 投与群

内で比較すれば、ELE、EGLP 投与で血中レベルが低下している。

以上のことから、ELE および EGLP には、メタボリックシンドロームの改善に効果が

あることが示唆された。

1111----3333 ELE およびおよびおよびおよび EGLP のののの長期投与長期投与長期投与長期投与によるによるによるによる遺伝子発現試験遺伝子発現試験遺伝子発現試験遺伝子発現試験

杜仲葉投与における抗肥満メカニズムを解明するため、ELE および EGLP を被験

物質として投与した SD 雄性ラットの遺伝子発現試験を試みた。ND あるいは ND に

30%ラードを混合した HFD を基本組成に、ELE および EGLP を 3%あるいは 9%添

加し、飼料を作製した。これらの飼料を、６週齢の SD雄性ラットに 90日間投与した。

投与終了後、 WATp 、褐色脂肪組織 (brown adipose tissue testicular

circumference： BAT)、筋組織および肝臓を摘出し、リアルタイム PCR 法で定量し

た。数値化は同じベースの餌の群内で、被験物質である ELEあるいは EGLPを添加

した群と無添加群との遺伝子発現量を比較し、有意差が認められたものを増減あり

とした。遺伝子発現量の増減より、脂質、糖質の代謝メカニズムを予測した。

23


試料は、第 1 章 1-2-1 に準ずる。

1111----3333----2222 投与量投与量投与量投与量

投与量は、第 1 章 1-2-2 に準ずる。


実験動物および飼育方法は、第 1 章 1-2-3 に準ずる。

1111----3333----4444 経口投与法経口投与法経口投与法経口投与法

投与方法は第 1 章 1-2-4 に準ずる。

1111----3333----5555 測定方法測定方法測定方法測定方法

1111----3333----5555----1111 測定部位測定部位測定部位測定部位

EGLP および ELE 投与後の肝臓、WATp、BAT および骨格筋において、脂質 /糖

質代謝に関連する遺伝子の発現量を、リアルタイム PCR 法による発現 mRNA を定

量した。

1111----3333----5555----2222 RNA 精製精製精製精製とととと逆転写逆転写逆転写逆転写

トータル RNA の分離は、TriPure Isolation kit (Roche)を使用した。RNA 調製は

分光光度計を用いて吸光度 260 nm で定量的な測定を行った。また、吸光度

260/280 nm の比率を測定し、全てのサンプルの値が 1.8-2.0 の範囲内にあるトータ

ル RNA を用いた。

抽出後、トータル RNAサンプルは 37℃で 30分間 TURBO DNase free (Ambion、

Austin、 TX)によりゲノム DNA を除去し、調製した。DNase で調製されたトータル

24

RNA(0.35 μg)は、逆転写反応キット(ReverTraAce qPCR RT キット、東洋紡 )を用

いて短鎖 cDNA を合成した。

1111----3333----5555----3333 遺伝子発現解析遺伝子発現解析遺伝子発現解析遺伝子発現解析

合成された cDNA (50 ng/ml)を用いて、リアルタイム PCR 反応キット(Power SYBR

Green PCR Master Mix、Applied Biosystems)を用いてリアルタイム PCR 装置 (ABI

PRISM 7300、Applied Biosystems 社製 )によりリアルタイム PCR 解析を行った。リア

ルタイム PCR 装置の PCR 条件は、熱変性を 95℃ 10 分間、40 サイクルの PCR を

熱変性 95℃ 15 秒、アニーリングおよび伸長反応 60℃ 60 秒にて実施した。

1111----3333----5555----4444 ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 法法法法によるによるによるによる相対的定量相対的定量相対的定量相対的定量

目的遺伝子とリファレンス遺伝子 (GAPDH)の各プライマーセットでの PCR 増幅効

率が１に近いことを確認した後、杜仲葉投与群および対照群のそれぞれの目的遺

伝子とリファレンス遺伝子の Ct 値の差 (∆Ct(目的遺伝子 Ct-リファレンス遺伝子 Ct ))

を算出し、さらに、杜仲葉投与群と対照群の差 (∆∆Ct (杜仲葉投与群 ∆Ct-対照群

∆Ct))を算出する。得られた値 (∆∆Ct)を 2-∆∆Ct に代入することにより、GAPDH で補

正した目的遺伝子の相対的発現量を算出した (with relative quantification

software SDSv1.2、Applied Biosystems)。目的遺伝子を Table 11 に示す。


定量した実数は、被検物質を混合した群の遺伝子発現量に対して、ベースにあ

たる被験食対照群 (ND あるいは HFD)の遺伝子発現量を 1 としたときの比率で数値

化した。

統計処理は、第 1 章 1-2-5 に準ずる。

25

Table 11. Primers, Tm (℃) and product (bp) for real-time PCR using Power SYBR Green PCR Master Mix protocol.

Forward primer (5’- 3’) (Tm) Reverse primer (5’ – 3’) (Tm) product (bp)

Liver

Gck

Cs

Comp. I

FATP

Cpt1α

WAT (perirenal)

GLUT4

Idh3α

Ogdh

HSL

PPARγ

ACRP30

Soleus muscle

Pk

Comp. V

SCoS

P3KCoT

BAT

UCP2

NM 012565

NM 130755

CB5449004

NM 053580

NM 031559

NM 012751

NM 053638

AI412142

NM 012859

NM 013124

NM 144744

NM 053297

NM 139106

J03621

J02749

NM 019354

ACTGGAGTATGACCGGATGG (59.80)

CCGGTACAGATTCCGGTAGA (59.89)

CCGGGCTGCCTATATCTACA (60.07)

ATGACGGCTATGGTGTCTCC (59.96)

GTGACTGGGACACTGGTCCT (60.01)

CTGCTGCTCAGTGCTGTGAT (60.37)

CAGGCTCAGTGAAGGACACA (60.02)

ATCATTCCCAAGCCACAAAG (59.93)

CGGTTGATTTCTCCAGCATT (60.07)

AGGAAACTTGTGCAGGTTGG (60.15)

CATGGAGAAGTGCGATGAGA (59.94)

GGTAATGGTTCATGCGGAAG (60.33)

GGTTATTTGCCAGGGTTTCA (59.80)

GTGGCATCAGAAATGGGTCT (59.93)

ATCAGGCCATGATAGCCACT (59.54)

CACCAGCTTAAGCAGCACAA (60.20)

CCGGTACAGATTCCGGTAGA (59.95)

GGCATTTTTGCCAATCAGAC (60.46)

TAGCGTCCCTGTTTCAGGTC (60.26)

TCATGGCTTGTCTCAAGTGC (59.99)

CTACCCAGCCAAGTTGCATT (60.13)

TTGCCTCCCAGATCTTTTGT (59.67)

GTCCCCACGTGTTCATCTCT (59.97)

GGACGCAGGCTCTACTTTGA (60.54)

CATCTCCTGGGTCACCCTTA (59.92)

CAGCACCTTTCTCCTTCACC (59.84)

AGGTCCAGCATGTCCAGTGT (60.60)

GTAAGCCCAGGTGCTTCTTG (59.88)

TCTCTGGCCTTCTCGTTCTC (59.68)

CGTCAAGACGAGACAGAGGA (59.13)

121

119

106

125

126

131

125

121

123

137

150

128

129

125

124

132

Cpt2 NM 012930 TGCTTGCTCAGGATAAGCAG (59.32) GTCCGGATTGAATGCCATAA (60.67) 125

UCP3 NM 013167 GAAGCTGCTGGACTCTCACC (60.14) GCGTTCATGTATCGGGTCTT (59.96) 129

CTTCTGCCCCAAGTGGATAC (59.55)

Comp. I CB5449004 CCGGGCTGCCTATATCTACA (60.07) GGCATTTTTGCCAATCAGAC (60.46) 106

Comp. I CB5449004 CCGGGCTGCCTATATCTACA (60.07) GGCATTTTTGCCAATCAGAC (60.46) 106

TGACGTCATCGCTACACTCA (58.98)

GLUT4 NM 012751 GTGACTGGGACACTGGTCCT (60.01) CTACCCAGCCAAGTTGCATT (60.13) 131

Idh3α NM 053638 CTGCTGCTCAGTGCTGTGAT (60.37) TTGCCTCCCAGATCTTTTGT (59.67) 125

Cs NM 130755 CCGGTACAGATTCCGGTAGA (59.89) CCGGTACAGATTCCGGTAGA (59.95) 119

26

1111----3333----7777 結果結果結果結果

1111----3333----7777----1111 グルコースグルコースグルコースグルコース代謝代謝代謝代謝にににに関連関連関連関連するするするする遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現

ND を摂取したラットの肝臓は、ND-ELE および ND-EGLP のそれぞれの群において、

糖代謝遺伝子 glucokinase (Gck) の有意な差は認められなかった(Table 12)。一方、

WATp において、ND-9%EGLP 群で isocitrate dehydrogenase 3 (NAD＋) α(Idh3

α)および NADH dehydrogenase flavoprotein 1 (Comp. I)の mRNA の増加を示し

た (p<0.05 あるいは、 p<0.001) 。また、WATp において ND-9%EGLP 群は、

dihydrolipoamide succinyltransferase (Ogdh)の mRNA の増加を示した(p<0.05)。

ATP synthase、H+ transporting、mitochondrial F1 complex, delta subunit (Comp.

V）の mRNA は、ND-EGLP 群のそれぞれの WATp において増加した(それぞれ

p<0.001)。骨格筋において solute carrier family 2 (facilitated GLUT)、 member 4

(GLUT4)、 pyruvate kinase (Pk)、 citrate synthase (Cs)および Comp. I の mRNA

は、ELE および EGLP の長期投与により有意に増加した(p<0.05)。ND-EGLP 群は、

骨格筋における Idh3αの mRNA レベルの有意な増加を示した(p<0.05)。

HFD を摂取したラットの WATp は、ELE および EGLP の長期摂取によって Idh3

α、Ogdh 、Comp. I および Comp. V の mRNA の発現を有意に抑制した(p<0.05、

p<0.01、Table 13)。 WATp における GLUT4 の mRNA の発現は、それぞれの被験

物質の投与により有意に減少した(ELE： p<0.05、EGLP： p<0.001)。HFD を摂取

したラットの骨恪筋は、9%ELE の投与によって GLUT4 および Pk の mRNA のレベ

ルを有意に増加させた(p<0.05)。また、9%EGLP は GLUT4 および Idh3αの mRNA

の発現を有意に増加させた(p<0.05)。

27

Table 12. Gene expression analysis by real-time PCR in liver, WAT, muscle, and BAT after 90-day administration of ELE and EGLP under ND

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from ND, * p<0.05, *** p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from ND-3%

ELE, + p<0.05, (Tukey t-test). Significantly different from ND, † p<0.05, ††† p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from ND-3% EGLP, ‡

p<0.05 (Tukey t-test).

Gene Name Accession No. 3% ELE 9% ELE 3% EGLP 9%EGLP

1.36 ± 0.22

ND-ELE (fold of cont.) ND-EGLP (fold of cont.)

Liver

GckCsComp. IFATPCpt1α

WAT (perirenal)

GLUT4Idh3αOgdhComp. I

HSLPPARγAdiponectin

Soleus Muscle

Pk

Comp. V

GLUT4

Idh3αCsComp. ISCoSP3KCoT

BAT

UCP2

Cpt2

UCP3

1.36 ± 0.171.10 ± 0.351.34 ± 0.081.66 ± 0.296.30 ± 0.64

0.76 ± 0.273.38 ± 0.211.59 ± 0.1013.3 ± 1.03

1.75 ± 0.19

3.60 ± 0.341.83 ± 0.22

1.96 ± 0.21

8.93 ± 0.51

1.79 ± 0.20

1.84 ± 0.262.31 ± 0.301.50 ± 0.232.10 ± 0.161.35 ± 0.11

0.95 ± 0.37

2.78 ± 0.47

1.08 ± 0.26

†

† † † ‡

†

†

†

†

†

†

†

†

†

†

† † † ‡

† † † ‡

† † † ‡

† † † ‡

1.37 ± 0.17

0.61 ± 0.171.15 ± 0.23 6.28 ± 0.84

NM 012565NM 130755CB5449004NM 053580NM 031559

NM 012751NM 053638AI 412142CB5449004

NM 012859NM 013124NM 144744

NM 053297

NM 139106

NM 012751

NM 053638NM 130755CB5449004J 03621 J 02749

NM 019354

1.31 ± 0.141.22 ± 0.111.19 ± 0.081.24 ± 0.241.52 ± 0.19

0.72 ± 0.261.46 ± 0.261.10 ± 0.386.19 ± 0.65

0.32 ± 0.211.24 ± 0.15

1.64 ± 0.13

1.16 ± 0.31

1.56 ± 0.11

1.03 ± 0.591.77 ± 0.161.32 ± 0.241.54 ± 0.191.50 ± 0.18

1.07 ± 0.19

1.25 ± 0.181.35 ± 0.231.28 ± 0.071.39 ± 0.192.25 ± 0.13

0.80 ± 0.312.07 ± 0.201.45 ± 0.2710.39 ± 1.17

1.39 ± 0.101.90 ± 0.21

2.29 ± 0.26

1.91 ± 0.34

1.08 ± 0.482.31 ± 0.211.68 ± 0.102.20 ± 0.271.62 ± 0.21

0.53 ± 0.44

1.27 ± 0.191.11 ± 0.341.28 ± 0.101.31 ± 0.193.78 ± 0.54

0.67 ± 0.312.11 ± 0.381.36 ± 0.118.86 ± 1.09

1.35 ± 0.24

1.38 ± 0.262.46 ± 0.29

1.51 ± 0.181.49 ± 0.141.74 ± 0.231.21 ± 0.101.57 ± 0.191.29 ± 0.24

1.02 ± 0.31

NM 012930 1.01 ± 0.12 1.44 ± 0.16 2.09 ± 0.34

NM 013167 1.28 ± 0.16 1.69 ± 0.26 1.12 ± 0.22

**

*** +

** +

* +

*

***

*

*

*** +*

*

* +

**

*

*

**

*

†

†

†

†

†

†

†

†

* +

+

28

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from HFD, * p<0.05, *** p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from HFD-3%

ELE, + p<0.05, (Tukey t-test). Significantly different from HFD, † p<0.05, ††† p<0.001 (Tukey t-test). Significantly different from HFD-3% EGLP, ‡ p<0.05

(Tukey t-test).

6.04 ± 0.37

1.31 ± 0.10

1.01 ± 0.27

0.55 ± 0.160.87 ± 0.21

1.17 ± 0.13 1.59 ± 0.19

1.89 ± 0.35

0.18 ± 0.31 0.26 ± 0.23

2.20 ± 0.231.41 ± 0.12

1.16 ± 0.18

HFD-ELE (fold of cont.) HFD-EGLP (fold of cont.)

Liver

GckCsComp. IFATPCpt1α

WAT (perirenal)

GLUT4Idh3αOgdhComp. I

HSLPPARγAdiponectin

Soleus Muscle

Pk

Comp. V

GLUT4

Idh3αCsComp. ISCoSP3KCoT

BAT

UCP2

NM 012565NM 130755CB5449004NM 053580NM 031559

NM 012751NM 053638AI 412142CB5449004

NM 012859NM 013124NM 144744

NM 053297

NM 139106

NM 012751

NM 053638NM 130755CB5449004J 03621 J 02749

NM 019354

1.25 ± 0.071.89 ± 0.211.21 ± 0.101.26 ± 0.092.08 ± 0.34

0.88 ± 0.270.10 ± 0.080.38 ± 0.160.37 ± 0.19

3.52 ± 0.211.14 ± 0.13

1.48 ± 0.170.96 ± 0.290.90 ± 0.231.02 ± 0.171.57 ± 0.181.08 ± 0.10

1.01 ± 0.12

2.16 ± 0.123.15 ± 0.621.54 ± 0.181.66 ± 0.232.94 ± 0.41

0.70 ± 0.180.07 ± 0.080.22 ± 0.130.10 ± 0.09

1.43 ± 0.11

2.05 ± 0.28

1.09 ± 0.221.15 ± 0.111.88 ± 0.201.34 ± 0.11

1.49 ± 0.18

1.21 ± 0.131.89 ± 0.291.38 ± 0.121.33 ± 0.101.29 ± 0.17

0.19 ± 0.060.38 ± 0.290.57 ± 0.210.96 ± 0.23

0.98 ± 0.171.18 ± 0.161.34 ± 0.21

1.09 ± 0.111.38 ± 0.251.14 ± 0.231.26 ± 0.131.18 ± 0.131.49 ± 0.15

1.11 ± 0.28

1.50 ± 0.182.44 ± 0.451.77 ± 0.281.65 ± 0.211.42 ± 0.14

0.11 ± 0.120.24 ± 0.190.41 ± 0.180.51 ± 0.17

0.66 ± 0.101.33 ± 0.17

1.36 ± 0.131.60 ± 0.211.09 ± 0.181.30 ± 0.121.20 ± 0.191.65 ± 0.12

1.45 ± 0.25

Cpt2 NM 012930 2.11 ± 0.11 2.72 ± 0.28 2.18 ± 0.29 2.70 ± 0.36

UCP3 NM 013167 0.88 ± 0.43 1.13 ± 0.31 0.86 ± 0.49 1.09 ± 0.38

†

* +*

** +

*** +

*

*

***

*

*

*

* +

*

*

† ‡

†

†

†

†

†

†

†

†

† ‡

† † †

†

†

†

†

† † †

† † †

† † †* +

*******

******

* +* +* +

* +

************ +

* +

†

† † †

†

† † †

†

†

†

† † †

* * +

† † †

Gene Name Accession No. 3% ELE 9% ELE 3% EGLP 9% EGLP

Table 13. Gene expression analysis by real-time PCR in liver, WAT, muscle, and BAT after 90-day administration of ELE and EGLP under HFD

29

1111----3333----7777----2222 脂質代謝脂質代謝脂質代謝脂質代謝にににに関連関連関連関連するするするする遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現

ND を摂取したラットの肝臓の Idh3αおよび carnitine palmitoyltransferase 2

(Cpt2)の mRNA の発現は、ND-ELE および ND-EGLP 群で有意な増加を示し、これ

らの作用は用量依存性であった (p<0.05、p<0.01、Table 12)。肝臓の fatty acid

transport protein (FATP)のmRNA発現の増加は、ND-9%EGLP群において有意に

増加した(p<0.05)。WATp における hormone-sensitive lipase (HSL)の mRNA の発

現は、ND-3%ELE 群、ND-9%ELE 群および ND-9%EGLP 群において有意に増加

が抑制された(p<0.05)。

HFD 条件下のラットの肝臓において、β酸化に関与する遺伝子の FATP、

carnitine palmitoyltransferase 1α (Cpt1α)および Cpt2 の mRNA は、ELE および

EGLP の長期投与によって有意に増加した(p<0.05、p<0.01、Table 13)。腎周囲の

WATにおけるHSLのmRNAがHFD-ELEの投与により有意に増加するのに対して、

HFD-EGLP の投与により有意に減少した(p<0.05)。

1111----3333----7777----3333 ケトンケトンケトンケトン体体体体代謝代謝代謝代謝にににに関連関連関連関連するするするする遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現

ND 条件下のラットの骨格筋において、ELE の長期投与は、 succinyl-CoA

synthetase (SCoS)および peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase (P3KCoT)の mRNA

の発現を増加させた(p<0.05、Table 12)。一方で EGLP の長期投与は、SCoS の

mRNA レベルだけを増加させた(p<0.05)。

HFD 条件下のラットの骨格筋において、ELE の長期投与は、SCoS の mRNA レ

ベルを増加させた(p<0.05、Table 13)。一方で EGLP の長期投与は、P3KCoT の

mRNA レベルを増加させた(p<0.05)。

1111----3333----7777----4444 PPARγγγγ およびおよびおよびおよびアディポネクチンアディポネクチンアディポネクチンアディポネクチンのののの遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現

WATp において、9%ELE および 9%EGLP の長期投与は、PPARγの mRNA を増

30

加させ、そしてこの遺伝子発現は、ND 条件下の ELE 群よりも EGLP が高かった

(p<0.05、Table 12)。ELE および EGLP の間にアディポネクチンの mRNA の発現増

加に差異は観察されなかったが、9%ELE および 9%EGLP のそれぞれからもたらされ

るアディポネクチンの mRNA が有意に増加した(p<0.05)。

HFD 負荷下のラットの WATp において、ELE は PPARγおよびアディポネクチンの

mRNA の発現を有意に増加した(p<0.05、Table 13)。一方で EGLP は、アディポネク

チンの mRNAの発現を増加させるが(HFD-9%EGLP：p<0.05)、PPARγのmRNAの

発現に影響を与えなかった。

1111----3333----7777----5555 脱共役脱共役脱共役脱共役タンパクタンパクタンパクタンパク質質質質のののの遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現遺伝子発現

ND 条件下のラットの BAT において、ELE 摂取は uncoupling protein (UCP) 3 の

mRNAのレベルを著しく増加させるように導くが(p<0.05、Table 12)、一方で UCP2に

おいて減少する傾向にあり、EGLP の摂取でこれらの mRNA の増加はなかった。

HFD 条件下のラットの BAT において、9%ELE および 9%EGLP の長期投与は、

UCP2のmRNAレベルについて有意な増加をもたらした(p<0.05、Table 13)。しかし、

UCP3 の mRNA の発現に影響を与えなかった。

1111----3333----8888 考察考察考察考察

ELEおよび EGLP の長期投与によって影響を受けた代謝に関連する遺伝子発現

について Fig. 4 に示す。リアルタイム PCR の実験により、ELE および EGLP の長期

投与は、ND 負荷下のラットの骨格筋における解糖系の活性化と、肝臓における

TCA サイクルおよび電子伝達系を有意に増加することが確認された。一方、WAT に

おいて TCA サイクルおよび電子伝達系の活性は、HFD の条件下で減少した。

GLUT4 の mRNA 発現は、それぞれの被験食投与下、骨格筋で増加、WAT で減

少した。腎周囲 WAT に対する ELE および EGLP の効果は、被験食の脂質

31

負荷状態によって異なり、HFD 条件下は WATp 細胞内に TG の貯蔵を増加させ、

大きな脂肪細胞を形成させる。一方、ELE および EGLP は脂肪細胞での ATP 産

生を低下させ、大きな脂肪細胞の形を維持するのに必要な ATP 不足による脂肪細

胞の崩壊を誘導していることが推測された。骨格筋におけるグルコースの顕著な消

費が、ND あるいは HFD の条件下の ELE および EGLE の投与により循環するグル

コース値を減少させていることが示唆された。

Kavitha らは、血中の TG、FFA およびコレステロール値の増加が、肥満と脂質異

常に伴う疾患に直接的に関与していることを報告している 26)。前述の実験により、

ND および HFD の条件下の 9% ELE あるいは 9% EGLP のラットへの長期投与が、

血中 TGを減少させることを明らかにした。著者の研究グループは、ELEの抗高脂血

症効果について、脂質の単回投与でも血中 TG 値の増加を有意に抑制することを

報告している 27)。さらに Lee らは、杜仲葉抽出エキスの投与がハムスターの肝臓の

脂質代謝を促進し、血中 TG およびコレステロール値を減少させることを報告してい

る 14)。本研究では、血中 TG に対する ELE および EGLP の長期投与による抑制

作用は、ND よりも HFD を摂取したラットにおいて顕著であったことを認めた。従って、

ELE および EGLP の投与にかかわらず、食餌から得られる血中 TG の吸収および肝

臓での脂質代謝、特に脂肪酸のβ酸化の活性化に影響を与えていることが示唆さ

れた。つまり HFDを摂取したラットにおいて、肝臓への脂肪酸の取り込みは ELEおよ

び EGLPによって高められ、循環する FFAレベルを減少させ後に脂肪酸のβ酸化お

よび ATP 産生の増加を伴っていると考えられた。

ELE および EGLE の長期投与は、インスリン抵抗性あるいは脂質異常を改善する

ために内臓脂肪の蓄積状態に依存して、PPARγおよびアディポネクチンの mRNA

の発現を引き起こすが、その一方で ND あるいは HFD のいずれの条件下のラットの

WAT において脂肪酸のβ酸化に影響を与えなかった。実際に、前述の実験で ELE

および EGLP の長期投与は、HFD 条件下で血中 FFA 値を減少する傾向にあり、ま

32

た血中アディポネクチン値を有意に増加させた。Choi らは、杜仲葉抽出物が HFD

負荷下で肝臓の脂肪酸合成酵素および HMG-CoA 還元酵素の活動を抑制し、ま

た肝臓のβ酸化活性を増加させた結果、:血中 FFA 値および血中コレステロール値

を減少させたと報告している 16)。さらに本実験により、ND あるいは HFD のいずれの

摂取条件にかかわらず、ELE あるいは EGLP のラット長期投与により、骨格筋のケト

ン体の使用と肝臓の脂肪酸β酸化の活性を引き起こすことが示唆された。

UCP1 (thermogenin)は、BAT において高発現し、nonshivering thermogenesis に

関与している 28)。本実験では、ラットの BAT における UCP2 の mRNA レベルは ND

条件下の ELE の投与によって減少し、HFD 条件下の ELE および EGLP の投与に

よって増加した。このことから UCP2 における mRNA の発現の増加は、ミトコンドリア

から得られた反応酸素の生成を最小にするために機能しているのではないかと推測

される。ND 条件下のラットの BAT は、ELE および EGLP の長期投与により、脂肪酸

酸化と関連付けられる UCP3 の mRNA の発現を増加させたが、その一方で HFD

条件下では有意な差は認められなかった。

前述の実験で、インスリン抵抗性を誘発するとされるレジスチンは、ND 条件下の

EGLP、HFD 条件下の ELE および EGLP で減少することが観察された。これは、これ

までの結果を含めて、杜仲葉の長期投与によるアディポサイトカインの血中レベルに

おける変化から考察して、高インスリン血症の改善につながる可能性があるということ

を示唆している。

以上の結果、杜仲葉は全身レベルでの代謝の活性化 (肝臓や白色脂肪組織で

の脂質代謝の促進および骨格筋での糖の利用促進 )により、内臓脂肪の蓄積を抑

制していると考えられる。

33

Acetyl CoA

Acyl CoA

ββββoxidation

Electron transfer system

AccelerationGlucose

Glycolytic system

GLUT4

Glucose

Glucose

Liver Skeletal

Muscle

Perirenal

WAT

Blood FFA

Blood FFA

ND-ELE/EGLP

HFD-ELE/EGLP

PPARγγγγ

Adiponectin

FATP

Inhibition

UCP2

Heat

UCP3

UCP1

BAT

SCoS

P3KCoTKetone body

TG FA

GLUT4GLUT4

TCA cycle


Acetyl CoA

Acetyl CoAββββoxidation

Cpt1ααααCpt2

Pk

Cs

Idh3αααα, Ogdh, Comp. I, V

Acyl CoA

TCA cycle

Pyruvate Idh3αααα

Idh3αααα, Comp. I

Acetic acid

Acetoacetic acid

Idh3αααα, Comp. I


Cs

HSL

EGLP

EGLP EGLP

FA

Comp. I

TCA cycle

Ketone body

Blood Adiponectin

Fig. 4. Diagrammatic illustration of gene expression related to metabolism affected by chronic administration

of Eucommia leaves in rats fed a ND or HFD.

34

第第第第 1111 章章章章のののの小括小括小括小括

本試験では、HFD 負荷下の ICR 雌性マウスにおける加工法の異なる杜仲葉を投

与した際の抗肥満作用の差異の知見から 29)、次の試験を実施した。すなわち、

HFD を長期投与下の SD 雄性ラットにおける ELE および EGLP の投与の影響につ

いて検討を行った。また、同様に ND に ELE および EGLP を混餌した群とも比較を

行った。

投与期間中の体重増加量、投与終了後の WAT 重量、血中 TG 濃度、インスリン

濃度および血糖値を測定した。また、メタボリックシンドロームに関係性が深いと考え

られている生理活性物質であるアディポネクチン、TNF-α、レジスチンおよびレプチ

ンを測定した。その結果、実験群は 90 日間の投与期間中、HFD に ELE および

EGLP を混餌して摂取することにより体重および白色脂肪組織 (WAT)重量の増加

を有意に抑制し、その効果はいずれも用量依存的であった。一方、ND 混餌群では

これらを抑制する効果がみられなかったことから、HFD が起因する肥満に対して杜

仲葉は、高い効果があることが示唆され、ND においては影響が少ないことが考えら

れた。また、血中脂質は、血中 TG 濃度が顕著に抑制された。さらに、インスリン濃度

はいずれの投与群でグルコース値を正常値に維持しながらインスリン濃度の低下を

示し、インスリン抵抗性の改善が確認された。また、アディポネクチン濃度の上昇、Ｔ

ＮＦ-αおよびレジスチンの低下が観察され、メタボリックシンドロームに関与する生理

活性物質のバランスが整うことが示唆された 30)。

投与終了後のラットの WATp、BAT、筋組織および肝臓を摘出し、リアルタイム

PCR 法で定量した。数値化は同じベースの HFD あるいは ND の群内で、被験物質

を混合した群および無混合群の対比で遺伝子発現量を比較し、有意差が認められ

たものを増減ありとした。遺伝子発現量の増減より、脂質、糖質の代謝メカニズムを

予測した。ELE および EGLP を摂取することによって、肝臓におけるβ酸化の活

性化が認められた。また、その作用は ND および HFD いずれでも維持された。こ

35

のことから、生成されたケトン体は骨格筋で積極的に利用されているとことが示唆さ

れた。また、骨格筋において糖を利用した TCA サイクルと電子伝達系の活性化を

認め、この作用は EGLP では HFD 負荷下でも維持された。腎周囲 WAT に対

する ELE および EGLP の効果は、被験食の脂質負荷状態によって異なり、

HFD 条件下は WATp 細胞内に TG の貯蔵を増加させ、大きな脂肪細胞を形成さ

せる。一方、ELE および EGLP は脂肪細胞での ATP 産生を低下させ、大きな脂肪

細胞の形を維持するのに必要な ATP 不足による脂肪細胞の崩壊を誘導しているこ

とが推測される。WATp において、EGLP は TG の分解、β酸化、TCA サイクル、電

子伝達系の活性化を示した。一方、ELE はβ酸化、TCA サイクル、電子伝達系を

促進した。

血清のコレステロールや TG が上昇する病態が高脂血症であり、様々な治療薬が

開発されている 31)。スタチンに代表される HMG-CoA 還元酵素阻害薬は、メバロン

酸の生合成競合阻害を介してコレステロール生合成を抑制し、肝細胞中のコレステ

ロール含量を低下、細胞表面への LDL 受容体発現を促進して LDL 降下作用を示

す。フィブラート系薬は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体 PPAR を介するものと

考えられ、リポ蛋白の代謝促進、肝臓のβ酸化、により TG を低下させる。ニコチン

酸誘導体は、脂肪細胞における脂肪分解を抑制し、脂肪酸低下による TG 合成を

抑制する。陰イオン交換樹脂 (レジン)は、胆汁酸の小腸から再吸収を阻害すること

によりコレステロールを低下させる。一方、杜仲葉は、 ① 肝臓での脂質代謝の活

性化およびケトン体の生成 ②筋肉でのケトン体の利用促進および糖の利用促進

③脂肪組織での ATP 合成低下および脂質代謝の活性化による脂肪細胞の小型化

により、血中脂質およびアディポサイトカインを改善すると考えられる。

以上の結果、杜仲葉は全身レベルでの代謝の活性化 (肝臓や白色脂肪組織で

の脂質代謝の促進および骨格筋での糖の利用促進 )により、内臓脂肪の蓄積を抑

制していると考えられた 30)。

36

第第第第２２２２章章章章杜仲緑色葉杜仲緑色葉杜仲緑色葉杜仲緑色葉のののの成分研究成分研究成分研究成分研究

2222----1111 これまでのこれまでのこれまでのこれまでの杜仲葉成分研究経過杜仲葉成分研究経過杜仲葉成分研究経過杜仲葉成分研究経過

本論文の成分研究以前には、1974 年に Bianco らが 4)、杜仲葉に eucommiol の存在を

明らかにしている。また、 1986 、 1987 年に加藤らは 5, 6) 、 aucubin 、 asperuloside 、

hydroxypinoresinol、protocatechuic acid、astragalin、isoquercitrin を分離した。さらに、1988

年に難波らは 7) catechol 、 3-(3-hydroxyphenyl) propionic acid 、

trans-4-hydroxycyclohexanone-1-calboxylic acid 、 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)

propane-1,2,3-triol および 1-deoxyeucommiol を分離、それらの構造を明らかにした。また、

1993 年野原らのグループは 8-10) geniposidic acid および syringaresinol di-O-glucoside を

得、1998 年には geniposidic acid を含む 8 種のイリドイド化合物、7 種のフラボノイド化合

物、 5 種のフェノール誘導体および 2 種のトリテルペン化合物を得た。2004 年 Sun らは

32)、rutin を単離している (Fig. 5)。しかしながら、著者が注目している EGLP の系統立てた

詳細な成分研究は行われていなかった。

Fig. 5. Strucutures of known compounds from leaves of Eucommia ulmoides Oliv.

OHOH

OH

OHOH

R = R = R = H

eucommiol

epieucommiol1-deoxyeucommiol

asperulosidic acid

deacetyl asperulosidic acid

scandoside 10-O -acetate

geniposidic acid

R2 = OAc

R2 = OH

R2 = OAc

R2 = OH

R1 =

R1 =

R1 =

R1 = H

asperuloside aucubin

OH

OH

HR

HO

O

OO

AcO

H

HOGlc

O

HO

H

HOGlc

HO

O

COOH

R2

H

HOGlc

R1

R = H quercetin

R = glc isoquercitrin

R = glc-xyl quercetin 3-O-sambubioside

R = glc-rha rutin

R = H kaempferol R = glc astragarin

R = glc-Ac kaempferol 3-O-6"-acetyl-glucoside

R = glc-rha kaempferol 3-O-rutinoside

O

OR

OOH

HO

OH

O

OR

OOH

HO

OH

OH

R1 =OH R2 =OH R3 =OH R4 =H pyrogallol

R1 =OH R2 =OH R3 =H R4 =COOH protocatechuic acid

R1 =OH R2 =H R3 =H R4 =CH=CHCOOH p-trans coumaric acid

R1 =OH R2 =OH R3 =H R4 =H catechol

R1 =OH R2 =OH R3 =H R4 =CH2CH2COOH 3-(3, 4-dihydroxyphenyl)-propanoic acid

R1 =OH R2 =OMe R3 =H R4 =CH(OH)CH(OH)CH2OH 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propane-1, 2, 3 triol

R1 =H R2 =OH R3 =H R4 =CH2CH2COOH 3-(3-hydroxyphenyl)-propanoic acid

OH

OR

C

O

O

HO OH

HO COOHR2

R1

R3

R4

R =H chlorogenic acid

R =CH3 3-O-feruloyl quinic acid

syringaresinol di-O-glucoside hydroxypinoresinol

O

O

HH

OGlc

OMe

OMe

OMe

GlcO

MeOO

O

OHH

OH

OMe

HO

MeO

ulmoidol ursolic acid

COOH

HO

HO

HO

O O CO

trans-4-hydroxycyclohexane

-1-carboxylic acid

COOHHO

geniposidic acid

37

EGLP （（（（577.6 g））））

H2O extract (10h, 65℃)

H2O ext. (EGLE: 267.4 g)

Diaion HP20

(H2O, 30 ％ MeOH, 50 ％ MeOH, 80 ％ MeOH, MeOH)

H2O 30 ％ MeOH 50 ％ MeOH 80 ％ MeOH MeOH

(Fr. 1, 135.5 g) (Fr. 2, 17.3 g) (Fr. 3, 9.0 g) (Fr. 4, 2.4 g) (Fr. 5, 179 g)

(2.0 g) (1.0 g) (3.8 g) (2.0 g) (2.2 g)

MCｌ CHP-20P silica gel Chromatrex ODS Sephadex LH20

(H2O, MeOH) (C:M:W=20:1:0, (15 ％ MeOH, 30 ％ MeOH, (MeOH)

9:1:0.1, 8:2:0.2, 0:1:0) 50 ％ MeOH, MeOH)

Chromatrex ODS

(25 ％ MeOH, 35 ％ MeOH,

45 ％ MeOH, MeOH)

Fr. 2b-1 EU-1

(275 mg) (20 mg) (259 mg) (701 mg) (42 mg)

Chromatrex ODS

(H2O, 5 ％ MeOH, 10 ％ MeOH, EU-9 EU-10

15 ％ MeOH, MeOH) (40 mg) (117 mg)

Fr. 2b-6-1 EU-5 EU-6 5―8 EU-14 11―20

(32 mg) (2 mg) (4 mg) (18 mg) (43 mg) (12 mg) (4 mg) (404 mg)

Chromatrex ODS

(H2O, 5 ％ MeOH,

Fr. 2a-1―3 EU‐‐‐‐1 10 ％ MeOH,

(12 mg) (275 mg) (109 mg) (404 mg) 15 ％ MeOH, MeOH)

silica gel silica gel EU-15

(C:M:W=8:2:0.2, 0:1:0) (C:M:W=10:2:0.1, (4 mg)

8:2:0.2, 7:3:0.5, 0:1:0)

Fr. 2a-5-1,2 Fr. 2a-7-1 EU-6 3―5


HPLC (ODS, HPLC (ODS, Chromatrex ODS

20 ％ MeOH) 20 ％ MeOH) (H2O, 10 ％ MeOH, 20 ％ MeOH,

30 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, MeOH)

EU-4 EU-2 EU-6 EU-12 Sephadex LH20

(4 mg) (6 mg) (8 mg) (37 mg) (50 ％ MeOH, MeOH)

Fr. 3-1 EU-10 EU-7


silica gel Chromatrex ODS

(C:M:W=15:1:0, (30 ％ MeOH, 40 ％ MeOH,

10:2:0.1, 0:1:0) 50 ％ MeOH, MeOH)

EU-13

Fr. 1-1 EU-5 EU-6 6―11 12, 13 (3 mg)

(31 mg) (760 mg) (485 mg) (216 mg) (255 mg) (54 mg) (37 mg)

Fr. 3-6-1, 2 EU-8 8－10

silica gel (42 mg) (155 mg) (8 mg) (94 mg) (4 mg) (12 mg) (15 mg)

Sephadex LH20 (C:M:W=8:2:0.2,

(H2O, MeOH, H2O：acetone) 7:3:0.5, 0:1:0) (10 mg) HPLC (ODS,

50 ％ MeOH)

Chromatrex ODS HPLC (ODS,

(H2O, 5 ％ MeOH, 10 ％ MeOH, MeOH) 35 ％ MeOH)

EU-3 EU-12 EU-9 EU-11

(9 mg) (4 mg) (2 mg) (6 mg)

4, 5 6 7

3

3 4 5 6

7

10

5, 6 7

10

2 3

4 5 6 7

2 3, 4 5, 6

2222----2222 抽出抽出抽出抽出・・・・分離分離分離分離

EGLP を熱水抽出し、high porous polystyrene gel (Diaion HP 20 and MCI gel CHP 20P)、

reversed-phase silica gel (Chromatrex ODS) 、 normal-phase silica gel 、 dextran gel

(Sephadex LH20) を担体とするカラムクトマトグラフィーならびに ODS を担体とする

HPLC で分離・精製し、新規化合物 3 種を含む 15 種の化合物を得た(Chart 1)。

Chart 1

38

2222----3333 既知化合物既知化合物既知化合物既知化合物のののの化学構造化学構造化学構造化学構造

2222----3333----1111 EU-1 (1)

EU-1 (1) は、[α]D −91.1º (MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive FAB-MS m/z

415 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ 5.95 (1H, s,

H-1) に 1 個の acetal proton、δ 5.73 (1H, s, H-7) および 7.30 (1H, d, J=1.2 Hz, H-3) に 2

個の olefinic proton、δ 3.31 (1H, s, H-9)、3.68 (1H, m, H-5) および 5.56 (1H, d, J=6.7 Hz,

H-6) に 3 個の methine proton、δ 4.65 (1H, d, J=14.3 Hz, H-10a)、δ 4.79 (1H, d, J=14.3

Hz, H-10b) に 2 個の methylene proton、δ 2.08 (3H, s, OCH3) に 1 個の acetyl group、

δ 4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1) に 1 個の anomeric proton および δ 3.20 (1H, dd, J=7.9,

9.2 Hz, glc H-2)、3.29 (1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, glc H-4)、3.39 (2H, m, glc H-3, 5)、3.68 (2H, m,

H-5, glc H-6a)、3.92 (1H, dd, J=2.1, 11.0 Hz, glc H-6b)、4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1) に

glucose 由来の signal が観察され、イリドイド配糖体の monoglucoside と推定された。そこ

で、13C-NMR スペクトルを文献値

33) と比較した結果、本化合物は、asperuloside と同定し

た(Fig. 6)。

O

C

O CH

H

O

O

HOHO

OH

HO

93.4

150.3

105.6

37.586.3129.0

144.3

45.3

62.8

20.6

100.974.7

77.971.6

78.4

61.9

O

O

H3C

172.5

172.3

1

2

3

4

56

7

8 9

10

11

1

34 5

6

O

Fig. 6. Strucuture and 13

C-NMR Spectral Data (in CD3OD) for 1.

2222----3333----2222 EU-2 (2)

EU-2 (2) は、[α]D +193.6º (MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive FAB-MS に

て m/z 455 に [M+Na]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは 1 に比

べ６位の methine proton (δ 5.56) が高磁場シフトし、δ 4.85 (1H, m, H-6) が観察された以外

39

は、ほほ一致したスペクトルを示した。そこで、13C-NMR スペクトル(Fig. 7) を文献値 33)と比

較したところ、2は、1のγ-ラクトンが開環した asperulosidic acid と同定した。

O

OHH

H

O

O

HOHO

OH

HO

COOH

OC

O

H3C

101.7

155.1

108.8

46.4

75.5132.8

145.9

63.3172.520.7

100.775.0

78.0

71.678.5

63.8

42.6

*

*Not detected

Fig. 7. Structure and 13


2222----3333----3333 EU-3 (3)

EU-3 (3) は、[α]D +30.0º (50% MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive FAB-MS

にて m/z 455 に [M+Na]+ の molecular ion peak を示した。

1H-NMR スペクトルでは、2

のそれとよく類似した。また、2 の 13

C-NMR スペクトルと比較したところ、C-6 が 7 ppm 程低

磁場シフトしていることが観察されたことから、本化合物は、2 と 6 位の立体配置の異なる

scandoside 10-O-acetate と推定され、さらに文献値 33)と比較し同定した(Fig. 8)。

O

OHH

H

O

O

HOHO

OH

HO

COOH

OC

O

H3C99.0

153.446.4

82.7132.4

142.0

47.6

63.3172.620.7

100.5

74.978.0

71.67 8.4

62.7

*

*Not detected


C-NMR Spectral Data (in D2O) for 3.

40

2222----3333----4444 EU-4 (4)

EU-4 (4) は、[α]D −51.1° (50% MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive ESI-MS

にて先の 2 より 42 mass unit 小さい m/z 413 に [M+Na]+ の molecular ion peak を示し

た。1H-NMR スペクトルならびに

13C-NMR スペクトルでは、1 個の acetyl group 由来の

signal が消失しているのを除き、2 と酷似したことから、4 は、2 の 10 位の acetyl group

の消失した deacetyl asperulosidic acid と推定され、文献値と比較し同定した(Fig. 9)33)。

O

OHH

H

O

O

HOHO

OH

HO

COOH

HO100.4

149.2

117.1

47.483.3130.6

147.3

48.7

61.6

176.0

99.675.0

77.9

71.578.3

62.6



2222----3333----5555 EU-5 (5)

EU-5 (5) は、[α]D +12.0° (MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive FAB-MS m/z

375 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スぺクトルでは 2 に比べ、 1

個の oxygenated methine proton が消失し、代わりに δ 2.11 (1H, dd, J=7.9, 15.9 Hz, H-6a)、、、、

2.83 (1H, dd, J=9.2, 15.9 Hz, H-6b) に 2 個の methylene proton が観察された。そこで、

13C-NMR スペクトルを文献値 33) と比較した結果、5 は、2 の C-6 の水酸基の消失した

geniposidic acid と同定した(Fig. 10)。

41

O

H

H

O

O

HOHO

OH

HO

COOH

HO98.3

152.9

113.3

36.839.8128.5

144.9

47.1

61.5

171.3

100.474.9

77.9

71.678.4

6 2.7



2222----3333----6666 EU-6 (6)

EU-6 (6) は、[α]D −16.5° (50% MeOH) を示す白色粉末として、得られ positive FAB-MS

では m/z 369 に [M+Na]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ

2.65 (1H, m, H-5)、2.89 (1H, dd, J=7.9, 7.9 Hz, H-9)、5.76 (1H, s, H-7) および 6.30 (1H, dd,

J=1.8, 6.1 Hz, H-3) に 4 個の methine proton、δ 4.17 (1H, d, J=15.9 Hz, H-10a) ならびに

4.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-10b) に 2 個の methylene proton、δ 3.21 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz,

glc H-2)、3.26–3.40 (3H, m, glc H-3, 4, 5)、3.77 (1H, m, glc H-6a) および 3.86 (1H, d,

J=12.2 Hz, glc H-6b) に glucose 由来の signal、δ 4.67 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1) に 1 個

の anomeric proton、δ 4.95 (1H, d, J=6.7 Hz, H-6) に 1 個の oxygenated methine proton な

らびに δ 5.09 (1H, br s, H-1) に 1 個の acetal proton が観察された。さらに 13

C-NMR ス

ペクトルでは、計 15 本の carbon signal が観察されたことから、文献値 4)と比較した結果、

本化合物は aucubin と同定した(Fig. 11)。

42

　 1a

2a

3b

4b

5a

6b

C-1 93.4 101.7 99.0 100.4 98.3 97.8

3 150.3 155.1 153.4 149.2 152.9 141.6

4 105.6 108.8 * 117.1 113.3 105.8

5 37.5 42.6 46.4 47.4 36.8 48.0

6 86.3 75.5 82.7 83.3 39.8 82.9

7 129.0 132.8 132.4 130.6 128.5 130.4

8 144.3 145.9 142.0 147.3 144.9 148.0

9 45.3 46.4 47.6 48.7 47.1 46.3

10 61.9 63.3 63.3 61.6 61.5 61.4

11 172.5 * * 176.0 171.3 -

OCOCH3 172.3 172.5 172.6 - - -

OCOCH3 20.6 20.7 20.7 - - -

Glc C-1 100.9 100.7 100.5 99.6 100.4 100.0

2 74.7 75.0 74.9 75.0 74.9 74.9

3 78.4 78.0 78.0 77.9 77.9 78.0

4 71.6 71.6 71.6 71.5 71.6 71.6

5 77.9 78.5 78.4 78.3 78.4 78.3

6 62.8 63.8 62.7 62.6 62.7 62.7

*Not detected

O

OHH

H

O

O

HOHO

OH

HO

HO

97.8

141.6

105.8

48.082.9130.4

46.3

61.4

100.074.9

78.0

71.6

78.3

62.7

148.0



Table 14. 13

C-NMR Spectral Data for 1– 6 (in CD3ODa or D2O

b).

43

2222----3333----7777 EU-7 (7)

EU-7 (7) は、[α]D +7.3° (DMSO) を示す淡黄色粉末として得られ、positive FAB-MS で

m/z 465 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ 6.86 (1H,

d, J=9.2 Hz, H’-5)、7.59 (1H, d, J=2.0 Hz, H’-2) に 3, 4 二置換 phenyl 由来の signal、δ

6.21 (1H, J=1.8 Hz, H-6)、6.41 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8)に meta coupling した 2 個の

aromatic proton ならびに δ 5.47 (1H, J=7.3 Hz, glc H-1) に anomeric proton、δ 3.10–3.50

(4H, m, glc H-2, 3, 4, 5)、3.59 (1H, d, J=11.0 Hz, glc H-6) に glucose 由来の signal が観

察された。さらに、13C-NMR スペクトルの文献値 34)との比較から 7 は、isoquercitrin と同定

した(Fig. 12)。


C-NMR Spectral Data (in DMSO-d6) for 7.

2222----3333----8888 EU-8 (8)

EU-8 (8) は、[α]D −140.6° (DMSO) を示す淡黄色粉末として得られ、positive FAB-MS

で m/z 597 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ 4.60

(1H, d, J=7.3 Hz, xyl H-1)に 1 個の xylopyranose 残基由来の signal が観察されるのを除

き、7 のデータとよく一致した。13C-NMR スペクトルを 7 と比較したところ glucopyranosyl

基の C-2 の carbon signal が 7.7 ppm 低磁場シフト、1 位が 2.4 ppm 高磁場シフトして

いるのが観察された。従って本化合物は、 isoquercietin の glucopyranose の 2 位に

44

xylopyranose の結合した quercetin 3-O-sambubioside と推定し、さらに文献値 35)と比較し同

定した(Fig. 13)。



2222----3333----9 9 9 9 EU-9 (9)


で m/z 633 に [M+Na]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、 1 個

の xylopyranosyl 基由来の signal が消失した代わりに δ 1.00 (1H, d, J=6.1 Hz, rha H-6)、

4.39 (1H, s, rha H-1) に 1 個の rhamnopyranosyl 基由来の signal が観察された。

13C-NMR スペクトルを 8 と比較すると、 glucose の 6 位に glycosylation shifts が観測さ

れた。また、 xylopyranosyl 基の代わりに rhamnopyranosyl 基が glucopyranosyl 基に結

合していることが判明した。以上のことから、本化合物は rutin と同定した(Fig. 14)。

45



2222----3333----10101010 EU-10 (10)


で m/z 449 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ 6.96

(2H, d, J=7.9 Hz, H’-3, 5)、8.10 (2H, d, J=7.9 Hz, H’-2, 6) に 2 組の 1,4 二置換 phenyl

由来の signal、δ 6.27 (1H, s, H-6)、6.49 (1H, s, H-8) に 2 個の aromatic proton、δ 5.51

(1H, d, J=6.7 Hz, glc H-1) に 1 個の anomeric proton 由来の signal が観察された。そこ

で、13C-NMR スペクトルを文献値 34)と比較し、本化合物は、astragalin と同定した(Fig. 15)。



46

2222----3333----11111111 EU-11 (11)

EU-11 (11) は、[α]D −77.2° (DMSO) を示す淡黄色粉末として得られ、HR positive

ESI-MS m/z 617.1498 (Calcd for C27H30NaO15: 617.1482) の解析から C27H30O15 の分子式

を得た。1H-NMR スペクトルでは、δ 0.99 (1H, d, J=6.1 Hz, rha H-6)、4.39 (1H, s, rha H-1)

に 1 個の rhamnopyranosyl 基由来の signal が観察されるのを除き、 10 のデータとよく

一致した。そこで、13C-NMR スペクトルと文献値 34) と比較し、本化合物は、kaempferol

3-O-rutinoside と同定した(Fig. 16)。



47

　 7 8 9 10 11

C-2 156.3 156.2 156.5 156.2 156.7

3 133.4 133.0 133.3 133.2 133.2

4 177.4 177.4 177.3 177.3 177.3

5 161.2 161.3 161.2 161.2 161.1

6 98.6 98.0 98.6 99.6 98.7

7 164.1 164.0 164.0 164.1 164.3

8 93.5 93.8 93.5 95.4 93.7

9 156.2 155.4 156.4 156.2 156.4

10 104.0 103.9 103.9 103.9 103.8

C-1` 121.2 121.2 121.1 120.7 120.8

2` 115.2 115.2 115.2 130.7 130.7

3` 144.8 144.9 144.7 115.0 115.0

4` 148.4 148.5 148.4 159.8 159.8

5` 116.2 116.0 116.2 115.0 115.0

6` 121.5 121.8 121.5 130.7 130.7

Glc C-1 101.0 98.6 100.7 100.9 100.7

2 74.1 81.8 74.0 74.0 74.1

3 76.5 76.0 76.4 76.3 76.3

4 69.9 69.6 70.5 69.8 70.6

5 77.5 77.5 75.9 74.1 75.7

6 61.0 60.0 66.9 60.7 66.8

Xyl C-1 100.4 Rha C-1 101.2 Rha C-1 101.3

2 73.8 2 70.2 2 70.2

3 76.8 3 70.0 3 69.9

4 69.4 4 71.8 4 71.8

5 65.5 5 68.2 5 68.2

6 17.6 6 17.6

Table 15. 13

C-NMR Spectral Data for 7—11 (in DMSO-d6, 125 MHz).

48

C

O

O

OH

HO

HOOC

HO OH

OH

75.1

40.673.1

72.7

69.4

38.9

127.9

115.2

146.8

148.3

116.5

122.9

146.8

115.7

169.2

172.1

1

23

4

5 6

1'2'

3'4'

5'

6'

7'

8'

9'

2222----3333----12121212 EU-12 (12)

EU-12 (12) は、[α]D −26.1° (MeOH) を示す白色粉末として得られ、positive FAB-MS で

m/z 355 に [M+H]+ の molecular ion peak を示した。1

H-NMR スペクトルでは、δ 1.93–2.12

(4H, m, H2-2, H2-6) に 2 組の methylene protons、δ 6.29 (1H, d, J=15.7 Hz, H’-8)、7.56

(1H, d, J=15.7 Hz, H’-7) に trans coupling した 2 個の olefinic protons、δ 3.67 (1H, m,

H-4)、 4.13 (1H, s, H-5)、 δ 5.42 (1H, m, H-3) に 3 個の oxygenated methine protons、

6.78 (1H, d, J=8.6 Hz, H’-6)、6.94 (1H, dd, J=8.5, 1.8 Hz, H’-5)、7.04 (1H, s, H’-2) に 3 個

の aromatis protons が観察された。さらに、13C-NMR スペクトルでは、16 個の carbon

signal を与えたことから、文献値 36)と比較したところ、12 は、chlorogenic acid と同定した

(Fig. 17)。



2222----4444 新規化合物新規化合物新規化合物新規化合物のののの化学構造化学構造化学構造化学構造

2222----4444----1111 EU-13 (13)

EU-13 (13) は、[α]D +99.1º (MeOH) を示す白色粉末として得られ、酸加水分解で単糖と

して D-glucose のみを検出した。また、HR positive ESI-MS m/z 437.1076 [M+Na]+ (Calcd

49

H C : Selected HMBC

for C18H22NaO11: 437.1059) の解析から、C18H22O11 の分子式と判明した。1H-NMR スペクト

ルでは、δ 5.90 (1H, s, H-7) に 1 つの olefinic proton、5.87 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3)、5.55 (1H,

d, J=7.3 Hz, H-6)、3.72 (1H, m, H-5)、3.54 (1H, dd, J=2.5, 12.8 Hz, H-4)、3.30 (2H, d, J=8.5

Hz, H-9) に 5 個の methine proton、δ 5.67 (1H, d, J=1.2 Hz, H-1)、5.87 (1H, d, J=2.4 Hz,

H-3) に 2 個の acetal proton、δ 4.85 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b)、4.78 (1H, d, J=14.7 Hz,

H-10a) に 2 個の methylene proton、δ 5.32 (1H, d, J=7.3 Hz, glc H-1) に anomeric proton、

δ 4.60 (1H, dd, J=2.1, 12.2 Hz, glc H-6b)、4.39 (1H, dd, J=5.5, 11.6, glc H-6a)、4.29 (1H, dd,

J=8.6, 9.2 Hz, glc H-3)、4.23 (1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, glc H-4)、4.03 (2H, m, glc H-2, 5) に 1

個の β-D-glucopyranosyl 基由来の proton が観察された。さらに、13C-NMR スペクトルで

は、δ 95.8、91.9 に 2 個の acetal carbon signal、δ 178.5 に carboxylic carbon signal、δ

143.7、129.3 に 2 個の olefinic carbon signal、δ 86.9、61.0 に 2 個の oxygen-bearing

carbon signal、δ 45.5、38.3、35.3 に 3 個の methine carbon signal、δ 170.3、20.5 に 1 個

の acetyl carbon signal、δ 99.0, 80.3, 75.8, 71.2, 79.9, 62.6 に β-D-glucopyranosyl 基由来

の carbon signal を含む計 18 本の carbon signal を示した。また、HMBC スペクトルにて

H-3 と glc C-2 間、glc H-1 から C-1 に相関が見られたことから(Fig. 18)、13 は、Fig. 18

に示すような β-D-glucopyranose の 1 位と 2 位とイリドイド骨格の 1 位と 3 位が、エーテ

ル結合でつながった 7 員環を有する asperuloside 関連イリドイド配糖体と推定された。

Fig. 18. HMBC Spectrum and 13

C-NMR Spectral Data (in C5D5N) of 13.

50

54

6

91

3

glc -1

glc-2

C-4 および C-6 の立体配置について、差 NOE スペクトルの結果(Fig. 19)、H-4 と H-5、

H-5 と H-6、H-9 間に相関が見られたこと、ならびに、H-1 と H-9、glc H-1、H-4 と glc H-2

間に相関が見られたことから Fig. 19 に示すように H-4 と H-6 はともに β 配置であると決

定した。次に、C-1 ならびに C-3 の立体配置については、上記の差 NOE の相関とともに

H-1、H-3 の J 値がそれぞれ 1.2 Hz、2.4 Hz と小さいことより H-1 と H-3 はともに α 配

置と決定した。

Fig. 19. Difference NOE Spectrum and structure of 13.

以上のデータを総合して、13 は、Fig. 19 に示すような構造と決定し、新規配糖体である

ことから、eucomoside A と命名した。

2222----4444----2222 EU-14 (14)

EU-14 (14) は [α]D −10.6° (CH3CN) を示す白色粉末として得られ、HR positive

FAB-MS m/z 544.1790 [M+Na]+

(Calcd for C25H31NNaO11: 544.1794) の解析より

C25H31NO11 の分子式を得た。14 の 1H-NMR スペクトルでは、先の geniposidic acid (5)

由来の signal に加え、新たに δ 3.09 (1H, dd, J=7.3, 14.0 Hz, H’-7a)、3.27 (1H, m, H’-7b)、

4.60 (1H, m, H’-8)、7.17 (1H, m, H’-4)、7.20 (2H, m, H’-2, 6)、7.21 (2H, m, H’-3, 5) に

phenylalanine 由来の signal が観察された。また、13C-NMR スペクトルでは、δ 38.7, 56.7,

NOE

51

H C : Selected HMBC

127.4, 129.2×2, 130.7×2, 139.8, 177.0 に phenylalanine 由来の signal が観察された。さら

に geniposidic acid 由来と推察される signal が観察されるものの、C-11 の chemical shift

が通常の geniposidic acid (5) では、δ 171.3 であるのに対し、本化合物では、δ 168.9 と

2.4 ppm 高磁場シフト、一方 C-4 は、δ 113.3 に対し δ 115.8 と 2.5 ppm 低磁場シフト、

C-3 は、δ 152.9 に対し、δ 148.6 と 4.3 ppm 高磁場シフトしているのが観察された（Fig.

20）。以上の知見から、本化合物は geniposidic acid の C-11 と phenylalanine とで amide

結合を形成する新規イリドイド配糖体と推定した。しかし、HMBC にて結合部位における相

関が見られなかったこと(Fig. 20)ならびに phenylalanine 部分の C’-8 の絶対立体配置の

決定のため phenylalanine 部分がＤ体およびＬ体の立体異性体を合成し、14 と比較す

ることにした。


C-NMR Spectral Data (in CD3OD) and HMBC Spectrum of 14.

原料には、Fr.1 から得た geniposidic acid (5) と L- または D-phenylalanine (16a, 16b) を

用いた。まず、16a または 16b の MeOH 溶液それぞれに氷冷下で SOCl2 を加え、室温

で 17 時間撹拌後、減圧下濃縮し、再結晶操作にて化合物 17a を 86% の収率で、化合

52

MeOH

SOCl2

0°C

DMF, Et3N, r.t.

HOBt, WSC 0.5N NaOH

MeOH, r.t.

HCl

O

HOH

H

OGlc

COOH

O

OHN

H

HOGlcHO

R

O

OHN

H

HOGlcHO

R

NH2R

NH2R

H3CO OHO O

H3CO O HO O

a: R = phenyl *Sb: R = phenyl *R

16a (16b) 17a (17b)18a (18b)

* *

* *

geniposidic acid (5)

19a (18b)MeOH, r.t.

SOCl2

MeOH, r.t.

NH2R

HO O

16a (16b)

*

19a

物 17b を 81% の収率で得た。 5 を DMF に溶解後、 17a (17b) 、 Et3N 、

1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) 、 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide

hydrochloride (WSC) を加え室温で 17 時間撹拌後、減圧濃縮し、silica gel カラムクロマト

グラフィーで精製し、化合物 18a を 98%、18b を 85% の収率で得た。最後に、メチル基

を脱保護することで C’-8 が S 体 (19a) または R 体 (19b) である 2 種のイリドイド配糖

体をそれぞれ収率 46%、73% で得た(Chart 2)。本構造は、1H-NMR スペクトル、13

C-NMR

スペクトルおよび MS スペクトルから支持された。

Chart 2

得られた 2 種の立体異性体 (19a, 19b) と 14 の 1H-NMR スペクトルならびに

13C-NMR スペクトルの比較を行った。1

H-NMR スペクトルにおいて、C-8’-S 体 (19a) は

14 と完全に一致したが、C-8’-R 体 (19b) では、H-6 の 2 個の proton が、それぞれ 0.1

ppm、0.6 ppm 低磁場シフトしているのが観察された(Fig. 21)。

53

C-8’ - S体体体体(19a)

C-8’ - R体体体体(19b)

EU-14 (14)

1H-NMR Data (in CD3OD, 500 MHz)



H-6b H-6aH-6b H-6a

+ 0.6 ppm

+ 0.1 ppm

Fig. 21. 1H-NMR Spectrum of 14, 19a and 19b.

しかし 13

C-NMR スペクトル(Table 16)では、3 化合物とも、ほとんど差異が見られなかった。

そこで、より明確に立体配置を支持するデータの取得を目的に HPLC 分析を行った。種々

の条件検討の結果、Fig. 22 に示す HPLC 分析条件により、S 体 (19a) を 29.3 min、R

体 (19b) を 29.6 min と異なる retention time で検出することが可能になった。

54

Analytical conditionColumn ： Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ

Mobile phase ： A: methanol

B: 20mM phosphate buffer (pH 2.5)

Gradient program： A : B = 15 : 85 → 50 : 50 (0-30 min)

→ 50 : 50 (30-35 min)

Temperature ： 30 ℃Detection ： UV at 240 nm

Fig. 22. HPLC Analyses of 14, 19a and 19b.

本条件では、14 は、S 体 (19a) と同じ 29.3 min に検出された。さらに、14 と S 体 (19a)

および R 体 (19b) を混合し分析したところ S 体のピークのみが増加したことからも、14 の

C’-8 の立体は S 体であると碓定した。本化合物は、イリドイド骨格にアミノ酸が amide 結

合している天然物の最初の例であり、新規化合物であることから、eucomoside B と命名した。

尚、これらの HPLC 分析による立体配置の支持から、アミノ酸部位の立体配置の判別には、

イリドイドの H-6 の proton の chemical shift 値が有効であることが判明した。

2222----4444----3333 EU-15 (15)

EU-15 (15) は [α]D −13.1° (H2O) を示す、白色粉末として得られ、HR negative ESI-MS

m/z 559.1980 [M−H]- (Calcd for C27H31N2O11: 559.1927)の解析により C27H32N2O11 の分子

式を得た。15 の 1H-NMR スペクトルでは、先の geniposidic acid (5) の signal に加え、

Co-injection of 19a and 19b

Co-injection of 14, 19a and 19b

19a

Rt:29.3 min.

19b

Rt:29.7 min.

19a + 14

Rt:29.3 min.

19b

Rt:29.7 min.

55

H C : Selected HMBC

新たに δ 3.19 (1H, m, H’-10a)、3.43 (1H, dd, J=4.3, 14.7 Hz, H’-10b)、4.61 (1H, d, J=6.7

Hz, H’-11)、6.98 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H’-5)、7.06 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H’-6)、7.09 (1H,

s, H’-2)、7.30 (1H, d, J=8.6 Hz, H’-7)、7.57 (1H, d, J=7.9 Hz, H’-4) に tryptophan 由来の

signal が観察された。13C-NMR スペクトルでは、δ 28.3, 57.5, 111.8, 112.2, 119.6, 119.8,

122.4, 124.4, 129.0, 138.1, 180.0 に tryptophan および geniposidic acid 由来と推察される

signal が観察されたものの、C-11 の chemical shift が通常の geniposidic acid (5) では、δ

171.3 であるのに対し、本化合物では、δ 169.9 と 1.4 ppm 高磁場シフトし、一方 C-4 は、

δ 113.3 ppm に対し δ 115.5 ppm と 2.2 ppm 低磁場シフト、また C-3 は、δ 152.9 ppm に

対し、δ 150.2 ppm と 2.7 ppm 高磁場シフトが観察された(Fig. 23) ことから、15 は

geniposidic acid の C-11 と tryptophan とで amide 結合を形成した新規イリドイド配糖体と

推定した。しかし、HMBC にて結合部位における相関が見られなかったこと(Fig. 23)ならび

に tryptophan 部分の C’-11 の絶対立体配置決定のため tryptophan 部分が D 体および

L 体の誘導体を合成し、比較検討を行った。


C-NMR Spectral Data (in CD3OD) and HMBC Spectrum of 15.

56

原料には、Fr.1 から得た geniposidic acid (5) と L- または D-tryptophan (16c, 16d) を

用いた。まず、16c または 16d の MeOH 溶液それぞれに氷冷下で SOCl2 を加え、室温

で 17 時間撹拌後、減圧下濃縮し、再結晶操作にて化合物 17c を 50% の収率で、化合

物 17d を 69% の収率で得た。5 を DMF に溶解後、17c (17d)、Et3N、HOBt、WSC を

加え室温で 17 時間撹拌後、減圧濃縮し、silica gel カラムクロマトグラフィーで精製し、化

合物 18c を 67%、18d を 83% の収率で得た。最後に、メチル基を脱保護することで

C’-11 が S 体 (19c) または R 体 (19d) である 2 種のイリドイド配糖体をそれぞれ収率

41%、73% で得た(Chart 3)。本構造は、1H-NMR スペクトル、13

C-NMR スペクトルおよび

MS スペクトルから支持された。

Chart 3

MeOH

SOCl2

0°C

DMF, Et3N, r.t.

HOBt, WSC 0.5N NaOH

MeOH, r.t.

HCl

O

HOH

H

OGlc

COOH

O

OHN

H

HOGlcHO

R

O

OHN

H

HOGlcHO

R

NH2R

NH2R

H3CO OHO O

H3CO O HO O

c: R = 3-indole *Sd: R = 3-indole *R

16c (16d) 17c (17d)18c (18d)

* *

* *


19c (18d)

MeOH

SOCl2

0°C

NH2

O

*

MeOH, r.t.

SOCl2

MeOH, r.t.

NH2R

HO O

16c (16d)

*

19cMeOH, r.t.

57

H-7 H-5 H-6b H-6a

EU-15（（（（15））））

C-11’-S体体体体（（（（19c））））

C-11’-R体体体体（（（（19d））））

1H-NMR Data （（（（in CD3 OD, 500 MHz））））



+0.1 ppm -0.2 ppm+0.4 ppm

+0.3 ppm

Fig. 24. 1H-NMR Spectrum of 15, 19c and 19d.

得られた 2 種の立体異性体 (19c, 19d) と 15 の 1H-NMR スペクトルならびに

13C-NMR スペクトルの比較を行った。天然物と合成化合物の NMR データを比較したとこ

ろ、 13

C-NMR スペクトルにおける chemical shift の差異は観察されなかったが、S 体

(19c) の 1H-NMR スペクトルは、15 と完全一致したのに対し、R 体 (19d) では、15 と比

べ、H-6 の metylene proton がそれぞれ 0.3、0.4 ppm 低磁場シフト、H-5 は、0.2 ppm ほ

ど高磁場シフト、H-7 では 0.1 ppm ほど低磁場シフトしているのが観察された(Fig. 24)。従

って、15 の C’-11 立体は NMR が完全一致した S 体であると決定した。以上のデータを

総合し、15 は、Fig. 23 に示す構造と決定され、新規化合物であることから、eucomoside C

と命名した。

58

　 13a

14ｂ

18ab

19ab

18bb

19bb

15ｂ

18cb

19cb

18db

19db

C-1 91.9 97.8 97.8 97.9 97.7 98.0 97.9 97.7 97.8 97.8 98.1

3 95.8 148.6 148.7 148.8 148.3 148.1 150.2 148.8 148.7 148.8 148.5

4 38.3 115.8 115.8 115.8 115.9 116.2 115.5 115.8 115.9 115.7 116.0

5 35.3 36.2 36.1 36.2 36.1 36.5 36.0 36.1 36.2 36.2 36.6

6 86.9 39.2 39.0 39.2 39.1 39.3 38.8 39.0 38.8 39.1 39.3

7 129.3 127.9 127.9 127.9 128.2 128.0 127.9 128.0 128.0 128.0 128.0

8 143.7 144.8 144.8 144.9 144.8 145.0 144.7 144.7 144.6 144.8 144.9

9 45.5 47.4 47.3 47.4 47.4 47.4 47.4 47.5 47.5 47.4 47.3

10 61.0 61.4 61.4 61.4 61.3 61.5 61.3 61.4 61.4 61.4 61.5

11 178.5 168.9 170.2 169.2 169.8 169.2 169.9 170.2 168.9 169.8 168.9

OCOCH3 170.3

OCOCH3 20.5

Glc C-1 99.0 100.3 100.3 100.4 100.4 100.3 100.3 100.3 100.3 100.3 100.4

2 80.3 74.9 74.9 75.0 74.9 75.0 74.9 75.0 75.0 75.0 75.0

3 75.8 77.8 77.9 77.9 77.9 77.9 77.9 77.9 77.9 78.0 77.9

4 71.2 71.6 71.6 71.6 71.6 71.6 71.6 71.6 71.6 71.7 71.6

5 79.9 78.3 78.4 78.4 78.4 78.4 78.4 78.4 78.4 78.4 78.4

6 62.6 62.7 62.7 62.7 62.7 62.7 62.7 62.8 62.7 62.8 62.7

C`-1 139.8 138.4 139.3 138.4 139.5 124.4 124.5 124.5 124.5 124.6

2 130.7 130.2 130.7 130.2 130.7 111.8 110.9 112.0 110.8 112.0

3 129.2 129.5 129.3 129.5 129.2 119.6 119.2 119.6 119.2 119.5

4 127.4 127.9 127.5 127.8 127.4 119.8 120.0 119.8 120.0 119.8

5 129.2 129.5 129.3 129.5 129.2 122.4 122.6 122.2 122.6 122.1

6 130.7 130.2 130.7 130.2 130.7 112.2 112.5 112.0 112.4 112.1

7 38.7 38.0 38.7 38.2 39.0 129.0 128.8 129.7 128.9 129.7

8 56.7 52.7 56.8 52.7 57.2 138.1 138.2 137.9 138.1 137.9

9 177 173.9 175.0 173.7 178.5 28.3 28.1 28.5 28.2 28.9

10 57.5 52.6 57.0 52.7 57.2

11 180.0 174.4 179.0 174.1 178.8

OCH3 55.1 55.0 55.0

Table 16. 13

C-NMR Spectral Data for 13—15, 18a—d, 19a—d (in pyridine-d5 a or CD3OD

b).

59

17a 17b 17c 17d

C-1 134.6 134.6 124.8 124.8

2 129.3 129.4 106.3 106.3

3 128.5 128.6 117.9 117.9

4 127.2 127.3 118.5 118.5

5 128.5 128.5 121.0 121.0

6 129.3 129.4 111.5 111.5

7 35.8 35.9 126.8 126.8

8 52.5 52.5 136.2 136.2

9 169.2 169.3 26.0 26.0

10 52.5 52.5

11 169.6 169.6

OCH3 53.3 53.3 52.6 52.6

Table 17. 13

C-NMR Spectral Data for 17a—d (in DMSO-d6).

60

H2O extract (EGLE) 267.400 g 100.00%

geniposidic acid (5) 14.636 g 5.473%

asperuloside (1) 4.680 g 1.750%

chlorogenic acid (12) 0.937 g 0.350%

quercetin 3-O-sambubioside (8) 0.620 g 0.232%

isoquercirin (7) 0.575 g 0.215%

astragalin (10) 0.338 g 0.126%

asperulosidic acid (2) 0.102 g 0.038%

deacetyl asperuloside (4) 0.068 g 0.025%

scandoside 10-O-acetate (3) 0.064 g 0.024%

rutin (9) 0.061 g 0.023%

kaempferol 3-O-rutinoside (11) 0.024 g 0.009%

eucomoside B (14) 0.012 g 0.004%

eucomoside C (15) 0.004 g 0.002%

eucomoside A (13) 0.003 g 0.001%

2222----5555 各成分各成分各成分各成分のののの含有量含有量含有量含有量

2222----5555----1111 各成分各成分各成分各成分のののの収量収量収量収量

EGLP を熱水抽出し、製した EGLE を各種カラムクトマトグラフィーならびに ODS を担体

とする HPLC で分離・精製し、新規化合物 3 種を含む 15 種の化合物を得た (2-2 参

照)。得られた各化合物の収量を Table 18 示した。

Table 18. Yield of Each Compounds.

一般に天然物を医薬品の原料とする場合、収量が 0.5 % 以上必要と言われている。

Table 18 のデータより、EGLP を熱抽出した杜仲緑色葉エキス(Eucommia green leaf extract;

EGLE )から得られる geniposidic acid および asperuloside がいかに大量に得られているかが

判る。また、コーヒーの抗酸化物質として注目される chlorogenic acid も 0.35 % と高含有で

ある。

61

Analytical conditionColumn ： YMC-Pack ODS-A S-5µm,12nm AA12S05-1506WT

Mobile phase ： methanol : H2O : phosphoric acid ＝ 130 : 870 : 1

Temperature ： 40 ℃Detection ： UV at 245 nm

2222----5555----2222 3D HPLC 3D HPLC 3D HPLC 3D HPLC によるによるによるによる主成分分析主成分分析主成分分析主成分分析

前述の各成分の収量により杜仲葉の主成分である geniposidic acid (5)、asperuloside (1)

および chlorogenic acid (12) について、HPLC での分析検討をした。この際、それぞれの

化合物を水で 10 mg/ml に調整したものを標品として用いた。様々な分離条件を検討した

結果、ODS を担体とした逆相クロマトグラフィーを用い、移動層として MeOH とリン酸バッ

ファー (50 mM, pH 2.8) を使用することで分離の効率が上がることが判明した。Fig. 25 に

示す HPLC 分析条件にて EGLP の主成分である geniposidic acid (5) を 5.1 min、

asperuloside (1) を 8.7 min および chlorogenic acid (12) を 10.2 min に検出し、一斉分析が

可能となった。

Fig. 25. 3D HPLC Pofile of Major Compounds of Green Leaves of E. ulmoides.

min

nm

mAbs


5.1 min

chlorogenic acid (12)

10.2 min

asperuloside (1)

8.7 min

O

OH

HOGlc

O

AcO

O

H

HOGlc

COOH

HO

OH

OH

C

O

O

HO OH

HO COOH

62

Fig. 26. Isolated Compounds from Eucommia Green Leaves.

第第第第 2222 章章章章のののの小括小括小括小括

抗肥満作用が確認された EGLP は、生葉を短時間で乾燥加工したもので、未開拓であ

るほか、葉本来の成分が保持されていることから、葉そのものの活性を把握することが可能と

考えられる。そこで EGLP の成分検索を行い、6 種のイリドイド化合物 (asperuloside; 1、

asperulosidic acid; 2、scandoside 10-O-acetate; 3、deacetyl asperulosidic acid; 4、geniposidic

acid; 5 、 aucubin; 6) 、 5 種のフラボノイド化合物 (isoquercitrin; 7 、 quercetin

3-O-sambubioside; 8、 rutin; 9、 astragalin, 10、kaempferol 3-O-rutinoside; 11) および

chlorogenic acid (12) を含む 12 種の既知化合物 37) ならびに 3 種の新規化合物 38) を得

た。そのうち 2 種 (eucomoside B; 14、eucomoside C; 15) は、イリドイドのカルボン酸とアミノ

酸のアミノ基が縮合した化合物、1 種 (eucomoside A; 13) は、イリドイドの 3 位とグルコー

スの 2 位がアセタール結合を持つ、何れも天然物最初の例と推測される。新規化合物の

14, 15 は、ゲニポシド酸とフェニルアラニン、トリプトファンを結合させることで簡便に調製で

きることから、他のアミノ酸も含めて種々の類縁体の構造活性相関の検討も可能である。また、

主要 3 成分 (1、5、12) の HPLC による一斉分析が可能となったことで、3 成分をメルクマ

ールとする製品開発とその品質管理が可能となった(Fig. 26)。

63

第第第第３３３３章章章章杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉のののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用にににに関与関与関与関与するするするする成分成分成分成分のののの特定特定特定特定

第１章では、メタボリックシンドローム病態モデル動物に対して杜仲葉は、抗肥満作

用を有することを明らかにした。すなわち、HFD を 90 日間摂取した SD 雄性ラットに対

して、ELE および EGLP の投与は、HFD 負荷での体重の増加抑制および WAT 重量

の低下が観察され、血中 TG 値の上昇抑制が確認できた。また、インスリン値の改善、

メタボリックシンドロームの血液指標としてアディポサイトカインであるアディポネクチンの

増加、TNF-αおよびレジスチンの低下が観察された。このことから、高脂質が原因で起

こる肥満に対して杜仲葉は、高い効果があることが示された。これら加工法の異なる杜

仲葉の抗肥満作用に共通性があることから、それぞれに含有される同じ関与成分が存

在することが示唆された。

第２章では、EGLP について含有成分の構造決定を行い、各成分の収量により杜仲

葉の主成分は geniposidic acid (5) 、asperuloside (1)および chlorogenic acid (12)であ

ることが把握された。

本章では、EGLP から熱水抽出し、製した EGLE を high porous polystyrene gel による

カラムクロマト(Diaion HP20)にて 5 つに分画、各画分を ICR 雌性マウスに４週間投与し、

抗肥満試験を実施することで、活性画分の検討を行った。さらに、主要成分を単離し、

同様に投与し、関与について検討を行った。これらの抗肥満作用が脂質代謝によるも

のかを確認するため、基礎代謝量および呼吸商の関与について試験を行った。

3333----1111 杜仲杜仲杜仲杜仲緑色葉分画物緑色葉分画物緑色葉分画物緑色葉分画物のののの抗肥満試験抗肥満試験抗肥満試験抗肥満試験

本実験では、第２章で含有成分の構造決定に用いた EGLP から熱水抽出し、製し

た EGLE を Diaion HP20 にて５つに分画、各画分を ICR 雌性マウスに４週間投与し、

抗肥満試験を実施することで、活性画分の検討を行った。

64

Fr. 1 (7.97%) Fr. 2 (0.76%) Fr. 3 (0.38%) Fr. 4 (0.14%) Fr. 5 (0.004%)

H2O 30% MeOH 50% MeOH 80% MeOH 100% MeOH

5 fractions

EGLE (10%)


試料は、第２章 2-2 に準ずる。

3333----1111----2222 成分含量測定方法成分含量測定方法成分含量測定方法成分含量測定方法

EGLE および各画分の 3 成分の測定方法は、第２章 2-5-2 に順ずる。

3333----1111----3333 投与投与投与投与量量量量

飼料は、牛脂 40%、コーンスターチ 10%、グラニュー糖 9%、ミネラルミックス 4%、ビタ

ミンミックス 1%、カゼイン 26%(いずれもオリエンタル酵母)および次の被験物質を混餌

した。被験物質は、EGLE の分画時の分取重量を反映させ、EGLE を 100%としてその

比率により HFD に混餌した。HFD への混合比率は、10% EGLE、 7.97% Fr.1、

0.76 % Fr. 2、0.38% Fr. 3、0.14% Fr. 4 および 0.004% Fr. 5 として、カゼインにより

全量 10%になるように調製した(Fig. 27)。HFD 群には、被験物質のかわりにカゼインを

10%混合したものを用いた。

Fig. 27. Components of administration samples.


実験動物として４週齢の ICR雌性マウス(日本 SLCから購入)を使用した。飼育は全

て、室温 23-26℃、湿度 40-60%、明暗周期 12 時間(午前 8 時点灯、午後 8 時消灯)

のサイクル条件下で行った。

65

28.7±0.24HFD

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 4

Fr. 5

Fr. 3

EGLE

Initial body weight

(g/mouse)

Food intake

(g/day/mouse)

Final body weight

(g/mouse)

Body weight gain

(g/mouse)

28.3±0.56

28.5±0.46

28.3±0.60

28.3±0.60

28.8±0.50

28.3±0.85

36.0 ±0.52

30.4±0.63

32.0±0.54

28.7±0.44

28.8±0.49

33.9±0.66

33.5±0.85

7.39 ±0.65

2.13 ±0.40

3.54 ±0.36

0.38 ±0.24

0.54 ±0.27

5.06 ±0.43

5.23 ±0.53

5.25±0.15

4.64±0.18

4.26±0.06

5.24±0.07

5.06±0.08

4.95±0.09

4.97±0.09

**

**

**

**

**

**

****

28.7±0.24HFD

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 4

Fr. 5

Fr. 3

EGLE

Initial body weight

(g/mouse)

Food intake

(g/day/mouse)

Final body weight

(g/mouse)

Body weight gain

(g/mouse)

28.3±0.56

28.5±0.46

28.3±0.60

28.3±0.60

28.8±0.50

28.3±0.85

36.0 ±0.52

30.4±0.63

32.0±0.54

28.7±0.44

28.8±0.49

33.9±0.66

33.5±0.85

7.39 ±0.65

2.13 ±0.40

3.54 ±0.36

0.38 ±0.24

0.54 ±0.27

5.06 ±0.43

5.23 ±0.53

5.25±0.15

4.64±0.18

4.26±0.06

5.24±0.07

5.06±0.08

4.95±0.09

4.97±0.09

**

**

**

**

**

**

****

Table 19. Effects of EGLE and 5 fraction supplementation on body weight and food

intake HFD-fed mice.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from HFD, ** p<0.01

(Tukey t-test). Significantly different from EGLE, not significantly (Tukey t-test).


体重を指標に実験群 [EGLE 群、Fr. 1－5 群および HFD 群] について、各群８匹に

なるように群分けした。投与物質は、各群それぞれ水とともに４週間自由摂取させ、４週

間後に体重を測定した。

測定項目および方法については、第１章 1-2-4 に準ずる。


統計処理は、第１章 1-2-5 に準ずる。

3333----1111----7777 結果結果結果結果およびおよびおよびおよび考察考察考察考察

この実験で、EGLE から分離された５つの画分の抗肥満効果は、40% HFD を負荷し

たメタボリックシンドローム病態マウスで評価した。HFD群および EGLE群を比較すると、

体重の増加は、４週間 EGLE を投与したマウスにおいて有意に抑制された(p<0.01、

Table 19)。

66

Fr. 1、Fr. 2 および Fr. 3 を混餌した HFD を摂取したマウスは、HFD と比較して体重

が有意に低下したが(p<0.01)、一方で Fr. 4 および Fr. 5 を投与したマウスでは HFD と

比較して有意な差は認められなかった。EGLE および各画分は、HFD を摂取したマウ

スにおける摂食量に影響を与えなかった(Table 19)。

HFD 群および EGLE 群を比較すると、４週間 EGLE を投与したマウスにおいて WAT

重量が有意に抑制された(p<0.01、Fig.28)。Fr. 1 から Fr. 4 を混餌した HFD を摂取した

マウスは、HFD 群と比較して WAT 重量が有意に低下した(Fr. 1： p<0.01、Fr. 2 から Fr.

4： p<0.01)。次に、WAT重量を体重当たりに換算し Fig.28に示す。体重当たりのWAT

重量は、投与４週間後に EGLE 群、Fr. 2 群および Fr. 4 群において HFD 群と比較し

て有意な減少が観察された(EGLE および Fr. 4： p<0.05、Fr. 2： p<0.01)。

HFD を４週間摂取したマウスは、血中 TG の増加を引き起こしたが、一方で EGLE、

Fr. 1、Fr. 2 および Fr. 4 の投与によって有意に低下した(EGLE： p<0.05、Fr. 1、Fr. 2、

Fr. 4： p<0.01、Fig. 29)。Fr. 2 を混餌した HFD を摂取したマウスは、EGLE 群と比較し

て血中 TG が有意に低下した(p<0.01)。総コレステロールは、HFD 群と比較して４週投

与した全ての群において有意に減少した(Fr. 1：p<0.05、EGLE、Fr. 2、Fr. 3、Fr. 4 およ

び Fr. 5： p<0.01、Fig. 29)。EGLE および各画分群の間に総コレステロールの有意な

差は認められなかった。

杜仲葉のラットへの 35 日の高濃度投与(3 g あるいは 6 g/kg-体重/日)あるいは杜仲

葉エキスのハムスターへの 10 日間の低濃度投与(15.5 mg/日)は、体重の有意な減少

は認められなかったとの報告がある 13,16)。さらに、高濃度の杜仲葉エキスを投与したラ

ットは体重および WAT 重量の減少が観察され、その一方で低濃度の杜仲葉エキスを

投与したハムスターでは WAT 重量に影響を与えなかったと報告されている。本試験結

果で観察された体重、WAT 重量および血中 TG の分画物間の変動は、異なる成分含

有比が抗肥満作用に影響を与えているのではないかと推測された。

67

Fig. 28. Effects of EGLE and 5 fractions on weight of WAT and weight of WAT/body weight in HFD-fed mice. Each value represent the mean ± SE

(n=8). Significantly different from HFD, *p<0.05, **p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different from EGLE, not significantly (Tukey t-test).

Weight of WAT (g)

EGLE

**

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0

HFD

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

* **

**

**

Weight of WAT (g)

EGLE

**

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0

HFD

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

* **

**

**

Weight of WAT/body weight (g/g)

HFD

0

0.02

0.04

0.06

0.08

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

*

**

*

EGLE


HFD

0

0.02

0.04

0.06

0.08

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

*

**

*

EGLE

68

Fig. 29. Effects of EGLE and 5 fractions on plasma TG and total cholesterol in HFD-fed mice. Each value represent the mean ± SE (n=8).

Significantly different from HFD, *p<0.05, **p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different from EGLE, ++p<0.01 (Tukey t-test).

Plasm

a TG (mg/dL)

0

10

20

30

40

50

HFD

EGLE

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

*

**

**

**

++

Plasm

a TG (mg/dL)

0

10

20

30

40

50

HFD

EGLE

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

*

**

**

**

++

Total cholesterol (m

g/dL)

0

70

90

110

130

150

HFD

EGLE

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

**

*

** ** ** **

～～～～～～～～

Total cholesterol (m

g/dL)

0

70

90

110

130

150

HFD

EGLE

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Fr. 4

Fr. 5

**

*

** ** ** **

～～～～～～～～～～～～～～～～

69

Table 20. Content of major components on Eucommia leaf

脂肪由来内分泌因子であるアディポネクチンは、内臓脂肪重量と逆相関し、インスリ

ン感受性、脂肪酸酸化のみならずエネルギー消費を増加させ、肝臓でのグルコース産

生を減少させる 24,39,40)。第 1 章において著者は、HFD を 90 日間摂取した SD 雄性ラ

ットに対して、ELE および EGLP の長期投与は、それぞれの状態のラットにおける内臓

脂肪の明確な減少によって血中アディポネクチンの有意にそして濃度依存的に増加さ

せたということを報告した。また、この結果は ELEおよびEGLPの長期投与がそれぞれ

の飼料条件下でラットの腎周囲の WAT におけるアディポネクチンおよび PPARγの遺

伝子発現を示した real-time PCR試験によって支持された。したがって、WAT重量の減

少は、体重の調整に寄与していることが推測された。

メタボリックシンドローム病態モデルマウスにおける体重、WAT 重量および血中 TG

は、Fr. 2 の投与で有意に抑制され、これらの効果は EGLE のそれに類似していた。杜

仲葉の抗肥満活性は共通する物質が関与しているということが示唆された。

EGLE および各画分の主要３成分である geniposidic acid (5)、asperuloside (1)およ

び chlorogenic acid (12)の含有量を Table 20 に示す。Fr. 2 に含まれる主な成分は、

geniposidic acid (5： 16.9 mg/g 含有)、asperuloside (1： 445.9 mg/g 含有)および

chlorogenic acid (12： 32.0 mg/g 含有)であり、これらの分析結果から抗肥満作用の主

な成分は asperuloside (1)である可能性を示すものである。

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 4

Fr. 5

Fr. 3

EGLE

Geniposidic acid

(mg/g)

Asperuloside

(mg/g)

Chlorogenic acid

(mg/g)

63.0

72.2

16.9

N.D.

N.D.

N.D.

45.2

N.D.

445.9

12.0

N.D.

N.D.

44.0

62.3

32.0

3.4

N.D.

N.D.

N.D., not detected

70

3333----2222 主要主要主要主要３３３３成分成分成分成分のののの長期投与長期投与長期投与長期投与によるによるによるによる抗肥満抗肥満抗肥満抗肥満試験試験試験試験

本実験では、EGLE 中の主要３成分である geniposidic acid (5)、asperuloside (1)お

よび chlorogenic acid (12)について ICR 雌性マウスに４週間投与し、抗肥満試験を実

施することで、主要成分活性の検討を行った。


分画された Fr. 1 の一部 (700 g) を MCI gel CHP 20P (H2O, MeOH)に付し、

Daisogel SP-120-40/60 ODS-B (50% MeOH)で精製し geniposidic acid (5： 86.0 g、純

度 98.9%)を得た。Fr. 2 (270 g)を YMC S-15/30 120A ODS (H2O:MeOH,1:1→6:1)な

らびに Daisogel SP-120-40/60-ODS-B (80% MeOH) で精製し、凍結乾燥後アセトン

で洗浄、乾燥により asperuloside (1： 31.3 g、純度 98%)を得た。chlorogenic acid (12)

は、市販品(和光純薬製)を用いた。

EGLE は、第２章 2-2 に準ずる。

3333----2222----2222 投与量投与量投与量投与量

飼料は、第３章 3-1-2 に準ずる。

被験物質は、HPLC 法で測定された EGLE 中の被験物質の含有量を反映させ、

EGLE を 100%としてその比率により HFD に混餌した(Table 19)。HFD への混合比率は、

0.63% geniposidic acid (5)、0.45% asperuloside (1)および 0.44% chlorogenic acid

(12)として、カゼインにより全量 10%になるように調製した。


実験動物および飼育方法は、第３章 3-1-3 に準ずる。

71

25.9 ±0.38*

HFD

Ganiposidic acid (5)EGLE

Initial body weight

(g/mouse)

Final body weight

(g/mouse)

25.2 ±0.55

25.4 ±0.37

25.5 ±0.50

25.9 ±0.44

35.5 ±0.95

31.7 ±0.73

33.9 ±0.61

31.8 ±0.89

35.7 ±1.32

Asperuloside (1)

Chlorogenic acid (12)

Food intake

(g/day/mouse)

Body weight gain

(g/mouse)

5.51 ±0.20

4.08 ±0.09

4.93 ±0.20

4.68 ±0.20

4.66 ±0.36

9.50 ±0.68

6.53 ±0.33

8.53 ±0.43

6.35 ±0.49

9.83 ±1.29

*

*

*

25.9 ±0.38*

HFD

Ganiposidic acid (5)EGLE

Initial body weight

(g/mouse)

Final body weight

(g/mouse)

25.2 ±0.55

25.4 ±0.37

25.5 ±0.50

25.9 ±0.44

35.5 ±0.95

31.7 ±0.73

33.9 ±0.61

31.8 ±0.89

35.7 ±1.32

Asperuloside (1)

Chlorogenic acid (12)

Food intake

(g/day/mouse)

Body weight gain

(g/mouse)

5.51 ±0.20

4.08 ±0.09

4.93 ±0.20

4.68 ±0.20

4.66 ±0.36

9.50 ±0.68

6.53 ±0.33

8.53 ±0.43

6.35 ±0.49

9.83 ±1.29

*

*

*


体重を指標に実験群 [EGLE 群、Fr. 1-5 群と HFD 群] について、各群８匹になるよ

うに群分けした。投与物質は、各群それぞれ水とともに４週間自由摂取させ、４週間後

に体重を測定した。

測定方法については、第１章 1-2-4 に準ずる。




この実験で、EGLE から分離された３成分の抗肥満効果は、40% HFD を負荷したメ

タボリックシンドローム病態マウスで評価した。試験材料は、EGLP 中の重量比率と一

致して単離物を加えることによって調整した。HFD群および EGLE 群を比較すると、体

重の増加は、４週間 EGLE を投与したマウスにおいて有意に抑制された(それぞれ

p<0.05、Table 21)。これらの結果は、前述の実験で得られた抗肥満効果に対するさら

なる支持を与えた。

Table 21. Effects of EGLE and 3 compounds supplementation on body weight and food

intake HFD-fed mice.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from HFD, * p<0.05

(Tukey t-test). Significantly different from EGLE, not significantly (Tukey t-test).

72

asperuloside (1)を混餌したHFDを摂取したマウスは、HFD群と比較して体重が有意

に低下したが、一方で geniposidic acid (5)および chlorogenic acid (12)を投与したマウ

スでは有意な差は認められなかった。asperuloside (1)を混餌した HFD を摂取したマウ

スの体重は、EGLE と同等なレベルで抑制された。EGLE および３成分は、HFD を摂取

させたマウスにおける摂食量に影響を与えなかった (Table 21)。４週間 EGLE、

geniposidic acid (5)および asperuloside (1)をそれぞれ混餌した HFD を摂取したマウス

は、HFD 群と比較して WAT 重量の低下が観察された(Fig.30)。特に asperuloside (1)

を混餌した HFD を摂取したマウスは、HFD 群と比較して WAT 重量および体重当たり

の WAT 重量が有意に低下した(p<0.05)。chlorogenic acid (12)は、HFD 負荷下でのマ

ウスの体重および WAT 重量に影響を与えなかった。高濃度の chlorogenic acid (12)を

混餌した HFD を摂取したマウスは、HFD 群と比較して体重、内臓脂肪量、血中レプチ

ンおよび血中インスリンにおいて有意な減少を示したという報告もある 41)。今回のメタボ

リックシンドローム病態マウスでの体重および WAT 重量の増加抑制が観察された抗肥

満作用は、asperuloside (1)に強く依存していた。

HFD 群と比較して EGLE、geniposidic acid (5)、asperuloside (1)および chlorogenic

acid (12)の各群間に血中 TG レベルの有意な差は認められなかったが、chlorogenic

acid (12) > asperuloside (1) > geniposidic acid (5)の順で血中 TG の減少がみられた

(Fig. 31)。asperuloside (1)および chlorogenic acid (12)を混餌したHFDを摂取したマウ

スは、HFD 群および EGLE 群と比較して FFA が有意な低下が認められた(それぞれ

p<0.01 、Fig. 31)。

第 1 章のリアルタイム PCR 分析では、ELE および EGLP の長期投与が肝臓での脂

肪酸のβ酸化を高めた。そして肝臓への脂肪酸の取り込みは ELE および EGLP によ

って高められ、脂肪酸β酸化および ATP 産生の増加を伴い、HFD 負荷下のラットにお

いてNEFAレベルの循環を減らすかもしれないということを示した。本試験は、FFAの減

少が観察されたことから、これらの結果を支持している。

73


HFD

0

0.02

0.04

0.06

0.08

*

EGLE

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)


HFD

0

0.02

0.04

0.06

0.08

*

0

0.02

0.04

0.06

0.08

*

EGLE

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Weight of WAT (g)

HFD

EGLE

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Weight of WAT (g)

HFD

EGLE

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Fig. 30. Effects of EGLE and 3 compounds on weight of WAT and weight of WAT/body weight in HFD-fed mice. Each

value represent the mean ± SE. Significantly different from HFD, *p<0.05 (Tukey t-test). Significantly different from

EGLE, not significantly (Tukey t-test).

74

Plasm

a TG (m

g/dL)

HFD

EGLE

0

5

10

15

20

25

30

35

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Plasm

a TG (m

g/dL)

HFD

EGLE

0

5

10

15

20

25

30

35

0

5

10

15

20

25

30

35

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Free fatty acids ( μ

Eq/L)

0

HFD

EGLE

**

0.5

1.0

1.5

2.0

**++ ++

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Free fatty acids ( μ

Eq/L)

0

HFD

EGLE

**

0.5

1.0

1.5

2.0

**++ ++

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

Fig. 31. Effects of EGLE and 3 compouns on plasma TG and FFA in HFD-fed mice. Each value represent the mean ± SE.

Significantly different from HFD, **p<0.01 (Tukey t-test). Significantly different from EGLE, ++p<0.01 (Tukey t-test).

75

４週間後、モデルマウスにおける体重、WAT 重量、血中 TG および総コレステロール

は、30%の MtOH 画分(より高い asperuloside (1)を含んでいる)投与で有意に抑制さ

れ、これらの効果は EGLP のそれに類似していた(前述の実験)。脂質と WAT 重量の

減少について杜仲葉の抗肥満作用は、杜仲葉の asperuloside (1)に強く依存してい

た。これらの結果は EGLE における asperuloside (1)含有量が抗肥満の効果において

重要な意味を持っていることを示唆する。

3333----3333 主要主要主要主要３３３３成分成分成分成分のののの長期投与長期投与長期投与長期投与によるによるによるによる代謝活性試験代謝活性試験代謝活性試験代謝活性試験

本実験では、杜仲葉および主要含有成分の投与における呼吸代謝に与える影響を

検討するため、EGLE、geniposidic acid (5)、asperuloside (1)および chlorogenic acid

(12)を SD 雄性ラットに４週間投与し、４週間の投与後、呼吸商(RQ)および基礎代謝量

(BMR)を測定し主要成分の活性について検討を行った。


試料は、第３章 3-2-1 に準ずる。

3333----3333----2222 投与量投与量投与量投与量

被験物質は、 SD 雄性ラットに 5% EGLE、 0.1% geniposidic acid (5)、 0.1%

asperuloside (1)、0.1% chlorogenic acid (12)を高脂肪餌に混餌して作製し、それらを４

週間、自由摂取させた。

飼料は、第１章 1-2-2 に準ずる。


実験動物および飼育方法は、第 1 章 1-2-3 に準ずる。

76


体重を指標に実験群(geniposidic acid 群、asperuloside 群および chlorogenic acid

群)と HFD 群について、各群 4 匹になるように群分けした。飼料は水とともに４週間自由

摂取させた。投与終了後、CO2/O2 metabolism measuring system MK-5000RQ(室町

機械 )により 20 時間の呼吸代謝を測定した。呼気代謝分析により、体表面あたりの

BMR および RQ を算出した。算定式は次の通りである。RQ (rpiratory quotient = CO2

extrusion / O2 consumption)、BMR (basal meabolism rate = (VO2 mL / min.) / body

weight（kg）0.75)。




HFD 群および EGLE 群を比較すると、BMR は、４週間 EGLE を投与したラットにお

いて有意な増加が認められた(Fig.32)。これにより、杜仲葉の内臓脂肪を減少させる効

果は、基礎代謝率の上昇も関わっていることが示唆された。asperuloside (1)および

chlorogenic acid (12)を混餌した HFD を摂取したラットは、HFD 群と比較して BMR の

有意な増加が認められた。asperuloside (1)を混餌した HFDを摂取したラットは、HFDと

比較して RQ の有意な減少が認められ、脂質を優先的に消費していることが示唆され

た。これとは逆に geniposidic acid (5)を混餌した HFD を摂取したラットは、HFD と比較

して RQ の有意な増加が認められ、糖質を優先的に消費していることが示唆された。

以上の結果、杜仲葉の抗肥満作用は、基礎代謝の向上が関わっていることが示唆

された。その活性は、geniposidic acid (5)が糖を優先的にエネルギーとして消費し、

asperuloside (1)が脂質を優先的にエネルギーとして消費しているのではないかと考え

られた。

77

Fig. 32. Effects of EGLE and 3 compounds on BMR and RQ in HFD-fed rat. Each value represent the mean ± SE.

Significantly different from HFD, *p<0.05 (Tukey t-test).

BMR (ml/min./kg0.75)

*

0

15

20

25

HFD

EGLE

*

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

～～～～～～～～

*BMR (ml/min./kg0.75)

*

0

15

20

25

HFD

EGLE

*

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

～～～～～～～～～～～～～～～～

*

RQ

0

0.7

0.8

0.9

*

～～～～～～～～

*

HFD

EGLE

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

RQ

0

0.7

0.8

0.9

*

～～～～～～～～～～～～～～～～

*

HFD

EGLE

Geniposidic

acid (5)

Asperuloside(1)

Chlorogenic

acid (12)

78

第第第第３３３３章章章章のののの小括小括小括小括

EGLP から熱水抽出し、製した EGLE を Diaion HP20 にて 5 つに分画、各画分につ

いて ICR 雌性マウスに４週間投与し、抗肥満試験を実施することで、活性画分の検討

を行った。結果、Fr. 1 (H2O)、Fr. 2 (30% MeOH) および Fr. 3 (50% MeOH) に抗肥満

作用が認められ、それらの中でも Fr. 2 の抗肥満作用は顕著であった。また、Fr. 2 のこ

れらの効果は EGLP のそれに類似していた。さらに、EGLE 中の主要３成分である

geniposidic acid (5)、asperuloside (1)および chlorogenic acid (12)について ICR 雌性

マウスに４週間投与し、抗肥満試験を実施することで、主要成分活性の検討を行った。

その結果、EGLE から単離された asperuloside (1)の長期投与は、モデルマウスでの体

重、WAT、血中 TG および FFA の増加を抑制した。これらから「杜仲葉」の抗肥満作用

は、主に asperuloside (1)によるものと推定された。杜仲葉および主要含有成分の投与

における呼吸代謝に与える影響を検討するため、SD 雄性ラットに EGLE、geniposidic

acid (5)、asperuloside (1)および chlorogenic acid (12)を HFD に混餌して投与し、４週

間の投与後、RQ および BMR を測定し主要成分の活性について検討を行った。その

結果、HFD 群および EGLE 群を比較すると、BMR は４週間 EGLE 摂取したラットにお

いて有意な増加が認められた。これにより、杜仲葉の内臓脂肪を減少させる効果は、

基礎代謝率の上昇も関わっていることが示唆された。asperuloside (1)を混餌した HFD

を摂取したラットは、HFD と比較して RQ の有意な減少が認められ、脂質を優先的に消

費していることが示唆された。これとは逆に geniposidic acid (5)を混餌した HFD を摂取

したラットは、HFD と比較して RQ の有意な増加が認められ、糖質を優先的に消費して

いることが示唆された。

以上の結果、 EGLE における asperuloside (1)が抗肥満の効果において重要な意

味を持っていることが示唆された 42)。

79

総括総括総括総括

杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv.) は中国中央部起源の 1 属 1 種の落葉性木本類

で、樹高は 20 m に達する中高木である。樹皮は生薬・杜仲で、中国最古の薬物書で

ある「神農本草経」に、長く服用しても副作用がなく長寿を助ける「上品」に分類・収載

されている。また、数百年前に出版された「本草綱目」には、高血圧症など具体的な疾

患に対する有効性が記載されているほか、葉を「野菜として食する」とする記述がある。

一方、我が国では葉を焙煎により茶用として 1970 年代に発案された「杜仲茶」が、健

康維持の目的で幅広く飲用されている。近年、葉について成分探索の研究が進み、

乾燥葉および焙煎葉など原葉の成分検索が行われ、geniposidic acid を含む 8 種の

イリドイド化合物のほか、14 種の化合物が得られている。さらに、薬理試験が進み、副

交感神経を介した血圧降下作用が明らかとなり、geniposidic acid を主成分とする杜

仲葉配糖体飲料が、「血圧が高めの方に適した食品」の表示許可を得、特定保健用

食品として市販されるに至っている。一方、欧米型中心の食事と標準的な摂取カロリー

を超える食生活の変化に伴い、我が国ではメタボリックシンドロームが問題視されてい

る。高血圧、脂質代謝異常、耐糖能異常を伴う動脈硬化易発症病態を包括的に捉え

た疾患観念である MS は、病態の基盤に内臓脂肪蓄積が存在するとされている。すな

わち、内臓脂肪より分泌される善悪の様々なアディポサイトカインがメタボリックシンドロ

ームに関与することが解明されてきている。本論文では、杜仲葉の食経験と研究デー

タの再解析から導き出された内臓脂肪減少による抗肥満作用の仮説に基づき、杜仲

葉のメタボリックシンドロームに対する保健用途への適合を計画した。先ず、加工方法

の異なる杜仲葉原料について、抗肥満作用に対する有効性の確認および作用機序を

明らかにし、次に、効果の高かった杜仲緑色葉の成分探索および有効成分を特定す

る薬理試験を行い興味深い知見を得た。

第 1 章では、メタボリックシンドローム病態モデル動物に対して杜仲葉は、抗肥満作

80

用を有することを明らかにした。先ず、加工方法が異なる杜仲葉 ELE および EGLP に

ついて、長期投与下の脂質の負荷状態で差異を把握するため、各被験物質を HFD

および ND に混餌し、それぞれを４週齢の SD 雄性ラットに 90 日間投与し、投与期間

中の体重増加量、投与終了後の WAT 量、血中 TG、インスリン、グルコースおよびアデ

ィポサイトカインを測定した。その結果、体重および WAT 重量は HFD を混餌した ELE

および EGLP を摂取することにより増加を有意に抑制し、その効果はいずれも用量依

存的であった。一方、ND 混餌群では体重増加を抑制する効果がみられたが、有意な

差は認められず程度は小さいと思われた。このことから、高脂肪食が原因で起こる肥満

に対して杜仲葉は、高い効果があることが示唆され、通常の食事においては影響が少

ないことが考えられた。また、血中脂質は、血中 TG 濃度が顕著に抑制された。さらに、

インスリン濃度はいずれの投与群でグルコース値を正常値に維持しながらインスリン濃

度の低下を示し、インスリン抵抗性の改善が確認された。また、アディポネクチン濃度の

上昇、ＴＮＦ-αおよびレジスチンの低下と、メタボリックシンドロームに関与する生理活

性物質のバランスが整うことが示唆された。これら加工法の異なる杜仲葉の抗肥満作

用に共通性があることから、それぞれに含有される関与成分が存在することが示唆され

た。次に、投与終了後のラットの WATp、BAT、筋組織および肝臓を摘出し、リアルタイ

ム PCR 法で定量し、遺伝子発現量の増減より、脂質、糖質の代謝メカニズムを予測し

た。ELEおよび EGLPを摂取することによって、肝臓におけるβ酸化の活性化が認めら

れた。また、その作用は ND および HFD いずれでも維持された。これにより杜仲葉は、

肝臓でのβ酸化の活性化によりケトン体を生成し、そのケトン体を骨格筋で積極的に

利用させることを認めた。WATp において、EGLP は TG の分解、β酸化、TCA サイク

ル、電子伝達系の活性化を示した。一方、ELE はβ酸化、TCA サイクル、電子伝達系

を促進した。以上の結果、杜仲葉は全身レベルでの代謝の活性化(肝臓や白色脂肪

組織での脂質代謝の促進及び骨格筋での糖の利用促進)により、内臓脂肪の蓄積を

抑制していると考えられた。

81

第２章では、抗肥満作用が確認された EGLP は、生葉を短時間で乾燥加工したもの

で、未開拓であるほか、葉本来の成分が保持されていることから、葉そのものの活性を

把握することが可能と考えられるため、その成分探索を検討した。

Fig. 33. Isolated compounds from Eucommia green leaves

EGLP の成分検索の結果、6 種のイリドイド化合物 (asperuloside; 1、asperulosidic

acid; 2、scandoside 10-O-acetate; 3、deacetyl asperulosidic acid; 4、geniposidic acid;

5 、 aucubin; 6) 、 5 種のフラボノイド化合物 (isoquercitrin; 7 、 quercetin

3-O-sambubioside; 8、rutin; 9、 astragalin; 10、kaemfherol 3-O-rutinoside; 11) およ

び chlorogenic acid (12) を含む 12 種の既知化合物ならびに 3 種の新規化合物を

得た。そのうち 2 種 (eucomoside B; 14、eucomoside C; 15) は、イリドイドのカルボン

酸とアミノ酸のアミノ基が縮合した化合物、1 種 (eucomoside A; 13) は、イリドイドの 3

位とグルコースの 2 位がアセタール結合を持つ、何れも天然物最初の例と推測される

(Fig. 43)。新規化合物の 14, 15 は、ゲニポシド酸とフェニルアラニン、トリプトファンを

結合させることで簡便に調製できることから、他のアミノ酸も含めて種々の類縁体の構

82

造活性相関の検討も可能である。また、主要 3 成分(1、5、12)の HPLC による一斉分

析が可能となったことで、3 成分をメルクマールとする製品開発および品質管理が可能

となった。

第３章では、第１章での抗肥満試験で好成績を収めた EGLP を、Diaion HP20 にて

5つに分画し、各画分について ICR雌性マウスに長期投与し、抗肥満試験を実施する

ことで活性画分の抗肥満作用の検討を行った。結果、Fr. 2 (30% MeOH) および Fr.

3 (50% MeOH) に体重および WAT 重量の増加抑制、血中 TG および総コレステロー

ルの低下が観察され、それらの中でも Fr. 2 においてこれら抗肥満作用が顕著であっ

た。次に、EGLE 中の主要３成分である geniposidic acid (5)、asperuloside (1)および

chlorogenic acid (12)について同様に ICR 雌性マウスに長期投与し、抗肥満試験を実

施することで、主要成分活性の検討を行った。その結果、EGLE から単離した

asperuloside (1)の長期投与は、モデルマウスでの体重、WAT 重量、血中 TG および

FFA の増加を抑制した。さらに、この３成分の杜仲葉および主要含有成分の投与にお

ける呼吸代謝に与える影響を検討するため、SD 雄性ラットに EGLP、geniposidic acid

(5)、asperuloside (1)および chlorogenic acid (12)を高脂肪餌に混合して投与し、30 日

の投与後、RQおよび BMRを測定した。その結果、asperuloside (1)を混合した HFDを

摂取したラットは、HFDと比較してRQの有意な減少が認められ、脂質を優先的に消費

していることが示唆された。

以上の結果、杜仲葉の抗肥満作用は asperuloside (1)が主な関与成分と示唆され

た。asperuloside (1)は体重とともに白色脂肪組織重量の減少が認められ、その機序と

して脂質をエネルギーとして消費していることが把握された。本研究で asperuloside

(1)に抗肥満作用が認められたのはイリドイド類において最初の例であり、メタボリックシ

ンドロームの病態の主因子とされる内臓脂肪を効果的に減少させる成分として、今後

新たな機能性素材、特に新規性がある特定保健用食品の開発素材として有望視でき

るものである。

83

実験実験実験実験のののの部部部部

第第第第１１１１章章章章にににに関関関関するするするする実験実験実験実験

植物植物植物植物

中国四川省で栽培された杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv.)の新鮮葉を採取後、約

80ºC の熱風で 10 分間処理し、水分量を 10%程度にし、その後１時間かけ水分量

を 10%以下にしものを用いた。

その他事項は本論中参照。

第第第第２２２２章章章章にににに関関関関するするするする実験実験実験実験

オープンクロマトグラフィー用担体としては、Diaion HP 20、MCI gel CHP 20P

(Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.)、silica gel 60 (Merck Art. 9385)、Sephadex

LH 20 (Pharmacia Fine Chemicals) および Chromatorex ODS (Fuji Silysia Chemical,

Ltd.) を用いた。 TLC は DC-Alufolin Kiselgel F254 (Merck Art. 544) および

DC-Alufolin RP-18F254 (Merck Art. 559) を用い、UV 検出 (254 nm, Atto Co., Ltd.,

SJ-1031A) 後、10%H2SO4-MeOH 試薬を噴霧、加熱して検出した。高速液体クロマト

グラフィー (HPLC) は、ポンプに、SIMADZU LC-10ADVP を用い、検出器として

TOSHO RI8010、SIMADZU SPD-10AVP および SPD-M10AVP を用いた。カラムオー

ブンは、SIMADZU CTO-10ACVP を使用し、ソフトウェアとして、Class LC-10 を使用し

た。HPLC 用カラムは、COSMOSIL 5C18-AR-II [(4.6 mm i. d. × 250 mm)，(20 mm i.

d. × 250 mm) Nakalai tesque. Inc.] COSMOSIL 5C18-MS-II [(4.6 mm i. d. × 250 mm)

Nakalai tesque. Inc.] を用いた。

旋光度は、JASCO DIP-1000 KUY (l = 0.5) を用い測定した。FAB-MS (イオン源:

Xe atom beam、加速電圧: 2—3kV、マトリックス: p-nitorobenzyl alchol、glycerol) は、

JEOL JMS-DX303HF を用い測定した。ESI-MS は、 reserpine を内部標準とし、

84

JEOL JMS-T100LC “AccuTOF” で測定した。

1H- および

13C-NMR スペクトルは、JEOL α-500 を用いて測定した。ケミカルシフト

値は tetramethylsilane (TMS) を内部標準としたδ値 (ppm) で表示し，結合定数 (J)

はヘルツ (Hz) で表した。

抽出抽出抽出抽出・・・・分離分離分離分離

杜仲緑色葉 (577.8 g) を 60°C の熱水で 10 時間抽出し、抽出液を Diaion

HP-20 (H2O–MeOH=1:0→0:1) に付し、Fr. 1—5 を得た。Fr. 1 (135.5 g) の一部 (2.0

g) を MCI gel CHP 20P (H2O、MeOH) に付し、Fr. 1-1—3、5 (216 mg)、6 (255 mg)

および Fr. 1-6—13 を得た。Fr. 1-2 (760 mg) を Sephadex LH 20 (H2O, MeOH,

H2O–acetone) ならびに Chromatorex ODS (H2O、5% MeOH、10% MeOH、MeOH)

で精製し、 3 (9 mg) を得た。 Fr. 1-12 、 13 (37 mg) を silica gel 60 (C: M:

W=8:2:0.2→7:3:0.5→0:1:0) で精製し、12 (4 mg) を得た。Fr. 2 (17.3 g) の一部を

(1.0 g) を silica gel 60 (C: M: W=20:1:0→9:1:0.1→8:2:0.2→0:1:0) に付し、Fr.

2a-1—3、1 (275 mg) および Fr. 2a-5—7 を得た。Fr. 2a-5、2-6 (109 mg) を silica

gel 60 (C: M: W=8:2:0.2→0:1:0) および HPLC (20% MeOH) に付し 4 (4 mg) およ

び 2 (6 mg) を得た。また、Fr. 2 (17.3 g) の一部を (3.8 g) を Chromatorex ODS

(15% MeOH、30% MeOH、50% MeOH、MeOH) に付し、Fr. 2b-1、1 (2.0 g) および

Fr. 2b-4—7 を得た。Fr. 2a-6 (701 mg) を Chromatorex ODS (H2O、5% MeOH、

10% MeOH、15% MeOH、MeOH) に繰り返し付し、eucomoside B (14、12 mg) およ

び eucomoside C (15、4 mg) を得た。 Fr. 3 の一部 (2.0 g) を Sephadex LH-20

(50% MeOH, MeOH) に付し、Fr. 3-1—7、10 (55 mg)、7 (134 mg) および Fr. 3-10

を得た。Fr. 3-2 (327 mg) を silica gel 60 (C: M: W=15:1:0→10:2:0.1→0:1:0) に付し、

eucomoside A (13、3 mg) を得た。Fr. 3-5, 6 (441 mg) を Chromatorex ODS (30%

MeOH、40% MeOH、50% MeOH、MeOH) に付し、Fr. 3-6-1, 2、8 (155 mg) および

85

Fr. 4-6-5—10 を得た。Fr. 3-6-5 の一部 (10 mg) を HPLC (35% MeOH) で精製し、

9 (2 mg) を得た。 Fr. 4-6-7 を、HPLC (50% MeOH) で精製し、11 (6 mg) を得た。

EU-1 (1, asperuloside)

A white powder, [α]D −91.1° (c = 1.00, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 415 [M+H] +

;

1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 2.08 (3H, s, OCH3), 3.20 (1H, dd, J=7.9, 9.2 Hz,

glc H-2), 3.29 (1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, glc H-4), 3.31 (1H, s, H-9), 3.39 (2H, m, glc

H-3, 5), 3.68 (2H, m, H-5, glc H-6a), 3.92 (1H, dd, J=2.1, 11.0 Hz, glc H-6b), 4.65

(1H, d, J=14.3 Hz, H-10a), 4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 4.79 (1H, d, J=14.3 Hz,

H-10b), 5.56 (1H, d, J=6.7 Hz, H-6), 5.73 (1H, s, H-7), 5.95 (1H, s, H-1), 7.30 (1H, d,

J=1.2 Hz, H-3) ; 13

C-NMR spectral data (in CD3OD, 125 MHz): see Table 14.

EU-2 (2, asperulosidic acid)

A white powder, [α]D +193.6° (c = 0.01, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 455

[M+Na]+ ; 1

H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 2.09 (3H, s, OCH3), 2.63 (1H, dd,

J=7.9, 8.5 Hz, H-9), 3.23 (1H, dd, J=7.9, 8.5 Hz, H-5), 3.24 (1H, dd, J=7.9, 8.5 Hz,

glc H-2), 3.28–3.30 (glc H-4, 5), 3.38 (1H, dd, J=8.5, 8.5 Hz, glc H-3), 3.66 (1H, dd,

J=5.5, 12.2 Hz, glc H-6a), 3.86 (1H, d, J=12.2 Hz, glc H-6b), 4.72 (1H, d, J=7.9 Hz,

glc H-1), 4.80 (1H, m, H-10a), 4.85 (1H, m, H-6), 4.95 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b),

5.06 (1H, d, J=9.2 Hz, H-1), 6.02 (1H, s, H-7), 7.64 (1H, s, H-3) ; 13

C-NMR spectral

data (in CD3OD, 125 MHz): see Table 14.

EU-3 (3, scandoside 10-O-acetate)

A white powder, [α]D +30.0° (c = 0.01, H2O); Positive FAB-MS m/z: 455 [M+Na]+ ;

1H-NMR (in D2O, 500 MHz) δ: 2.13 (3H, s, OCH3), 3.01 (1H, m, H-5), 3.02 (1H, m,

86

H-9), 3.24 (1H, dd, J=7.9, 9.2Hz, glc H-2), 3.32 (1H, m, glc H-5), 3.38 (1H, m, glc

H-3), 3.67 (1H, m, glc H-6a), 3.90 (1H, d, J=12.2 Hz, glc H-6b), 4.74 (1H, d, J=7.9

Hz, glc H-1), 4.62 (1H, s, H-6), 4.87 (1H, m, H-10), 5.10 (1H, d, J=7.3 Hz, H-1), 5.87

(1H, s, H-7), 7.55 (1H, s, H-3) ; 13

C-NMR spectral data (in D2O, 125 MHz): see Table

14.

EU-4 (4, deacetyl asperulosidic acid)

A white powder, [α]D −51.1° (c = 0.60, 50% MeOH); Positive FAB-MS m/z: 413

[M+Na]+ ;

1H-NMR (in D2O, 500 MHz) δ: 2.77 (1H, dd, J=7.9, 7.9 Hz, H-5), 2.90 (1H,

m, H-9), 3.22 (1H, dd, J=7.9, 9.2 Hz, glc H-2), 3.25–3.32 (2H, m, glc H-4, 5), 3.39

(1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, glc H-3), 3.64 (1H, dd, J=5.5, 11.6 Hz, glc H-6a), 3.83 (1H, dd,

J=1.8, 12.2 Hz, glc H-6b), 4.18 (1H, d, J=15.3 Hz, H-10a), 4.37 (1H, d, J=15.3 Hz,

H-10b), 4.54 (1H, m, H-6), 4.72 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 4.82 (1H, d, J=8.5 Hz,

H-1), 5.83 (1H, s, H-7), 7.30 (1H, d, J=1.2 Hz, H-3) ; 13

C-NMR spectral data (in D2O,

125 MHz): see Table 14.

EU-5 (5, geniposidic acid)

A white powder, [α]D +12.0° (c = 1.00, MeOH); FAB-MS m/z: 375 [M+H]+ ;

1H-NMR

(in CD3OD, 500 MHz) δ: 2.11 (1H, dd, J=7.9, 15.9 Hz, H-6a), 2.72 (1H, dd, J=7.3, 7.9

Hz, H-9), 2.83 (1H, dd, J=9.2, 15.9 Hz, H-6b), 3.17 (1H, m, H-5), 3.22–3.40 (4H, m,

glc-2, 3, 4, 5), 3.64 (1H, ddd, J=1.2, 4.3, 11.6 Hz, glc H-6), 4.18 (1H, d, J=14.7 Hz,

H-10a), 4.31 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b), 4.71 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 5.15 (1H, d,

J=7.3 Hz, H-1), 5.80 (1H, s, H-7), 7.47 (1H, s, H-3) ; 13

C-NMR spectral data (in

CD3OD, 125 MHz): see Table 14.

87

EU-6 (6, aucubin)

A white powder, [α]D −16.5° (c = 2.50, 50% MeOH); Positive FAB-MS m/z: 369

[M+Na]+ ;

1H-NMR (in D2O, 500 MHz) δ: 2.65 (1H, m, H-5), 2.89 (1H, dd, J=7.9, 7.9

Hz, H-9), 3.21 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz, glc H-2), 3.26–3.40 (3H, m, glc H-3, 4, 5), 3.77

(1H, m, glc H-6a), 3.86 (1H, d, J=12.2 Hz, glc H-6b), 4.17 (1H, d, J=15.9 Hz, H-10a),

4.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-10b), 4.67 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 4.95 (1H, d, J=6.7

Hz, H-6), 5.09 (1H, m, H-1), 5.76 (1H, s, H-7), 6.30 (1H, dd, J=1.8, 6.1 Hz, H-3) ;

13C-NMR spectral data (in D2O, 125MHz): see Table 14.

EU-7 (7, isoquercetin)

A yellow powder, [α]D +7.3° (c = 0.10, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 465 [M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 3.10–3.50 (4H, m, glc H-2, 3, 4, 5), 3.59 (1H, d,

J=11.0 Hz, glc H-6), 5.47 (1H, d, J=7.3 Hz, glc H-1), 6.21 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6),

6.41 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.86 (1H, d, J=9.2 Hz, H’-5), 7.59 (1H, d, J=2.0 Hz,

H’-2), 7.59 (1H, d, J=9.2 Hz, H’-6), 12.64 (1H, s, C5-OH) ; 13


DMSO-d6, 125 MHz): see Table 15.

EU-8 (8, quercetin 3-O-sambubioside)

A yellow powder, [α]D −140.6° (c = 1.00, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 597

[M+H]+ ; 1

H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 3.07–3.49 (m, suger Hs), 3.56 (1H, d,

J=11.6 Hz, glc H-6a), 3.70 (1H, dd, J=5.5, 11.6 Hz, glc H-6b), 4.60 (1H, d, J=7.3 Hz,

xyl H-1), 5.47 (1H, d, J=7.3 Hz, glc H-1), 6.19 (1H, s, H-6), 6.40 (1H, s, H-8), 6.86

(1H, d, J=8.5 Hz, H’-5), 7.57 (1H, d, J=1.8 Hz, H’-2), 7.67 (1H, d, J=1.8, 8.5 Hz,

H’-6), 12.67 (1H, s, C5-OH) ; 13

C-NMR spectral data (in DMSO-d6, 125 MHz): see

Table 15.

88

EU-9 (9, rutin)

A yellow powder, [α]D −139.6° (c = 0.50, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 633

[M+Na]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 1.00 (1H, d, J=6.1 Hz, rha H-6),

3.07–3.49 (m, suger Hs), 3.71 (1H, d, J=10.4 Hz, glc H-6), 4.39 (1H, s, rha H-1), 5.33

(1H, d, J=6.7 Hz, glc H-1), 6.18 (1H, s, H-6), 6.37 (1H, s, H-8), 6.84 (1H, d, J=8.5 Hz,

H’-5), 7.54 (1H, d, J=2.5 Hz, H’-2), 7.67 (1H, d, J=2.5, 10.4 Hz, H’-6), 12.58 (1H, s,

C5-OH) ; 13

C-NMR spectral data (in DMSO-d6, 125 MHz): see Table 15.

EU-10 (10, astragalin)

A yellow powder, [α]D −17.1° (c = 0.10, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 449 [M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 3.62 (1H, d, J=9.2 Hz, glc H-6), 5.51 (1H, d,

J=6.7 Hz, glc H-1), 6.27 (1H, s, H-6), 6.49 (1H, s, H-8), 6.96 (1H, d, J=7.9 Hz, H’-3,

5), 8.10 (1H, d, J=7.9 Hz, H’-2, 6), 12.67 (1H, s, C5-OH) ; 13



EU-11 (11, kaempherol 3-O-rutinoside)

A yellow powder, [α]D −77.2° (c = 0.10, DMSO); HR Positive ESI-MS m/z: 617.1498

(Calcd for C27H30Na1O15: 617.1482) ; 1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 0.99 (1H,

d, J=6.1 Hz, rha H-6), 3.07–3.55 (m, suger Hs), 3.69 (1H, d, J=9.8 Hz, glc H-6), 4.39

(1H, s, rha H-1), 5.29 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 6.16 (1H, s, H-6), 6.37 (1H, s, H-8),

6.87 (1H, d, J=8.5 Hz, H’-3, 5), 12.67 (1H, s, C5-OH) ; 13



EU-12 (12, chlorogenic acid)

A white powder, [α]D −26.1° (c = 0.50, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 355 [M+H]+ ;

89

1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 1.93–2.12 (4H, m, H2-2, H2-6), 3.67 (1H, m, H-4),

4.13 (1H, s, H-5), 5.42 (1H, m, H-3), 6.29 (1H, d, J=15.7 Hz, H’-8), 6.78 (1H, d,

J=8.6 Hz, H’-6), 6.94 (1H, dd, J=8.5, 1.8 Hz, H’-5), 7.04 (1H, s, H’-2), 7.56 (1H, d,

J=15.7 Hz, H’-7) ; 13

C-NMR spectral data (in CD3OD, 125 MHz) δ: 75.1 (C-1), 40.6

(C-2), 73.1 (C-3), 72.7 (C-4), 69.4 (C-5), 38.9 (C-6), 115.2 (C’-1), 146.8 (C’-2), 148.3

(C’-3), 116.5 (C’-4), 122.9 (C’-5), 127.9 (C’-6), 146.8 (C’-7), 115.7 (C’-8), 169.2

(C’-9), 172.1 (COOH).

EU-13 (13, eucomoside A)

A white powder, [α]D +99.1° (c = 0.1, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 415 [M+H]+;

HR positive ESI-MS m/z: 437.1076 [M+Na]+

(Calcd for C18H22NaO11: 437.1059) ;

1H-NMR (in pyridine-d5, 500 MHz) δ: 2.07 (3H, s, acetyl), 3.30 (2H, d, J=8.5 Hz,

H-9), 3.54 (1H, dd, J=2.5, 12.8 Hz, H-4), 3.72 (1H, m, H-5), 4.03 (2H, m, glc H-2, 5),

4.23 (1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, glc H-4), 4.29 (1H, dd, J=8.6, 9.2 Hz, glc H-3), 4.39 (1H,

dd, J=5.5, 11.6 glc H-6a), 4.60 (1H, dd, J=2.1, 12.2 Hz, glc H-6b), 4.78 (1H, d,

J=14.7 Hz, H-10a), 4.85 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b), 5.32 (1H, d, J=7.3 Hz, glc H-1),

5.55 (1H, d, J=7.3 Hz, H-6), 5.67 (1H, d, J=1.2 Hz, H-1), 5.87 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3),

5.90 (1H, s, H-7) ; 13

C-NMR spectral data (in pyridine-d5, 125 MHz): see Table 16.

糖部糖部糖部糖部のののの絶対配置決定絶対配置決定絶対配置決定絶対配置決定

1 (1.0 mg) を 2N 塩酸 (0.2 mL) を用い、約 90°C で 30 分加熱した。反応液を、

Amberlite MB-3 にて中和後、ろ過、減圧下溶媒を留去した。MeOH に再溶解させた

残渣を、旋光度検出器を用いた HPLC [カラム: YMC pack Polyamine II (YMC Co.,

Ltd., 4.6 mm i. d.×250 mm); 溶媒: 80% CH3CN; 流速: 0.8 mL/min; カラム温度:

45°C; 検出器 : JASCO OR-2090 plus; ポンプ: JASCO PU-2080; カラムオーブン:

90

JASCO CO-2060] にて分析し、positive にて 6.7 分 (標品 D-glucose : 7.1 分 :

positive) の retention time を得た。

EU-14 (14, eucomoside B)

A white powder, [α]D −10.6° (c = 0.1, CH3CN); Positive FAB-MS m/z: 544 [M+Na]+;

HR positive FAB-MS m/z: 544.1790 [M+Na]+

(Calcd for C25H31NNaO11: 544.1794) ;

1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 1.88 (1H, dd, J=7.9, 15.9 Hz, H-6a), 2.50 (1H, dd,

J=7.9, 15.3 Hz, H-6b), 2.72 (1H, dd, J=9.2, 9.2 Hz, H-9), 3.09 (1H, dd, J=7.3, 14.0 Hz,

H’-7a), 3.20 (1H, m, H-5), 3.22—3.31 (4H, m, glc H-2, 4, 5, H’-7b), 3.39 (1H, dd,

J=9.2, 9.2 Hz, glc H-3), 3.65 (1H, dd, J=5.5, 12.2 Hz, glc H-6a), 3.85 (1H, dd, J=1.8,

12.2 Hz, glc H-6b), 4.16 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10a), 4.29 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10b),

4.60 (1H, m, H’-8), 4.69 (1H, d, J=7.3 Hz, glc H-1), 5.10 (1H, d, J=7.3 Hz, H-1), 5.69

(1H, s, H-7), 7.14 (1H, dd, J=1.2 Hz, H-3), 7.17 (1H, s, H’-4), 7.20 (2H, s, H’-2, 6),

7.21 (2H, s, H’-3, 5) ; 13


L-Phenylalanine ののののメチルエステルメチルエステルメチルエステルメチルエステル化化化化 (17a)

L-Phenylalanine (16a, 1.0 g, 6.053 mmol) を MeOH (10.0 mL) に溶解し、氷冷下

SOCl2 (1.5 mL) を加えた。室温にて、17 時間撹拌後、減圧下濃縮し、再結晶操作に

て、化合物 17a ( 1.1 g)を 86%の収率で得た。

A colorless crystals, [α]D +34.1° (c = 0.1, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 180

[M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz)

δ: 3.10 (1H, m, H-7a), 3.18 (1H, dd,

J=5.5, 15.3 Hz, H-7b), 3.66 (3H, s, OMe), 4.24 (1H, m, H-8), 7.24 (1H, d, J=7.3 Hz,

H-4), 7.29 (2H, dd, J=1.2, 5.5 Hz, H-2, 6), 7.34 (2H, dd, J=1.8, 5.5 Hz, H-3, 5) δ: 3.10

(1H, m, H-7a) ; 13

C-NMR spectral data (in DMSO-d6, 125MHz): see Table 17.

91

17a とととと geniposidic acid (5) のののの縮合縮合縮合縮合 (18a)

Geniposidic acid (5, 30.0 mg, 0.080 mmol) を DMF (2.0 mL) に溶解後 17a (27.7

mg, 0.128 mmol)、Et3N (0.03 mL, 0.215 mmol)、HOBt (28.5 mg, 0.174 mmol) および

WSC (40.0 mg, 0.209 mmol) を加え、室温にて 17 時間撹拌後、減圧濃縮し silica

gel カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物 18a (42.0 mg) を 98%の収率で得た。

A white powder, [α]D −39.2° (c = 0.1, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 558 [M+Na]+ ;

1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) � δ: 1.91 (1H, m, H-6a), 2.56 (1H, dd, J=8.6, 15.9 Hz,

H-6b), 2.71 (1H, m, H-9), 3.01 (1H, dd, J=9.8, 13.4 Hz H’-7a), 3.19—3.39 (6H, m,

H-5, glc H-2, 3, 4, 5, H’-7b), 3.64 (1H, m, glc H-6a), 3.71 (3H, s, OMe), 3.85 (1H, dd,


H-10b), 4.68 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 4.71 (1H, dd, J=5.5, 9.2 Hz, H’-8), 5.10 (1H,

d, J=7.3 Hz, H-1), 5.72 (1H, s, H-7), 7.10 (1H, s, H-3), 7.21—7.30 (5H, m, H’-2, 3, 4,

5, 6) ; 13


18a のののの脱保護脱保護脱保護脱保護 (19a)

18a (42.0 mg, 0.079 mmol) を MeOH (1.0 mL) に溶解後、 0.5 N NaOH (1.0 mL)

を加え、室温にて 5 時間撹拌後、Shephadex LH 20 を担体とするカラムクロマトグラフィ

ーで精製し、化合物 19a (18.8 mg) を収率 46%で得た。

A white powder, [α]D −52.0° (c = 0.1, CH3CN); Positive FAB-MS m/z: 566 [M

(COONa)+Na]+ ;

1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) � δ: 1.86 (1H, m, H-6a), 2.48 (1H, dd,

J=7.9, 16.5 Hz, H-6b), 2.70 (1H, dd, J=7.3, 7.3 Hz, H-9), 3.08 (1H, dd, J=7.3, 13.4 Hz,

H’-7a), 3.21 (1H, m, H-5), 3.28—3.32 (4H, m, glc H-2, 4, 5, H’-7b), 3.38 (1H, dd,

J=8.3, 9.2, glc H-3), 3.64 (1H, m, glc H-6a), 3.85 (1H, dd, J=1.8, 12.2 Hz, glc H-6b),

4.15 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10a), 4.28 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10b), 4.60 (1H, dd, J=5.8,

7.3 Hz, H’-8), 4.68 (1H, dd, J=2.4, 7.9 Hz, glc H-1), 5.10 (1H, dd, J=2.4, 7.3 Hz, H-1),

92

5.68 (1H, s, H-7), 7.13 (1H, d, J=1.2 Hz, H-3), 7.15—7.25 (5H, m, H’-2, 3, 4, 5, 6) ;

13C-NMR spectral data (in CD3OD, 125 MHz): see Table 16.

D-Phenylalanine ののののメチルエステルメチルエステルメチルエステルメチルエステル化化化化 (17b)

D-Phenylalanine (16b, 1.0 g, 6.053 mmol) を MeOH (10.0 mL) に溶解し、氷冷下


て、化合物 17b (1.1 g) を 81%の収率で得た。

A colorless crystals, [α]D −38.2° (c = 0.1, MeOH); Positive FAB-MS m/z: 180

[M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) � δ: 3.10 (1H, dd, J=7.3, 14.0 Hz, H-7a),

3.20 (1H, dd, J=6.1, 14.7 Hz, H-7b), 3.66 (3H, s, OMe), 4.24 (1H, dd, J=6.1, 7.9 Hz,

H-8), 7.24 (1H, d, J=7.3 Hz, H-4), 7.29 (2H, d, J=6.7 Hz, H-2, 6), 7.33 (2H, d, J=1.2,

7.3 Hz, H-3, 5) ; 13

C-NMR spectral data (in DMSO-d6, 125 MHz): see Table 17.

17b とととと 5 のののの縮合縮合縮合縮合 (18b)

Geniposidic acid (5, 28.9 mg, 0.077 mmol) を DMF (2.0 mL) に溶解後 17b (28.0


WSC (40.0 mg, 0.209 mmol) を加え、室温にて 17 時間撹拌後、減圧濃縮後 silica

gel カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物 18b (35.0 mg) を 85%の収率で得た。


1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 1.89 (1H, m, H-6a), 2.59 (1H, dd, J=8.5, 15.9 Hz,

H-6b), 2.73 (1H, m, H-9), 3.04 (1H, m, H’-7a), 3.18—3.38 (6H, m, H-5, glc H-2, 3, 4,

5, H’-7b), 3.64 (1H, m, glc H-6a), 3.70 (3H, s, OMe), 3.85 (1H, dd, J=1.8, 11.6 Hz,

glc H-6b), 4.16 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10a), 4.29 (1H, d, J=15.3 Hz, H-10b), 4.68 (1H,

dd, J=2.4, 7.9 Hz, glc H-1), 4.73 (1H, dd, J=5.5, 9.2 Hz, H’-8), 5.12 (1H, dd, J=2.4,

7.3 Hz, H-1), 5.72 (1H, s, H-7), 7.17—7.27 (6H, m, H’-2, 3, 4, 5, 6, H-3) ; 13

C-NMR

93

spectral data (in CD3OD, 125 MHz): see Table 16.

18b のののの脱保護脱保護脱保護脱保護 (19b)

18b (35.0 mg, 0.065 mmol) を MeOH (1.0 mL) に溶解後、 0.5 N NaOH (1.0 mL)

を加え、室温にて 5 時間撹拌後、Shephadex LH 20 を担体とするカラムクロマトグラ

フィーで精製し、化合物 19b (25.0 mg) を収率 73%で得た。

A white powder, [α]D −40.2° (c = 0.5, CH3CN); Positive FAB-MS m/z: 544 [M+Na]+ ;


H-9), 3.08 (1H, m, H’-7a), 3.11 (1H, m, H-6b), 3.21 (1H, m, H-5), 3.26—3.31 (4H, m,

glc H-2, 4, 5, H’-7b), 3.38 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz, glc H-3), 3.63 (1H, dd, J=5.2, 11.6

Hz, glc H-6a), 3.84 (1H, dd, J=1.2, 11.6 Hz, glc H-6b), 4.16 (1H, d, J=14.7 Hz,

H-10a), 4.28 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b), 4.55 (1H, dd, J=6.1, 6.7 Hz, H’-8), 4.68 (1H,

dd, J=3.1, 7.9 Hz, glc H-1), 5.10 (1H, d, J=2.4, 7.3 Hz, H-1), 5.72 (1H, s, H-7),

7.12—7.25 (6H, m, H’-2, 3, 4, 5, 6, H-3) ; 13

C-NMR spectral data (in CD3OD, 125

MHz): see Table 16.

EU-15 (15, eucomoside C)

A white powder, [α]D −13.1° (c = 0.5, H2O); HR negative ESI-MS m/z: 559.1980

[M−H]+

(Calcd for C27H31N2O11: 559.1927) ; 1H-NMR (in CD3OD, 500 MHz) � δ: 1.63

(1H, dd, J=7.9, 15.9 Hz, H-6a), 2.24 (1H, dd, J=7.9, 15.3 Hz, H-6b), 2.67 (1H, dd,

J=9.2, 9.2 Hz, H-9), 3.13 (1H, m, H-5), 3.18—3.21 (2H, m, glc H-2, H’-10a),

3.26—3.27 (2H, m, glc H-4, 5), 3.37(1H, m, glc H-3), 3.43 (1H, dd, J=4.3, 14.7 Hz,

H’-10b), 3.63 (1H, dd, J=5.5, 11.6 Hz, glc H-6a), 3.84 (1H, dd, J=1.8, 12.2 Hz, glc

H-6b), 4.12 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10a), 4.29 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10b), 4.61 (1H, d,

J=6.7 Hz, H’-11), 4.65 (1H, d, J=7.9 Hz, glc H-1), 5.06 (1H, d, J=7.3 Hz, H-1), 5.58

94

(1H, s, H-7), 6.98 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H’-5), 7.06 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H’-6),

7.09 (1H, s, H’-2), 7.11 (1H, s, H-3), 7.30 (1H, d, J=8.6 Hz, H’-7), 7.57 (1H, d, J=7.9

Hz, H’-4) ; 13


L-Tryptophan ののののメチルエステルメチルエステルメチルエステルメチルエステル化化化化 (17c)

L-Tryptophan (16c, 1.0 g, 4.896 mmol) を MeOH (10.0 mL) に溶解し、氷冷下


て、化合物 17c (626.4 mg) を 50%の収率で得た。

A colorless crystals, [α]D +134.6° (c = 0.5, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 219

[M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) � δ: 3.30 (1H, m, H-10), 3.65 (3H, s, OMe),

4.19 (1H, dd, 6.7, 6.7 Hz, H-11), 7.01 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H-5), 7.09 (1H, dd,

J=7.3, 7.9 Hz, H-6), 7.24 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2), 7.37 (1H, d, J=7.9 Hz, H-7), 7.51

(1H, d, J=7.9 Hz, H-4), 8.56 (2H, s, NH2), 11.1 (1H, s, NH) ; 13

C-NMR spectral data

(in DMSO-d6, 125MHz): see Table 17.

17c とととと 5 のののの縮合縮合縮合縮合 (18c)

Geniposidic acid (5, 27.0 mg, 0.072 mmol) を DMF (2.0 mL) に溶解後 17c (18.0



gel カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物 18c (27.8 mg) を 67%の収率で得た。

A white powder, [α]D −60.9° (c = 0.5, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 575 [M+H]+ ;


H-6b), 2.71 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz, H-9), 3.18—3.37 (7H, m, glc H-2, 3, 4, 5, H-5,

H’-10a, 10b), 3.63 (1H, m, glc H-6a), 3.71 (1H, s, OMe), 3.85 (1H, dd, J=1.8, 11.0 Hz,

glc H-6b), 4.15 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10a), 4.27 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10b), 4.67 (1H,

95

d, J=4.3, 8.6 Hz, H’-11), 4.77 (1H, dd, J=5.5, 8.6 Hz, glc H-1), 5.10 (1H, dd, J=4.3,

7.3 Hz, H-1), 5.67 (1H, s, H-7), 7.01 (1H, dd, J=7.2, 7.9 Hz, H’-5), 7.08—7.10 (3H, m,

H-3, H’-2, 6), 7.34 (1H, dd, J=4.3, 7.9 Hz, H’-7), 7.53 (1H, dd, J=4.3, 7.9 Hz, H’-4) ;


18c のののの脱保護脱保護脱保護脱保護 (19c)

18c (27.8 mg, 0.048 mmol) を MeOH (1.0 mL) に溶解後、0.5 N NaOH (1.0 mL)

を加え、室温にて 5 時間撹拌後、Shephadex LH 20 を担体とするカラムクロマトグラ

フィーで精製し、化合物 19c (11.0 mg) を収率 41%で得た。


1H NMR (in CD3OD, 500 MHz) δ: 1.61 (1H, m, H-6a), 2.21 (1H, dd, J=8.5, 15.9 Hz,

H-6b), 2.67 (1H, dd, J=6.7, 7.9 Hz, H-9), 3.13 (1H, dd, J=8.3, 15.3 Hz, H-5), 3.20 (1H,

dd, J=7.9, 8.5 Hz, glc H-2), 3.24—3.40 (3H, m, glc H-4, 5, H’-10a), 3.37 (1H, m, glc

H-3), 3.45 (1H, dd, J=4.9, 14.9 Hz, H’-10b), 3.64 (1H, dd, J=5.2, 12.0 Hz, glc H-6a),

3.84 (1H, dd, J=1.8, 11.6 Hz, glc H-6b), 4.12 (1H, d, J=14.7 Hz, H-10a), 4.24 (1H, d,

J=14.7 Hz, H-10b), 4.63 (1H, d, J=5.2, 6.7 Hz, H’-11), 4.66 (1H, d, J=4.3, 7.3 Hz, glc

H-1), 5.01 (1H, dd, J=4.3, 7.3 Hz, H-1), 5.56 (1H, s, H-7), 6.95 (1H, dd, J=7.3, 7.3 Hz,

H’-5), 7.03 (1H, dd, J=7.3, 7.7 Hz, H’-6), 7.06 (1H, d, J=3.7 Hz, H’-2), 7.08 (1H, d,

J=4.3 Hz, H-3), 7.29 (1H, dd, J=4.9, 7.9 Hz, H’-7), 7.57 (1H, d, J=3.7, 8.5 Hz, H’-4) ;


D-Tryptophan ののののメチルエステルメチルエステルメチルエステルメチルエステル化化化化 (17d)

D-Tryptophan (16d, 1.0 g, 4.896 mmol) を MeOH (10.0 mL) に溶解し、氷冷下

SOCl2 (1.5 mL) を加えた。室温にて 17 時間撹拌後、減圧下濃縮し、再結晶操作に

て、化合物 17d (861.7 mg) を 69%の収率で得た。

96

A colorless crystals, [α]D −129.3° (c = 0.5, DMSO); Positive FAB-MS m/z: 219

[M+H]+ ;

1H-NMR (in DMSO-d6, 500 MHz) δ: 3.33 (1H, m, H-10), 3.64 (3H, s, OMe),

4.19 (1H, dd, 6.7, 6.7 Hz, H-11), 7.01 (1H, dd, J=7.9, 7.9 Hz, H-5), 7.09 (1H, dd,

J=7.9, 7.9 Hz, H-6), 7.26 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 7.38 (1H, d, J=7.9 Hz, H-7), 7.52

(1H, d, J=7.9 Hz, H-4), 8.68 (2H, s, NH2), 11.1 (1H, s, NH) ; 13

C-NMR spectral data

(in DMSO-d6, 125MHz): see Table 17.

17d とととと 5 のののの縮合縮合縮合縮合 (18d)

Geniposidic acid (5, 27.0 mg, 0.072 mmol) を DMF (2.0 mL) に溶解後 17d (25.4



gel カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物 18d (34.3 mg)を 83%の収率で得た。


1H NMR (in CD3OD, 500 MHz) � δ: 1.89 (1H, m, H-6a), 2.47 (1H, dd, J=8.6, 15.9 Hz,

H-6b), 2.70 (1H, dd, J=7.3, 14.7 Hz, H-9), 3.12 (1H, dd, J=7.9, 16.5 Hz, H-5),

3.20—3.40 (6H, m, glc H-2, 3, 4, 5, H’-10a, 10b), 3.64 (1H, dd, J=5.5, 11.0 Hz, glc

H-6a), 3.71 (1H, s, OMe), 3.85 (1H, dd, J=1.8, 11.6 Hz, glc H-6b), 4.16 (1H, d,

J=13.4 Hz, H-10a), 4.28 (1H, d, J=14.0 Hz, H-10b), 4.68 (1H, d, J=3.7, 7.9 Hz,

H’-11), 4.80 (1H, dd, J=5.5, 7.9 Hz, glc H-1), 5.11 (1H, dd, J=3.7, 6.7 Hz, H-1), 5.68

(1H, s, H-7), 7.00 (1H, m, H’-5), 7.06—7.10 (2H, m, H’-2, 6), 7.20 (1H, m, H-3), 7.34

(1H, d, J=3.7, 7.9 Hz, H’-7), 7.52 (1H, dd, J=3.7, 7.9 Hz, H’-4) ; 13

C-NMR spectral

data (in CD3OD, 125 MHz): see Table 16.

18d のののの脱保護脱保護脱保護脱保護 (19d)

18d (34.3 mg, 0.059 mmol) を MeOH (1.0 mL) に溶解後、0.5 N NaOH (1.0 mL)

97

を加え、室温にて５時間撹拌後、Shephadex LH 20 を担体とするカラムクロマトグラフィ

ーで精製し、化合物 19d (24.3 mg) を収率 73%で得た。

A white powder, [α]D −62.2° (c = 0.5, MeOH); positive FAB-MS m/z: 583 [M+Na]+ ;

1H NMR (in CD3OD, 500 MHz) � δ: 1.93 (1H, m, H-6a), 2.61 (2H, m, H-6b, H-9), 2.95

(1H, dd, J=7.9, 17.1 Hz, H-5), 3.19—3.38 (5H, m, glc H-2, 3, 4, 5, H’-10a), 3.42 (1H,

dd, J=5.5, 13.4 Hz, H’-10b), 3.63 (1H, dd, J=5.5, 12.8 Hz, glc H-6a), 3.83 (1H, dd,


H-10b), 4.62 (1H, dd, J=5.5, 9.1 Hz, H’-11), 4.69 (1H, dd, J=2.4, 7.9 Hz, glc H-1),

5.03 (1H, dd, J=3.1, 7.9 Hz, H-1), 5.68 (1H, s, H-7), 7.01 (1H, dd, J=7.6, 7.9 Hz,

H’-6), 7.06 (2H, s, H’-2, H-3), 7.27 (1H, dd, J=3.1, 11.6 Hz, H’-7), 7.53 (1H, dd,

J=3.7, 7.9 Hz, H’-4) ; 13


HPLC でのでのでのでの分析条件分析条件分析条件分析条件のののの検討検討検討検討

HPLC での測定条件の検討は、EGLE を 10 mg/mL に調整したものを用いて分離

能が高い溶出プログラムを組んだ。さらに、得られたそれぞれの化合物を 1mg/mL に

調整したものを標品として用いた。この標品を各成分で 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.1

mg/mL に希釈したものを分析して検量線を引いた。HPLC による測定条件を以下に

示す。

カラム： YMC-Pack ODS-A S-5µm,12nm AA12S05-1506WT

溶媒： HPLC 用 MeOH：H2O：H3PO4 = 130：870：1

カラム温度： 40℃

検出波長： 245 nm

流速： 1.0 mL/min.

注入量： 20 µl

98

第第第第３３３３章章章章にににに関関関関するするするする実験実験実験実験

その他事項は本論中参照。

99

引用文献引用文献引用文献引用文献

1. Chinese Materia Medica Dictionary Jiangsu, New Medical College, ed. Shanghai

Science and Technology Publishing House, Shanghai, 1031 (1977).

2. Nakazawa Y., Thesis of Kyusyu University, Fukuoka, Japan (1998).

3. Deyama T., Thesis of Nagoya-City University, Nagoya, Japan (1987).

4. Bianco A., Iavarone C., Trogolo C., Tetrahedron, 30, 4117-4121 (1974).

5. Kato A., Inobana Y., Ichimaru T., Hashimoto Y., 33rd Annual Meeting of Japanese

Pharmaceutical Science, Abstract Papers, 47 (1986).

6. Kato A., Inobana Y., Ichimaru T., Hashimoto Y., 34rd Annual Meeting of Japanese

Pharmaceutical Science, Abstract Papers, 146 (1987).

7. Hattori M., Che Q. M., Gewali B., Nomura Y., Tezuka Y., Kikuchi T., Namba T.,

Shoyakugaku Zasshi, 42, 76-80 (1988).

8. Tanaka C., Nakamura Y., Nakazawa Y., Nohara T., Chem. Pharm. Bull.,45,

1379-1380 (1997).

9. Nakamura T., Nakazawa Y., Onizuka S., Tanaka C., Yahara S., Nohara T., Nat.

Med., 51, 275-277 (1997).

10. Nakamura T., Nakazawa Y., Onizuka S., Tanaka C., Yahara S., Nohara T., Nat.

Med., 52, 460 (1998).

11. Namba T., Hattori Y., Yie J. –N., Ma Y. –H., Nomura Y., Kaneko S., Kitamura Y.,

Koizumi T., Katayama K., Lu W., WakanIyakugaku Zasshi, 3, 89-97 (1986).

12. Imai T., Kishi T., Inoue H., Nishiyama N., Saito H., Yakugakuzasshi, 108, 572-575

(1988).

13. Metori K., Ohashi S., Takahashi S., Tamura T., Biol. Pharm. Bull., 17, 917-920

(1994).

100

14. Lee MK., Kim MJ., Cho SY., Park SA., Park KK., Jung UJ., Park HM., Choi MS.,

Diabetes Res. Clin. Pract., 67, 22-28 (2005).

15. Park SA, Choi MS, Jung UJ, Kim DJ., Park HM., Park YB., Lee MK., J. Med.

Food, 9, 474–479 (2006).

16. Choi MS., Jung UJ., Kim HJ., Do GM., Jeon SM., Kim MJ., Lee MK., Am. J. Chin.

Med., 36, 81 (2008).

17. Nakazawa Y., Odagiri N., Imai R., Yoshii T., Tagashira E., Nakata C., Nakamura

T., Asaumi M., Onizuka S., Yahara M., Nohara T., Nat. Med., 51 , 392-398

(1997).

18. Uezono K., Kawasaki K., Abe K., Kagiyama S., Amamoto T., Nakazawa Y.,

Nakata C., Onizuka., S., Therapeutic. Res.,18, 94-97 (1997).

19. Kajimoto O., Ueda T., Yamaguchi Y., Tanabe K., Nakagawa S., Kajimoto Y.,

Health Sciences, 21, 198-211 (2005).

20. Matsuzawa, Y. Atherosclerosis Supplements, 6, 7-14 (2005).

21. 伊藤裕, 日本臨床, 61, 1842-1843 (2003).

22. Liu D., & Li CW., Shanxi Chinese Medicine, 1, 27–30 (1980).

23. Shanxi Province Eucommia Clinical Review Committee, Shanxi Eucommia

Development Company, 19–54 (1986).

24. Yamauchi T., Kamon J., Waki H., Murakami K., Motojima K., Komeda K., Ide T.,

Kubota N., Terauchi Y., Tobe K., Miki H., Tsuchida A., Akanuma Y., Nagai R.,

Kimura S., Kadowaki T., J. Biol. Chem., 276, 41245-41254 (2001).

25. Moon B., Kwan JJ., Duddy N., Sweeney G., Begum N., Am. J. Physiol. Endocrinol.

Metab., 285, 106-115 (2003).

26. Kavitha R., Nalini N., Med. Sci. Res., 28, 17–21 (2000).

27. Tanabe K., Ohara T., Yamaguchi Y., Ueda T., 124rd Annual Meeting of

101

Pharmaceutical of Japan, Abstract Papers, 3, 114 (1987).

28. Lowell BB., Spiegelman BM., Nature., 404, 652-660 (2000).

29. Ando C., Kobayashi T., Tsukamoto S., Hirata T., Yamaguchi Y., Ueda T.,

International Symposium on Eucommia ulmoides, 1, 63-66 (2007).

30. Fujikawa T., Hirata T., Wada A., Kawamura N., Yamaguchi Y., Fujimura K., Ueda

T., Yurugi Y., Soya H., Nishibe S., Br. J. Nutr., 104, 1868-1877 (2010).

31. Tanaka C., Kato R., NEW Pharmacology, 5, 501-505 (2007).

32. Sun Y., Dong J., Wu S., Zhongyaocai, 27, 341-343 (2004).

33. El-Naggar L. J., Beal J. L., J. Nat. Prod., 43, 649-707 (1980).

34. Harborne J. B., Mabry T. J., 19K-134, Chapman & Hall, London (1982).

35. Webby R. F., Phytochemistry, 30, 2443-2444 (1991).

36. Buckingham J., 961 Chapman & Hall, New York, NY (1982).

37. Takamura C., Hirata T., Yamagushi Y., Ono M., Miyashita H., Ikeda T., Nohara T.,

Nat. Med, 61, 220-221 (2007).

38. Takamura C., Hirata T., Ueda T., Ono M., Miyashita H., Ikeda T., Nohara T., J.Nat.

Prod., 70, 1312-1316 (2007).

39. Yamauchi T., Kamon J., Waki H., Terauchi Y., Kubota N., Hara K., Mori Y., Ide T.,

Murakami K., Tsuboyama-Kasaoka N., Ezaki O., Akanuma Y., Gavrilova O.,

Vinson C., Reitman ML., Kagechika H., Shudo K., Yoda M., Nakano Y., Tobe K.,

Nagai R., Kimura S., Tomita M., Froguel P., Kadowaki T., Nat. Med., 7, 941-946

(2001).

40. Yamauchi T., Kamon J., Minokoshi Y., Ito Y., Waki H., Uchida S., Yamashita S.,

Noda M., Kita S., Ueki K., Eto K., Akanuma Y., Froguel P., Foufelle F., Ferre P.,

Carling D., Kimura S., Nagai R., Kahn BB., Kadowaki T., Nat. Med., 8,

1288-1295 (2002).

102

41. Cho AS., Jeon SM., Kim MJ., Yeo J., Seo KI., Choi MS., Lee MK., Food Chem.

Toxicol., 48, 937-941 (2010).

42. Hirata T., Kobayashi T., Wada A., Ueda T., Fujikawa T., Miyashita H., Ikeda T.,

Tsukamoto S., Nohara T., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21, 1786-1791 (2011).

103

謝辞謝辞謝辞謝辞

終わりに臨み、杜仲茶の黎明期から研究のきっかけを戴いた熊本大学大学院医学

薬学研究部野原稔弘名誉教授、故九州東海大学農学部長戸田義宏教授に

厚く御礼申し上げます。

併せて、本論文を纏めるに際し、直接御指導、御鞭撻を賜りました熊本大学大学院

生命科学研究部薬学系塚本佐知子教授、池田剛准教授、礒濱洋一郎准

教授、杉浦正晴准教授に厚く御礼申し上げます。

本研究の薬理作用に直接的な御指導、御助言、御支援を戴きました日本杜仲研究

会会長、北海道医療大学西部三省名誉教授、同会理事、岡山大学大学院医歯

薬学総合研究科川崎博己教授、同会監事、鈴鹿医療科学大学薬学部藤川

隆彦教授に心より御礼申し上げます。

さらに、本研究で有益なる御指導、御助言、御支援を戴きました九州東海大学農学

部小野政輝教授、成分探索で御支援戴きました崇城大学薬学部宮下裕幸助

教、多大な御協力を戴いた熊本大学大学院卒業生高村千香女史に深く感謝申し

上げます。

本研究の遂行にあたり多大な御支援、御指導を戴きました小林製薬株式会社

辻野隆志事業部長、難波俊夫中央研究所所長、上田太郎開発部長、藤村

勝行研究開発部長、和田篤敬開発部長、中島賢治課長、山口康代課長に

厚く御礼申し上げます。また、数々の御協力を戴きました中央研究所の杜仲研究メン

バー、坪井崇氏、川村直美氏、塚本真也氏、安藤千穂氏、小林健夫氏、

中川千久沙氏、冨田和沙氏、細尾信悟氏、山口能宏氏、グループの皆様

に感謝申し上げます。

全てのきっかけを創って戴いた、元日立造船株式会社技術研究所鬼塚重則研

究主幹、大阪大学大学院工学研究科中澤慶久教授に厚く御礼申し上げます。

最後に、終始暖かく見守り、御支援下さいました家族に感謝致します。

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