1

DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie

2

Mol. biologická diagnostika• diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů

• analýza kvalitativní i kvantitativní• proč se provádí

• detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence• např. identifikace živočiš. druhu nebo jedince

• analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny• stanovení genotypu

• např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů• kvantifikace nukleové kyseliny (RNA) se

specifickou sekvencí• hodnocení intenzity a změny exprese genů (např.

tumory)• kvantifikace proteinů a typů jejich post-translační

modifikace• nejpoužívanější techniky

• DNA • PCR, RFLP (analýza délky restrikčních fragmentů),

elektroforéza, S-hybridizace, exprese, klonování• RNA

• reverzní transkripce, kvantifikace, N-blotting, • proteiny

• PAGE elektroforéza, W-blotting, protilátky, imuno- precipitace, ELISA, kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektroskopie, ..

3

Izolace nukl. kyselin a proteinů• lýza buněk či tkání (lyzační pufry)

• složení pufru odpovídá záměru (lysozym, proteinázy, detergenty, chelatační činidla)

• odstranění ostatních kontaminujících částí s výjimkou požadovaného výsledného materiálu• izolace nukl. kyselin na základě

• rozdílné rozpustnosti

• adsorpce na pevný podklad

• ultracentrifugace

4

Elektroforéza DNA nebo proteinů• základní separační technika při analýze nukleových

kyselin nebo proteinů• principem separace je pohyb nabitých molekul (v

případě DNA negativně nabitých fosfátů k anodě) v elektrickém poli• v pevném nosiči (gel) a vodivém pufru

• gely • polyakrylamidové (PAGE) = vertikálně• agarózové = horizontálně

• elektroforézy horizontální či vertikální, popř. kapalinové

• rychlost pohybu v gelu je nepřímo úměrná (logaritmu) velikosti molekuly • velikost konkrétní molekuly se určí pomocí velikostních

standardů• po separaci (při určité hodnotě mV po určitou dobu) je

nutno separované molekuly zviditelnit• DNA

• dvojvláknová – ethidium bromid (interkalace) + UV• jednovláknová – SYBR green nebo barvení stříbrem

• proteiny• přímo v gelu (Coomassie modř)• po W-blottingu protilátkami na membráně

• modifikace• pulzní elektroforéza• denaturační gradientová (DDGE)• SSCP• heteroduplexy

5

Elektroforéza - postup

6

Elektroforéza DNA

7

Elektroforéza proteinů

8

Identifikace proteinů: W-blotting

9

Manipulace s nukl. kyselinami• amplifikace (n-kopií)

• Polymerase Chain Reaction (PCR)• enzymy, které specificky zasahují do jejich struktury

(spec. DNA nebo RNA)• polymerázy – syntetizují nukl. kyseliny• fosfatázy, kinázy, metylázy – modifikují• ligázy – spojují nukl. kyseliny• nukleázy – odbourávají, štěpí

• restrikční endonukleázy = sekvenčně specifické enzymy bakterií (obrana před bakteriofágy) - >3500 enzymů• rozpoznávací místo (často palindrom)• názvy podle rodového a druhového jména organizmu (např. )

• klonování do vektorů• hybridizace

• různá pevnost kovalentních a vodíkových vazeb v DNA• schopnost denaturace x renaturace• hybridizační sondy

• hybridizace na membráně, in situ (FISH)

10

Klonování DNA• jedna z nejzákladnějších metod molekulární biologie

• studium struktury a funkce genů (kódujících i regulačních oblastí)

• produkce rekombinantních proteinů (genové inženýrství)• tvorba genových (cDNA) knihoven • tvorba transgenních organizmů

• klonování = proces tvorby klonů• klon = soubor identických dceřinných buněk (organizmů)

vzniklých mitózou z jedné mateřské buňky• molekulární (DNA) klonování = tvorba klonů DNA

• tvorba rekombinantních molekul DNA množením v hostitelské buňce • rekombinantní DNA = vznikla spojením DNA fragmentu (inzertu)

a vektoru in vitro

• vektor = systém, který má schpnost přijmout cizorodou DNA a replikovat se v hostitelské buňce• plazmidové vektory• bakteriofágové vektory• umělé chromozomy (bakteriální, bakteriofágové nebo

kvasinkové)• viry

• proces klonování• příprava rekombinantní DNA (vpravením inzertu do

vektoru) • inzert – DNA izolovaná z organizmu, cDNA, produkt PCR

• přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky (= transformace bakterií, typicky E. coli)• chemicky nebo elektricky

• selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA• součástí vektoru je gen kódjící rezistenci k určitímu antibiotiku,

bakterie bez vektoru nerostou na půdě s antibiotikem• pomnožení rekombinantích klonů a jejich další použití

• transfekce eukaryontních buěk, exprese proteinu, …

11

Klonování DNA - využití• klonování = tvorba klonů (identických molekul

DNA)• rekombinantní DNA vznikne spojením inzertu

(cizorodé DNA) s vektorem• aplikace

• studium funkce izolovaných genů• studium regulačních oblastí genů• fyzikální a genetická analýza genomů• exprese cizorodých genů a tvorba

rekombinantních proteinů

12

Příklad – komerční klonovací vektor

13

Klonování - postup

14

ATB selekce transformovaných bakterií

15

Klonování DNA není klonování organizmu

16

Enzymy pro manipulaci s DNA• všechny enzymy mají substrátovou

specifitu – tedy DNA nebo RNA• restrikční endonukleázy

• sekvenčně specifické enzymy produkované kmeny většiny bakterií (slouží jim k degradaci cizorodé DNA , např. plazmidu nebo bakteriofága)

• dnes známo cca 3 500 enzymů (procca 160 různých sekvencí)• název podle rodového a druhového

jména bakterie• např. Eco (E. coli), Hae (Haemophilus

aegypticus), Sau (Staphyloccocus aureus)

• rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů – 4 – 8bp (rozpoznávací místo je často palindrom) a tak štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznané sekvence

• vznikají restrikční fragmenty ( restrikční mapa)

• DNA polymerázy• připojování nukleotidů v 5’ 3’ směru

17

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)• charakterizace DNA pomocí

jejího štěpení enzymy - restrikčními endonukleasami na fragmenty• identifikace a analýza produktů

štěpení se provádí elektroforetickým dělením

• za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí)• počet i délka fragmentů je pro

daného jedince specifická • využití

• mutací v daném úseku DNA se může ztrácet nebo naopak vytvářet restrikční místo• RFLP často následuje po

amplifikaci DNA pomocí PCR k definitivnímu určení genotypu

• určení totožnosti (forenzní účely, paternita)

18

Hybridizace nukl. kyselin• používá se k vyhledávání

známých sekvencí v genových knihovnách a na chromozomech

• využívá se schopnosti DNA denaturovat (při vysoké teplotě) a zpětně renaturovat • kovalentní vazby kostry jsou

mnohem pevnější než vodíkové vazby mezi páry bází

• při přítomnosti značené sondy část komplementární sekvence DNA renaturuje s ní

• provádí se • přímo na buňkách• po blottingu na membráně• na řezech tkání (in situ)

• sondy• značeny radioaktivně (32P, 35S)• značení fluorescenční

• např. FISH (fluorescent in situ hybridisation)

19

Southern hybridisation

20

FISH

21

cDNA knihovny• geny má určitý živočišný

druh v kompletní výbavě v jádře každé jednotlivé buňky

• ovšem exprese jednotlivých genů je specifická pro jednotlivé tkáně a různé situace• zdraví nemoc• ovlivňení nějakou látkou

bez ovlivnění

• pokud se izoluje RNA z nějaké tkáně či skupiny buněk, přepíše se reverzní transkripcí do cDNA a ta se naklonuje do bakterií, vzniká tzv. icDNA knihovna, ve které se dají vyhledávat specifické geny, porovnávat kvantita jejich exprese atd.

22

Microarrays

23

PCR• popsal v r. 1983 Kary Mullis, 1993

Nobelova cena• princip

• enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace ~95°C, annealing ~60°C, extenze ~72°C)

• komponenty reakční směsi pro PCR• voda• pufr• dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT)• MgCl2• termostabilní DNA polymeráza (například

Taq z bakterie Thermus aquaticus) • oligonukleotidové sondy (“primery”)• templátová DNA

• teplotní režim• 1) 95ºC 2‘ iniciální denaturace• 2) 96ºC 30‘‘denaturace• 3) 40-72ºC 20‘‘ annealing• 4) 72ºC 30‘‘ elongace

• kroky 2 – 4 celkem 30x• 5) 72ºC 5‘ závěrečná elongace• 6) 4ºC 10‘ zchlazení

24

PCR• produkt PCR reakce je možno

zviditelnit UV světlem po elektroforetickém rozdělení (nejč. v horizontálním 1 - 3% agarózovém gelu) a obarvení interkalačními barvivy

25

Sekvenování DNA• metoda ke zjištění primární sekvence

úseku DNA• nejčastěji se používá modifikací tzv.

Sangerovy metody• je založena na PCR a používá kromě základních

nukleotidů ještě značené ddNTP (= terminátor reakce katalyzované DNA polymerázou)• radioaltivně značené ddNTP – nutné 4 separátní

reakce• fluorescenčně značené ddNTP – pouze 1 reakce

26

Sekvenování DNA

27

DNA diagnostika• proč se provádí

• detekce přítomnosti nukleové kyseliny (detekce přítomnosti specifické sekvence)• např. identifikace živočiš. druhu• identifikace jedince (forenzní)

• analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny

• stanovení genotypu • např. detekce klinicky významných

mutací a polymorfizmů• dědičné choroby• mutace v onkogenech a supresorových

genech v nádorech • kvantifikace nukleové kyseliny se

specifickou sekvencí• microarrays

• cytogenetika • chromozomové aberace• karyotyp

28