Sekvenování DNA

MUDr. Michal Jurajda

ÚPF LF MU Brno

Sekvenování DNA

Pojmem sekvenování DNA rozumíme proces určení pořadí jednotlivých bází v molekule DNA.

Sekvenujeme oligonukleotidy DNA (kolem 500 bp, 1000 bp horní hranice)

Sekvenování DNA

Metody sekvenování jsou založeny na:1. specifickém štěpení DNA (Maxam-Gilbert)

2. stop – syntéze (Sanger)

3. postupné syntéze (pyrosequencing)

4. ligaci sond (sequencing-by-ligation, SOLiD™)

Základní princip 1. 2.

Produkce značených oligonukleotidů zakončených specifickou bází

Separace oligonukleotidů pomocí elektroforézy (desky, kapilára)

Detekce fragmentů (autoradiografie, fluorescence)

1. Maxam-Gilbert

Podobně jako Sangerova metoda produkuje směs značených oligonukleotidů různé délky, ovšem pomocí specifického štěpení sekvenované DNA

Svého času rozšířená metoda i přes četné nevýhody (nebezpečné chemikálie, pracný postup)

2. Sangerova metoda

Využívá DNA polymerázy a tzv. „stop nukleotidů“

Při syntéze DNA podle templátu, který představuje sekvenovanou DNA, získáváme směs oligonukleotidů různé délky, které končí specifickou bází

Stále nejpoužívanější postup

Možnosti značení

Dideoxynukleotidy Při Sangerově metodě

používáme dideoxynukleotidy, na které už se nemůže navázat další deoxynukleotid a syntéza řetězce DNA je ukončena.

Pracujeme se 4 paralelními reakcemi. Každá reakční směs se liší přídavkem jednoho ddNTP

ddNTP se přidává v malém množství k dNTP, aby vznikaly náhodně produkty různé délky

2,3- dideoxy

2- deoxy

Uděláme-li 4 reakce se zastavováním v pozicích čtyř různých nukleotidů a naneseme výsledky reakcí paralelně do čtyř drah gelu, můžeme číst úplnou sekvenci od 3’-konce primeru:

A T C G C T A A C T G C C T G C A C…

směr pohybu produktů v gelu

A

Fluorescenční značení

Čtyři terminační nu-kleotidy jsou zna-čeny každý jiným fluorescenčním barvivem

reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu nukleotidu v místě terminace

Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování

zkumavka s fluo-rescenčně znače-nými produkty sekvenování

kapilára naplněná polyakrylamidovým gelem

mol

ekul

y se

tříd

í

podl

e ve

likos

ti

excitace emise jedné ze 4 vlnových délek podle typu fluorescenčního barviva, kterým je označen právě procházející nukleotid

Kapilární elektroforéza - detail

http://www.appliedbiosystems.com/lib/multimedia/3100/212k/DSWMEDIA/3100.cfm

Pyrosekvenování

Sekvenování v průběhu syntézy komplementárního vlákna

Postupně se přidáváni nukleotid trifosfáty a sleduje se, který nukleotid se naváže.

Enzyme cascade system

PPi

ATP

Detection of the light

light

time

SOLiD systém