Epigenetika- metylace DNA

Metylace DNA u Eukaryot

nemetylovaná DNA: kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice Caenorhabditis

savci: 3-8 % cytosinových zbytků, CG sekvence(u embryonálních kmenových buněk i v non-CG kontextu)- nízký výskyt CG v repetitivních heterochromatinových oblastech (mutageneze metylC)

rostliny: 25-30 % cytosinových zbytků (~ velikosti genomu)- především v repetitivních heterochromatinových oblastech(pravidelný výskyt nemetylovaných míst – SAR, MAR)- u větších genomů (obiloviny) ostrovy transkripčně aktivní DNA s nižším obsahem metC - metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích exprimovaných genů!!!

Úloha a projevy metylace DNA- dědičná (mitoticky a částečně i meioticky) modulace transkripce - genové exprese

- obranný mechanismus vůči invazní DNA (transpozóny)- regulace genové exprese (ontogeneze, diferenciace a

buněčná paměť, reakce na stres) - parentální imprinting

- modulace struktury chromatinu (příčina i následek)- časování DNA replikace- regulace homologní rekombinace (meiosa)- definování hranic exon-intron

- nástroj evoluce - genomů polyploidních rostlin (rozsáhlé změny metylace)- nových genů (mutageneze pseudogenů)

Metylace DNA u Arabidopsis

„Chromosome epigenetic landscape“

? ?

Silná metylace v repetitivních heterochromatinových oblastech v okolí centromery

Metylace genů (CpG)Metylace v kódujících sekvencích genů – více než 30 % exprimovaných genů (metylace především u genů se stabilní expresí – house keeping)

Metylace v promotorech – u méně než 5 % genů (geny s vývojově a pletivově specifickou expresí)

Coleman-Derr and Zilberman 2012

- metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z- H2A.Z patrně nevhodný/neumožňuje stabilní transkripci (house-keeping genů)

( )

Mechanismus metylace DNA

- metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie – restrikce cizorodé DNA)

Eukaryota - biologicky významná metylace cytosinu na C5 purinového kruhu (u savců i hydroxymethylC)

N

N

NH

C*

H

O

CH3

5-methyl cytosine

N

N

NH

C

H

O

cytosine

+ SAM N

N

OH

TO

CH3

thymine

+ H2O- NH3

„horký bod mutageneze“

Mutace zprostředkované metylací C

C TmetC G

TG

CG

TA

Možná role v evoluci genů (hypotetický scénář):- zdvojení sekvencí (např. po polyploidizaci) navodí metylaci - metylace navodí reversibilní inaktivaci- mutace metC může navodit irreversibilní inaktivaci - kopie genu může být postupně masivně mutována

(bez selekčního tlaku)

- vznik a reaktivace genu s novou funkcí (x model EAC)

replikace reparace

Metylace DNA – cílové sekvence- symetrické (palindromatické), polosymetrické i nesymetrické sekvence:

5’ -------CG-------CHG----------C---C------G--C---- 3’3’ -------GC-------GDC----------G---G------C--G---- 5’

Symetrické sekvence – snadné udržování při replikaci hemimetylovaný stav je signálem pro udržovací metylaci

----C*G------------- C*HG---------- C* ----------------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ----------------G C*----

-----CG -------------CHG -----------C-------------GC* -------------GDC*-----------G--------

Asymetrické sekvence – nutno neustále metylovat de novo (principielně je ale také udržovací, pokud byla na mateřském vlákně)

- signál: metylace histonů a sRNAs

(H = A, T nebo C; D = A,T,G)

Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy

- 3 rodiny u Arabidopsis

MET1 (metyltransferase)

CMT3 a CMT2 (chromomethyltransferase, „chromomethylase“)

DRM2 (a DRM1) (domain rearranged methyltransferase)

MET1 (metyltransferase1)

- příbuzná savčí Dnmt1

- udržovací metylace symetrických CG

- asociovaná s replikací

- spoluúčast komplexu remodulujícího nukleosómy DDM1 (u heterochromatinových sekvencí)

Signál – hemimetylovaná CG sekvence

----C*G------------- C*HG---------- C* ----------------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ----------------G C*----

-----CG -------------CHG -----------C-------------GC*-------------GDC*-----------G--------

CMT3 (chromomethylase3)

- unikátní pro rostliny a houby (příbuzné savčím Dnmt1, ale navíc obsahují chromodoménu = doménu interagující s metK histonu

- asociovaná především s konstitutivním heterochromatinem (repetitivní sekvence, TE - retrotranspozóny)

- „udržovací“ metylace sekvencí CHG

- zřejmě kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein)

Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 - (interakce zprostředkovaná chromodoménou)

----C*G------------- C*HG---------- C* ----------------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ----------------G C*----

-----CG ------------- CHG -----------C-------------GC* -------------GDC*-----------G--------

CMT2 (chromomethyltransferase2)

- příbuzná CMT3, rovněž obsahuje chromodoménu

- asociovaná s konstitutivním heterochromatinem

- „udržovací“ metylace sekvencí CHH

- kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein)

Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 – (interakce zprostředkovaná chromodoménou)

----C*G------------- C*HG---------- C* ----------------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ----------------G C*----

-----CG ------------- CHG -----------C-------------GC* -------------GDC*-----------G--------

DRM2 a 1 (domain rearranged methyltransferase)

- příbuzné savčím Dnmt3, ale mají přeskupené domény- DRM1 – v časné fázi vývoje semen-„udržovací metylace“ asymetrických sekvencí CHH (CHG)

(euchromatin a okraje heterochromatinu)- regulace genové exprese, silencing - nutná spoluúčast katalyticky neaktivního paralogu DRM3 u

Arabidopsis

Cílové sekvence jsou určeny přítomností homologních siRNA= RNA-directed DNA Methylation (RdDM)

----C*G------------- C*HG---------- C* ----------------C*G ---- ---- G C------------ G HC-----------G ----------------G C*----

-----CG -------------CHG -----------C-------------GC* -------------GHC*-----------G--------

Udržovací metylace DNA(po replikaci)

Heterochromatin s histonem H1 (chromatin remodel. faktor DDM1)

- střední části dlouhých TE (kódující sekvence)- metylace řízena: H3K9me2 – CMT2, CMT3 (CHH, CHG)

hemimetylací – MET1 (CG)

Chromatin bez histonu H1 (chromatin remodel. faktor DRD1)

- okraje TE, krátké TE, geny- metylace řízena především siRNA (RdDM) – DRM2

(RdDM – iniciována na H3K9me2 a nemetyl. H3K4, viz dále u RNAi)

- metylace CG řízena hemimetylací – MET1

Zemach et al. 2013

Udržovací metylace transpozónů Střední části dlouhých TE – smyčka metylace DNA met. H3K9

Okraje TE, krátké TE – metylace řízena sRNA (RdDM)

- RdDM – možnost umlčení nových insercí (in trans)

- „smyčka“H3K9me2 – C*Hx spolehlivá, ekonomická

Význam?

Demetylace DNA

1) při replikaci s vyloučením aktivity udržovacích cytosin metyltransferáz (a histonových metyláz)

2) DNA glykosylázy(odštěpení metylcytosinu, reparací doplněn cytosin)

ROS1 REPRESSOR OF SILENCING – somatické buňky(k demetylaci nutný ROS3 – protein vázající RNA – sRNA ? mRNA)

DEMETER-LIKE (DML2, DML3) – somatické buňky DME1 DEMETER – parentální imprinting (endosperm)

Demetylace DNA ROS1 REPRESSOR OF SILENCING DEMETER-LIKE (DML2, DML3)

(částečně zastupitelné)

- aktivní ochrana reg. sekvencí genů (promotorů) před metylací

- vývojová aktivace genů (zrání rajčat)

- mutace v „demetylačních“ genech se projeví především nárustem metylace v 3’ a 5’ UTR

V metylačních (metyltransferázových) mutantech je demetylace utlumena (zpětná vazba).

ros1 dml2 dml3

WT

metylace

rel. nárůstmetylace

WT

Ovlivňování metylace DNA

- aplikace 5-azacytidinu – blokování aktivity MET1

- dihydroxypropyladenin (DHPA) – ovlivnění hladiny SAM

- inaktivace genů MET1, DDM1, CMT3, …(přirozené populace A. thaliana s mutantní CMT2 odolnější vůči teplotnímu stresu)

Projevy:

- různé: žádné až výrazné změny fenotypu (způsobené TE)- pohlavní reverze u knotovky (andromonoecie), fenotyp cycloidea u lnice, …

Reaktivace umlčených transgenů 5-azacytidinem

- inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC) hemiMet?

deMet

Nocarová, Fischer, nepubl.

+ AzaC+ AzaC

Demethylated

- obnovení často jen přechodné!

Stérické důsledky metylace DNA- buněčná interpretace metylace DNA

• změny na úrovni histonů- posttranslační modifikace histonů

- SRA domény: metylace (SUVH family),- Metyl CpG-binding d.: deacetylace (HDAC)

- zastoupení různých forem histonů (H2A.Z) • změna vazby dalších interagujících proteinů

- regulátorů (aktivátorů a represorů) transkripce - proteinů zodpovědných za strukturu/modifikace chromatinu

příklad: MBD proteiny(metyl-CpG-binding domain)

- rostlinné MBD proteiny nemají TRD (transcription repression domain)

- specifita vazby je dána i dalšími interagujícími proteiny- kolokalizace a interakce s DDM1

- AtMBD5 interaguje i s C*HH

- MBD proteiny zřejmě interagují s histon modifikujícími proteiny (HDAC= histon deacetylázy)

Model komprimace chromatinuvazbou dimerizujícího AtMBD7

proteinu

Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantů kyp a cmt3

Autokatalytická smyčka - metylace CHG (CMT3) a dimetylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE)

- transkripce indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1)

ROS1/ ROS3 ??? x

DRM2

„co je defaultní“ stav?

Metylace DNA a stav chromatinu- přehled

- prokázána korelace hypermetylace DNA a hypoacetylace histonů (pozdní replikace DNA)

- metylace DNA je dědičným signálem k deacetylaci histonů a kondenzaci chromatinu

- obdobné fenotypové změny při potlačení metylace (MET1) a deacetylace histonů (AtHD1)

- přítomnost histonu H2A.Z se vzájemně vylučuje s metylací DNA!!! (typicky v promotorech house-keeping genů), H2A.W je naopak společně s metylovanou DNA v heterochromatinu

Udržování epigenetického stavu – přehled

Heterochromatin- dimetylace H3K9 (KYP) je signálem pro metylaci CHG (i pro tvorbu siRNA)- metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9

MET 1 – udržovací metylace C*G

KYP (SUVH5,6) – H3K9me2 CMT3 - C*HG (CMT2 – C*HH)

DRM2, (DRM1) – udrž. metylace CHH komplement. siRNA

Euchromatin- trimetylace H3K4 a zřejmě i demetylace H3K9 (IBM1) v souvislosti s transkripcí Pol II

transkripce IBM1 – demetylace H3K9, H3K4me3 (x tvorbě siRNA)

ROS1/ROS3, DML2, DML3 – demetC transkripce?, sRNA?

Vzájemná provázanost metylace DNA a struktury chromatinu

metC = modifikace

dvoušrouboviceDNA

post-translační

modifikace a varianty histonů

vazba interagujících

proteinůTF, RNA pol.,

MBD, …

Analýzy metylace DNA

Přímé (strukturní): - spektrofotometrie, HPLC (celkový stav)

- %metC- anti metC protilátky (na chromozómu …)

- lokalizace metC bohatých úseků chromozómů- pomocí restriktáz citlivých k metylaci

- detekce metC v konkrétním restrikčním místě - hydrogensiřičitanovým sekvenováním

- přesné určení C a metC v určité sekvenci- i v celém genomu (v kombinaci s moderními technikami sekvenování)

Nepřímé (funkční) – vztah mezi metylací a genovou expresí- např. sledování reaktivace umlčených genů

Analýzy metylace DNApomocí restrikčních endonukleáz citlivých k metylaci - štěpení, Southernova hybridizace - PCR, elektroforéza (méně spolehlivé)(izolace krátkých na geny bohatých fragmentů u velkých genomů - kukuřice)

A -----------C CGG-----------------------------------CmetCGG--------------------------C CGG----------------------

B -----------C CGG-----------------------------------C CGG--------------------------C CGG----------------------

- štěpení restriktázou citlivou k metylaci cílové sekvence PCR primer

elektroforéza a Southern

PCR a elektroforéza

A B A B

Analýzy metylace DNA1. hydrogensiřitanová modifikace, 2. shotgun sequencing

nebo PCR + sekvenace

1. denaturace---------C*C*---------C--------CC---C*C*------C------------C--

2. modifikace Cyt na Ura(5metC zůstává nezměněn)---------C*C*---------U--------UU---C*C*------U------------U--

3. PCR, sekvenace (WGS)

původní sekvence---------CC---------C-------- CC---CC------C------------C-----------G---------G--------GG---G------G------------G--

modifikovaná sekvence---------CC---------U--------UU---CC------U------------U-----------G---------A--------AA---G------A------------A--

Preferenční metylace exonů– souvislost s preferenčním výskytem nukleozómů na exonech (spoludefinování přechodu intron – exon a exon – intron)- současně zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždění nukleozómem

Preferenční výskyt metC na vnější straně nukleozómů - souvisí s preferenčním výskytem C-G na vnější straně (stérické důvody)- lépe přístupný pro metyltransferázy

Cílová místa metylace DNA v chromatinové struktuře/sekvenci

Feature Value

DNA molecule Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 SUM

Length (bp)Top arm (bp)Bottom arm (bp)

Base composition (%GC) Overall Coding Non-coding

Number of genes Gene density (kb per gene ) Average gene Length (bp) Average peptide Length (bp)

Exons Number Total length (bp) Average per gene Average size (bp)

Number of genesWith ESTs (%) Number of ESTs

29,105,11114,449,21314,655,898

33.444.032.4

6,5434.0

2,078

446

35,4828,772,5595.4247

60.8

30,522

19,646,9453,607,09116,039,854

35.544.032.9

4,0364.9

1,949

421

19,6315,100,2884.9259

56.9

14,989

23,172,61713,590,2689,582,349

35.444.333.0

5,2204.5

1,925

424

26,5706,654,5075.1250

59.8

20,732

17,549,8673,052,10814,497,759

35.544.132.8

3,8254.6

2,138

448

20,0735,150,8835.2256

61.4

16,605

25,53,40911,132,19214,803,217

34.544.132.5

5,8744.4

1,974

429

31,2267,571,0135.3242

61.4

22,885

115,409,949

25,498

132,98233,249,250

105,773

Genom Arabidopsis - statistika

Nižší obsah CG v nekódujících sekvencích může odrážet mutace C* → T