F1.Fo-ATP synthasa

Skupiny ATPas

F1.Fo-ATPasy „H+ -translocating ATPases“

membrána Mtch, baktérií, tylakoidů

E1.E2-ATPasy „Na+/K+ - translocating ATPases“

eukaryotické plasmatické membrány

AoA1-ATPasy archebaktérie – hybridy V a F1.Fo-ATPas

V-ATPasy protonové pumpy interních membrán

(tonoplast, synaptické vesikly neuronů)

P-ATPasy ATP-depend. pumpy nabitých látek

Evoluční schéma ATPas

ATP synthasa: Přehled historie

1937 - Herman Kalckar (DEN) – souvislost ATP synthasy a respirace

1961 - Ephraim Racker (USA) - isolace části F1 ATP synthasy1961 - Peter Mitchell (UK) – chemiosmotická hypotéza1964 - Paul D. Boyer – syntéza ATP strukturálními změnami v ATPase

1973 - Boyer – „Binding Change Mechanism„ (energeticky náročným krokem je uvolnění ATP z enzymu1981 - John E. Walker – sekvence genu pro ATPsynthasu.1994 - Walker a spol. – struktura F1-podjednotky

1996-1997 – prokázány rotace během syntézy ATP * chemicky (Richard Cross, USA)* spektroskopicky (Wolfgang Junge, Germany)* mikroskopicky (Masasuke Yoshida, Japan).

Ohlédnutí za historií ATP synthasy …

SlaterMitche

ll

Boyer

Racker

ATPasa: Nobelova cena 1997

Paul Boyer – „binding change mechanism“

John Walker – krystalizace enzymu a struktura

Model alternující vazby ATP

ATPasa - mtch

ATPasy - mtch

ATP synthasa – E. coli

F1 podjednotka

(370kDa)

-řetězce , , , ,

Fo podjednotka

(160Da)

-řetězce a,b,c

Stechiometrie:a.b2.c9-12.3.3...

ATP synthasa

Model struktury ATPasy z E.coli

ATP synthasa - MTCH

Podobná struktura

x souvislost různých podjednotek

-řetězec mtch

-řetězec E.coli

ATPasy – c-řetězce v elektronovém mikroskopu

ATPasa z rostliných thylakoidů

ATPasa – enzymologie

DCCD (dicyklohexylkarbodiimid)

* vysoce specifická a účinná vazba na c-řetězec

* blokace H+ vodivosti Fo

* kovalentní vazba s konzervovaným Asp/Glu v transmembránovém helixu c-řetězce

* vazba 1 molekuly DCCD blokuje kompletní enzym = kooperace a funkční závislos c-podjednotek

ATP synthasa – důkaz rotace

ATP synthasa – důkaz rotace

-kovalentní vazba vlákna aktinu s připevněným fluoroforem

ATP synthasa – důkaz rotace

* -podjednotky přichyceny ke sklu His-tagem

* po přídavku ATP otáčení ve směru hodinových ručiček

ATP synthasa – vliv délky vlákna aktinu

- odpor kladený viskozním prostředím buňky je úměrný druhé mocnině délky vlákna

ATP synthasa – kroková rotace při nízké konc. ATP

ATP 20nM

při nízké konc. ATP probíha rotace po jednotlivých krocích

- vazba pouze 1 molekuly

- chybné kroky zpět = stochastický pohyb

ATP 200 nM

ATPasa – rotace s částicí zlata

Připojení částice Au (cca 4 x větší než ATPasa):

- rotace 8000 rpm

- kroky po 120 , rychlost v jednom kroku cca 120000!

recorded 8000 fps

playback 1/257 s

ATPasa – model rotace

Kontrola 2 stavy:

vazba ATP

- odstup Pi

ATPasa – model rotace

ATPasa – model Fo 33

Perspektivní pohled

ATPasa – model Fo 33

Pohled z boku

ATPasa – model Fo 33

Průřez podjednotko

u

ATPasa – model Fo 33

Pohled svrchu

ATPasa – model Fo 33

Pohled svrchu

ATPasa – detail aktivního místa

Vazebné místo pro ATP

na -řetězci

ATPasa – detail aktivního místa

Vazebné místo pro ATP

na -řetězci

(Molscript)

Titul

Boční pohled na

1 -podjednotku a 1 -podjednotku

ATPasa – uspořádání c-podjednotek

3D zobrazení prstence c-jednotek

ATPasa – animace pro model Fo

ATPasa – animace pro model Fo

ATPasa – netermodynamická regulace

„Inhibiční protein“ – blokování hydrolýzy ATP bez přít. p

* anoxie = pokles pH matrix = vyšší afinita k enzymu

„Záklapka“ – jednosměrnost pohybu -podjednotky u baktérií

* přechod mezi 2 velmi rozdílnými konformace jenom díky otáčení -podjednotky

Thioredoxin – zamezení hydrolýzy ATP v thylakoidech ve tmě

* tma = nečinnost PS1 = není redukovaný feredoxin pro redukci thioredoxinu – tvorba disulfidického můstky a inaktivní formy ATPasy

Příště:MTCH a nemoc