ININ VITROVITRO

Zpracovatel: Jiří HorákZpracovatel: Jiří Horák

IN VITROIN VITRO

In vitro se dá z In vitro se dá z latinylatiny přeložit jako přeložit jako ve ve skleskle. Pojem pěstování "in . Pojem pěstování "in vitro" se používá v vitro" se používá v medicíněmedicíně či či biologiibiologii a v příbuzných oborech a v příbuzných oborech pro pro organismyorganismy pěstované v pěstované v umělých podmínkách ve umělých podmínkách ve zkumavkáchzkumavkách či jiném či jiném laboratorním sklelaboratorním skle (např. (např. PetrihoPetriho miskách miskách), ne však na živé ), ne však na živé tkánitkáni..

Základní členěníZákladní členění

orgánové kultury

pletivové kultury

buněčné kultury

Orgánové kulturyOrgánové kultury

- - kultury geneticky stabilníkultury geneticky stabilní

- technologicky nejméně komplikované - technologicky nejméně komplikované

- nedochází k chromozomovým změnám- nedochází k chromozomovým změnám - nejčastěji používán apikální - nejčastěji používán apikální

meristémy,které mají vysoce stabilní meristémy,které mají vysoce stabilní struktury struktury

- jež zaručují diploidní charakter - jež zaručují diploidní charakter reprodukce a genetickou stabilitu .reprodukce a genetickou stabilitu .

- nejčastěji používány pro většinu našich - nejčastěji používány pro většinu našich hospodářsky významných listnatých druhůhospodářsky významných listnatých druhů

- (u druhů rodu - (u druhů rodu Quercus, Fagus, Populus, Betula, Quercus, Fagus, Populus, Betula, Tilia, Fraxinus, Ulmus, Acers, Tilia, Fraxinus, Ulmus, Acers, Alnus, Carpinus, Salix, Prunus, Alnus, Carpinus, Salix, Prunus, Robinia, JuglansRobinia, Juglans).).

- Koeficient množení je při použití této metody - Koeficient množení je při použití této metody velkývelký

- Nejsnadněji se množí a značných koeficientů - Nejsnadněji se množí a značných koeficientů množení lze dosáhnout při odebrání explantátů z množení lze dosáhnout při odebrání explantátů z juvenilních rostlin (semenáčků), nebo z juvenilních juvenilních rostlin (semenáčků), nebo z juvenilních částí stromůčástí stromů

- Rozmnožování konifer pomocí orgánových kultur je - Rozmnožování konifer pomocí orgánových kultur je obtížnější než u listnatých stromů zejména z důvodů obtížnější než u listnatých stromů zejména z důvodů jejich odchylné morfologické stavby (malého počtu jejich odchylné morfologické stavby (malého počtu axilárních pupenů). Rozmnožování juvenilních rostlin axilárních pupenů). Rozmnožování juvenilních rostlin konifer lze dosáhnout jednak stimulací růstu konifer lze dosáhnout jednak stimulací růstu axilárních pupenů, jednak indukcí adventivních axilárních pupenů, jednak indukcí adventivních pupenů na kotyledonech, mladých jehlicích a pupenů na kotyledonech, mladých jehlicích a izolovaných pupenech, které jsou pěstovány na izolovaných pupenech, které jsou pěstovány na živných médiích obsahujících cytokinin .živných médiích obsahujících cytokinin .

Pletivové kulturyPletivové kultury

- kalusové- kalusové

- embriogenní - embriogenní

Kalusové kulturyKalusové kultury

- nejstarší in vitro metoda u rostlin a les.dřevin- nejstarší in vitro metoda u rostlin a les.dřevin

- prvně takto vypěstovaná kultura mrkve ve Fr.- - prvně takto vypěstovaná kultura mrkve ve Fr.- 19301930

- dnes se s těmito kulturami pracuje omezeně- dnes se s těmito kulturami pracuje omezeně

- nevhodné, že zde probíhají nekontrolovatelné - nevhodné, že zde probíhají nekontrolovatelné mutacemutace

Embriogenní kultury = Embriogenní kultury = tzv.somatická embryogeneze tzv.somatická embryogeneze

vznik v 80.letechvznik v 80.letech

indukuje se tvorba somatických embryi indukuje se tvorba somatických embryi

- vzniká zvláštní kalus s vnitřní - vzniká zvláštní kalus s vnitřní diferenciací pletivdiferenciací pletiv

výborně propracováno zejména Nový výborně propracováno zejména Nový Zéland, USA, KanadaZéland, USA, Kanada

Nepřímá somatická Nepřímá somatická embriogenezeembriogeneze

Proces, při kterém vzniká embrio z Proces, při kterém vzniká embrio z jiné buňky než je oplozené vajíčko. jiné buňky než je oplozené vajíčko. Somatická embria často vznikají Somatická embria často vznikají spíše než z jedné izolované buňky spíše než z jedné izolované buňky na povrchu explantátuna povrchu explantátu

Etapy: 1.) z diferenciovaného Etapy: 1.) z diferenciovaného pletiva matečné rostliny pletiva matečné rostliny odebereme embriogenní kalusodebereme embriogenní kalus

2.) na médiu se indikují 2.) na médiu se indikují somatická embriasomatická embria

3.) přenos som. embrií na 3.) přenos som. embrií na další médium, kde vyklíčí a dál se další médium, kde vyklíčí a dál se vyvíjejívyvíjejí

Buněčné kulturyBuněčné kulturyBuněčné kultury-Buněčné kultury-jsou jsou

využívány zejména v genovém využívány zejména v genovém ing.ing.

provádí se v tekutých živných provádí se v tekutých živných médií oproti předešlýmmédií oproti předešlým

princip: v in vitro podmínkách, princip: v in vitro podmínkách, získáme nediferenc. získáme nediferenc.

pletiva,pomocí bioregulačních pletiva,pomocí bioregulačních látek se zpomaluje rozpad látek se zpomaluje rozpad

pletiv.pletiv.

Obecný princip: Obecný princip: mikropropagacemikropropagace

Jaký je sled činností?Jaký je sled činností?

1.) získání sterilní kultury1.) získání sterilní kultury

opláchnutí vodouopláchnutí vodou

povrchová desinfekce činidlypovrchová desinfekce činidly

opláchnutí desinfekce z povrchu vzorkůopláchnutí desinfekce z povrchu vzorků

ořezání poškozených pletivořezání poškozených pletiv

segmentace vzorkusegmentace vzorku

2.) zmnožení kultury 2.) zmnožení kultury Výběr vhodné metody a zmnožení Výběr vhodné metody a zmnožení

explantátu na explantátu na připraveném médiupřipraveném médiu

3.) zakořeňování3.) zakořeňování - IN VITRO často ne zcela - IN VITRO často ne zcela funkční kořenyfunkční kořeny

- IN VIVO- IN VIVO

4.) převod rostliny do podmínek IN 4.) převod rostliny do podmínek IN ViTRVOViTRVO

postupná aklimatizace klonů na vnější postupná aklimatizace klonů na vnější podmínky podmínky

hlavně faktor vzdušné vlhkosti a hlavně faktor vzdušné vlhkosti a přechod na přechod na autotrfní výživuautotrfní výživu

Podmínky:Podmínky: 1) 1) VýživaVýživa – – jsou to chem. Def .živná médiajsou to chem. Def .živná média

složení:složení: nosič,výživné látky nosič,výživné látky

Nosič:Nosič: přírodní(Agar),synthetickýpřírodní(Agar),synthetický

Výživné látky:Výživné látky: makro,mikrobiogenní prvky,Anorg makro,mikrobiogenní prvky,Anorg látky(N).Org l.(cukry kyseliny,bioregulační látky Auxiny, látky(N).Org l.(cukry kyseliny,bioregulační látky Auxiny, stimulátory- stimulátory-

Práškové stimulátory:Práškové stimulátory: Výhodou pudrů je jednoduchost jejich požití. Umožňují Výhodou pudrů je jednoduchost jejich požití. Umožňují rychlou aplikacirychlou aplikaci

Kapalné stimulátory:Kapalné stimulátory: Auxiny jsou dobře rozpustné v organických Auxiny jsou dobře rozpustné v organických rozpouštědlech (aceton, isopropanol, ethanol). rozpouštědlech (aceton, isopropanol, ethanol).

2) 2) Fyzikální podmínky Fyzikální podmínky --

Teplo Teplo - optimum 20-25,- optimum 20-25, -existují dvě výjimky –chladný režim-existují dvě výjimky –chladný režim

´=genetická ´=genetická banka(10-15),Termoterapie= krátkodobé banka(10-15),Termoterapie= krátkodobé vystavení na 40 stupňů při ozdravovánívystavení na 40 stupňů při ozdravování

Vlhko Vlhko - téměř 100%,uzavřené nádoby- téměř 100%,uzavřené nádoby

Světlo Světlo - v temnu se indukuje kalus, na světle - v temnu se indukuje kalus, na světle probíhají všechny ostatní fáze probíhají všechny ostatní fáze stand.osvětlení 16 hod. stand.osvětlení 16 hod.

Výhody explantátových kultur:Výhody explantátových kultur:

na malém prostoru se produkuje na malém prostoru se produkuje velký počet rostlinvelký počet rostlin

rychlé (možnost ovlivnit podmínky)rychlé (možnost ovlivnit podmínky) Produkce klonů jejichž množení Produkce klonů jejichž množení

tradičními metodami probíhá pomalu tradičními metodami probíhá pomalu nebo vůbecnebo vůbec

celoroční produkce rostlinceloroční produkce rostlin zkrácení šlechtitelského cykluzkrácení šlechtitelského cyklu

Nevýhody explantátových Nevýhody explantátových kultur:kultur:

relativně drahé vybavení laboratořírelativně drahé vybavení laboratoří pracnostpracnost drahý provoz laboratoředrahý provoz laboratoře náročná aklimatizace rostlin na polní náročná aklimatizace rostlin na polní

podmínkypodmínky

Mikropropagace - ve školkařstvíMikropropagace - ve školkařství

Mikropropagace je dnes ve školkařství Mikropropagace je dnes ve školkařství standardní metodou množení. Využívá standardní metodou množení. Využívá skutečnosti, že za jedno vegetační období skutečnosti, že za jedno vegetační období lze z mikrořízků velikosti 1-2 cm dopěstovat lze z mikrořízků velikosti 1-2 cm dopěstovat silnou rostlinu v kontejneru P9 se 2-3 silnou rostlinu v kontejneru P9 se 2-3 výhony schopnou přezimování v našich výhony schopnou přezimování v našich podmínkách. Výhodou mikrosadby je její podmínkách. Výhodou mikrosadby je její velmi nízká cena a malé prostorové nároky velmi nízká cena a malé prostorové nároky ze začátku vegetace (jaro), kdy mnoho ze začátku vegetace (jaro), kdy mnoho školkařských podniků bojuje s nedostatkem školkařských podniků bojuje s nedostatkem místa v temperovaných sklenících. Odpadá místa v temperovaných sklenících. Odpadá také nutnost neekonomického zimování také nutnost neekonomického zimování matečných rostlin, které je energeticky a matečných rostlin, které je energeticky a prostorově vysoce náročné. prostorově vysoce náročné.

SOUČASNÝ STAV V ČRSOUČASNÝ STAV V ČR V ČR existují výzkumné laboratoře, které se V ČR existují výzkumné laboratoře, které se

zabývají mnoha aspekty explantátových kultur zabývají mnoha aspekty explantátových kultur lesních dřevin in vitro. Jeden ze zakladatelů lesních dřevin in vitro. Jeden ze zakladatelů problematiky explantátových kultur lesních dřevin problematiky explantátových kultur lesních dřevin ve světovém měřítku a zakladatel této ve světovém měřítku a zakladatel této problematiky v bývalém Československu a problematiky v bývalém Československu a konkrétně laboratoře ve VÚLHM Jíloviště-Strnady konkrétně laboratoře ve VÚLHM Jíloviště-Strnady Prof. Ing. Vladimír Chalupa, DrScProf. Ing. Vladimír Chalupa, DrSc

Jediným pracovištěm v ČR, které se zabývá Jediným pracovištěm v ČR, které se zabývá pěstováním sadbového materiálu na bázi pěstováním sadbového materiálu na bázi explantátových kultur in vitro pro lesnickou praxi, explantátových kultur in vitro pro lesnickou praxi, je v současné době Laboratoř biotechnologií je v současné době Laboratoř biotechnologií Olešná Jihočeských lesů České Budějovice, a. s., Olešná Jihočeských lesů České Budějovice, a. s., vedená Ing. Evou Prenerovouvedená Ing. Evou Prenerovou

Příklad: iniciace prýtu na Příklad: iniciace prýtu na kaktusových kulturáchkaktusových kulturách

Na bazální části listu se tvoří kalusNa bazální části listu se tvoří kalus

Ten je odříznut a pasážován na čerstvé médium a roste a Ten je odříznut a pasážován na čerstvé médium a roste a roste. V průběhu čtyř měsíců dospěl do velikosti 50x30x20 roste. V průběhu čtyř měsíců dospěl do velikosti 50x30x20

mmmm

Po další pasáži je již na povrchu kalusu patrná Po další pasáži je již na povrchu kalusu patrná diferenciace buněkdiferenciace buněk

Rozřezání části kalusu a přenesení na čerstvé médium. Rozřezání části kalusu a přenesení na čerstvé médium. Tvorba prýtů je už pak velmi rychlá.Tvorba prýtů je už pak velmi rychlá.

Kdo mi pomáhal:Kdo mi pomáhal:

Kováč, J.: Explantátové kultury rostlin –nakladatelství Kováč, J.: Explantátové kultury rostlin –nakladatelství University Palackého v Olomouci 1995University Palackého v Olomouci 1995

Novák, Fr.: Explantátové kultury a jejich využití ve Novák, Fr.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin- Academia Praha 1990šlechtění rostlin- Academia Praha 1990

Chalupa, Vl.: Zachování genových zdrojů ušlechtilých Chalupa, Vl.: Zachování genových zdrojů ušlechtilých listnáčů a jejich rozmnožování metodami in vitro, ON-listnáčů a jejich rozmnožování metodami in vitro, ON-LINE: silvarium.czLINE: silvarium.cz

koneckonec