diagnostika in vitro Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 Imunoanalýza a onemocnění štítné žlázy Poruchy štítné žlázy v těhotenství Cena Arnolda Beckmana – Vyhlásenie víťazov pre rok 2012 Mutace v genu DNAJC5 kódující cysteine-string protein alfa jsou příčinou autozomálně dominantní adultní neuronální ceroidní lipofuscinózy Brefeldin A Human tumor cells killed by antracyclines induce a tumor-specific immune response Diferenciál leukocytů pomocí mnohobarevné průtokové cytometrie VELKÁ SOUTĚŽ O iPHONE 5
Transcript
diagnostikain vitro
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012
Imunoanalýza a onemocnění štítné žlázy
Poruchy štítné žlázy v těhotenství
Cena Arnolda Beckmana – Vyhlásenie víťazov pre rok 2012
Mutace v genu DNAJC5 kódující cysteine-string protein alfa jsou příčinou autozomálně dominantní adultní neuronální ceroidní lipofuscinózy
Brefeldin A
Human tumor cells killed by antracyclines induce a tumor-specific immune response
Diferenciál leukocytů pomocí mnohobarevné průtokové cytometrie
VELKÁ SOUTĚŽ O iPHONE 5
2
Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. je přednostou Ústavu lékařské che-mie a klinické biochemie 2. lékař-
ské fakulty Univerzity Karlovy a Fa-kultní nemocnice v Motole. V letošním roce oslavil jubileum, k němuž mu bla-hopřejeme. Při této příležitosti jsme mu položili několik otázek.
Pane profesore, jak jste se dostal ke klinické biochemii a proč jste se pro ni rozhodl?
Jako střední školu jsem studoval gymnázi-um. V té době byla na gymnáziích, která byla zaměřena na všeobecné vzdělání, zavedena povinná volba odborného zaměření. Vždy jsem měl rád chemii, proto jsem si vybral právě ji. A díky tomu jsem se jí mohl nadále intenzivně věnovat – měli jsme na škole 8 hodin chemie týdně. Po maturitě jsem váhal, zda ve studii chemie dále pokračovat, nebo zkusit medicínu. Ta mne totiž také velmi lákala. Nakonec jsem se rozhodl pro lékařství.
Na fakultě jsem se však s chemií stále set- kával. Začal jsem zde pracovat jako pomocná vědecká síla u svého kroužkového učitele pro-fesora Blahoše, endokrinologa, osteologa a in-ternisty. Mým prvním úkolem bylo ověřit vě-rohodnost stanovení kalciurie Sulkowitchovou metodou a připravit postup, jenž by mohli vy-užívat praktičtí (tehdy obvodní) lékaři ve svých ordinacích. K potvrzení zkoumané metody bylo zapotřebí navázat spolupráci s biochemic-kou laboratoří. V důsledku toho jsem se sez- námil s profesorem Masopustem. Od čtvrtého ročníku jsem pak pracoval pod vedením obou profesorů na řešení různých vědeckých úkolů,
O životě soukromém i profesním s Prof. Richardem Průšou
zejména z oblasti fosfokalciového metabolis-mu a metabolismu vitaminu D.
Biochemickému oddělení jsem díky profeso-ru Masopustovi zůstal věrný také po ukončení studií. Jako absolvent Fakulty dětského lékař-ství UK jsem nejprve atestoval z pediatrie. Pa-ralelně jsem však chodil sloužit denní i noční směny na OKB. Nakonec bylo nutné rozhod-nout se jen pro jeden obor, a tak jsem vděčně přijal nabídku profesora Masopusta zůstat na biochemii.
Ve zdravotnictví v posledních letech probíhají velké změny. Jak se Vás a Va-šeho oddělení dotýkají?
První změna, která stojí za zmínku a je dle mého názoru správná, je racionalizace ve zdravotnictví. Týká se také laboratorní medicí-ny a diagnostiky, a to nejen racionální indikace laboratorních vyšetření, ale rovněž konsolida-ce, automatizace a robotizace všech fází od pre-preanalytické až po post-postanalytickou.
Jako konkrétní příklad mohu uvést sloučení našeho oddělení Ústavu klinické biochemie a patobiochemie s Ústavem lékařské che-mie a biochemie pod jednotný Ústav lékařské chemie a klinické biochemie. Umožňuje to racionální využití kvalifikovaného personálu a technologií ve prospěch pacientů, studentů a výzkumu.
Také myšlenka universitních nemocnic patří do této oblasti. Pozitivum uvedených zdravot-nických zařízení vidím v lepší vzájemné spolu-práci s vysokými školami, což povede ke zkva-litnění poskytovaných služeb, k efektivnějšímu využití kapacit personálních i přístrojových a k celkovému zlepšení podmínek pro výuku,
vědu a výzkum. Institut universitních nemoc-nic by také mohl vyřešit vleklé mzdové diskre-pance mezi platy ve zdravotnictví a ve školství.
Další změnou, která probíhá zatím spíše ve světě než u nás a na kterou je dobré upozornit, je harmonizace. V našem oboru je tím myš-lena harmonizace laboratorních vyšetření tak, aby se zvýšila bezpečnost pro pacienty. Jedná se například o sladění referenčních mezí ta-kovým způsobem, aby byla možná návaznost výsledků. Jako lékař to považuji za nezbytné např. pro správný monitoring při léčbě zejmé-na pacientů s velkou mobilitou. Harmonizační proces má celkem pět oblastí, jež se v řadě zemí již řeší.
Dopad velkých změn ve zdravotnictví vidím také v tom, že firmy nestíhají vyvíjet metody, které jsou potřebné pro pacienty, a to vlivem zdlouhavých procesů při schvalování nových IVD metod. A my jsme pod velkým tlakem kli-nik, jež po nás chtějí zavádění nových vyšet-ření. Takto jsme již začali např. s metodou na stanovení cytostatika busulfanu, antimykotik voriconazolu, posaconazolu a další. V součas-né době dále zavádíme stanovení hladin in-fliximabu a stanovení protilátek proti tomuto léku. Ačkoliv akreditace a certifikace laboratoří přinesly velký pokrok, neměly by se stát brzdou vývoje a samoúčelnou byrokracií.
Další změnou ve zdravotnictví, jež je důsled-kem vývoje informačních technologií, je tele-medicína. Telemedicína má jasnou perspektivu a budoucnost, rozvíjí se však bohužel téměř zcela bez kontroly nezávisle na vás a na nás. Uvedu příklad. V USA posílají lékaři přes noc snímky svým kolegům – radiologům v Indii. Ti je vzhledem k časovému posunu mohou ve své pracovní době vyhodnotit, popsat a poslat zpět. Díky tomu má lékař v Americe vyhodno-cené snímky včas k dispozici. To považuji za velmi pozitivní využití telemedicíny.
Tento nový obor má však i svou negativní stránku. Celá řada firem, které mnohdy ani nemají nic společného se zdravotnictvím, vy-rábí zařízení např. pro kontinuální monitoring EKG, gravidity, hladiny glukózy apod. Pacient si za přístupné peníze přístroj zakoupí, používá ho a následně se dožaduje, aby tato data ně-kdo zpracovával a vyhodnocoval. Na to zatím nemá žádné zdravotnictví nikde na světě kapa-city a hlavně nikdo neví, zda jsou takto získané údaje validní. Na řešení uvedených problémů se v mezinárodním kontextu podílím. Výcho-disko hledáme pomocí definování multiaxiální hierarchie a vývoje vhodných algoritmů.
Pane profesore, jste pracovně velmi vytížený člověk, a to jak díky svým povinnostem na ústavu ve fakultní ne-mocnici, tak v důsledku pedagogické činnosti na fakultě. Podle Vašich slov usuzuji, že je pro Vás práce koníčkem. Najdete si ale někdy čas i na jiné zá-jmy?
Na odpočinkové zájmy mi zbývá opravdu
pokračování na str. 4
S kolegyněmi na pracovišti
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 3
Úvodník: rozhovor s prof. PrůšouJ. Černá, V. Vejvodová
Imunoanalýza a onemocnění štítné žlázyO. TopolčanDxI 800 - ověřené unikátní řešenífirmy Beckman Coulter pro každou laboratoř T. TietzePoruchy ŠŽ v těhotenství O. TopolčanStudie poruch funkce štítné žlázy v těhotenství v Západočeském krajiO. TopolčanNaše účast v pilotní studii VZP ČR: Screening onemocnění štítné žlázy u těhotných žen Ing. Dlabalová Stanovení hormonů štítné žlázy na imunochemických analyzátorech Access 2 a UniCel DxI T. TietzeKongenitální hypotyreózaRNDr. KnapkováOn board dilution – nová funkce analyzátorů řady DxI T. TietzeP4DE – konečně i pro Českou a Slovenskou republikuI. MičíkováCena Arnolda Beckmana – Vyhlásenie víťazov pre rok 2012J. SmolkaMutace v genu DNAJC5 kódující cysteine-string protein alfa jsou příčinou autozomálně dominantní adultní neuronální ceroidní lipofuscinózyL. NoskováBrefeldin AT. TakáčHuman tumor cells killed by antracyclines induce a tumor-specific immune responseJ. FučíkováDxH 800P. BoudalBiomek 3000 ACPrepP. KružíkDiferenciál leukocytů pomocí mnohobarevné průtokové cytometrie aneb kompletní screeningový panel s použitím 17 protilátek v 1 zkumavceR. VlčekUplatnění polychromatické průtokové cytometrie při monitorování minimální reziduální nemoci u pacientů s mnohočetným myelomemL. ŘíhováKongres ESHRER. KučeraZpráva z ESCCA konferenceL. ŘíhováUM FrymburkP. Boudal
FONS 2012V. Novák
vizitka: RNDR. TibenskáJ. Smolka
Křížovka
Kde se můžeme setkat
OBSAH2
12
1216
19
2022
18
2324
25
2628
293032
35
3638394041
Časopis vydává a distribuujeBeckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, 102 27 Praha 10,www.beckman.czČasopis připravujíIng. Kateřina KožanáIng. Eva KrálováIng. Hana KrátkáMgr. Pavel KružíkIng. Kateřina Sikorová, Ph.D.Ing. Petr SuchanMgr. Patrik ŠafRNDr. Jozef Smolka
Do časopisu přispěliProf. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. - FN PlzeňMUDr. Šárka Svobodová, Ph.D. – VFN v PrazePharmDr. Radek Kučera, Ph.D. – FN Plzeň, Beckman Coulter Česká Republika s.r.o.Mgr. Ing. Tereza TietzeMUDr. Dana Hauerová, Ph.D. - Endokrinologická ambulanceIng. Blanka Dlabalová – FN Hradec KrálovéRNDr. Mária Knapková - DFNsP Banská BystricaIng. Mgr. Ivana MičíkováRNDr. Jozef SmolkaMgr. Lenka Nosková - 1. LF UK a VFNIng. Tomáš Takáč, Ph.D. - UP v OlomouciMgr. Jitka Fučíková - 2. LF UK a FN MotolIng. Petr BoudalIng. Roman VlčekMgr. Lucie Říhová, Ph.D. - FN Brno, Babákova myelomová skupina Ing. Vratislav Novák, Ph.D.RNDr. Elena Tibenská, Ph.D. - Medirex a.s.Ing. Kateřina KožanáIvan Šarkan – autor křížovkyIng. Stanislav Čermák – autor tajenky
Grafik Jiří Adámek
Náklad čísla 2000 výtisků
5
4344
4
málo času, ale snažím se všem alespoň tro-chu věnovat. Patří mezi ně sjezdové lyžování, faleristika (pozn. red.: pomocná věda histo-rická zabývající se řády a vyznamenáními), numismatika (období vlády německého císaře Viléma II.) a literatura (např. G. Grass, L. Fuks). Za své koníčky považuji i operu – krásná pro-vedení jsem viděl např. v Salzburgu (Rusalka, Jolanta, Žena bez stínu, Mrtvé město) nebo v Hamburgu (velmi moderní Wir sind daheim od Moritze Eggerta).
Skončila doba dovolených. Měl jste možnost trochu se zrelaxovat před startem do nového „školního roku“?
Určitě. Letos se mi podařilo si skutečně dob-ře odpočinout, a to celý měsíc. Nejdříve jsem trochu váhal, zda je vůbec možné, abych odjel na tak dlouhou dobu. Cestu jsme však s přáteli plánovali a zařizovali rok dopředu, proto jsem to nemohl na poslední chvíli vzdát. Zajistil jsem vše potřebné, alespoň jsem v to doufal, a odletěli jsme do Států. Neodjíždělo se mi zrovna s lehkou hlavou, protože v tu dobu byl u nás v nemocnici hospitalizován na jednotce intenzivní péče pan profesor Masopust, můj učitel a dlouholetý kolega, kterého jsem si vel-mi vážil. Měl jsem obavy, abych se s ním po svém návratu ještě shledal. Bohužel se mi to opravdu nepodařilo.
Cestování patří mezi Vaše koníčky. Prozradíte nám alespoň něco málo o té poslední?
Cestuji velmi rád, to je pravda. Zajímá mne jak příroda, tak i život lidí v jiných zemích. Tentokrát jsme naplánovali výpravu do Spoje-ných států. Rozdělili jsme ji na 2 části. Nejprve jsme odletěli na poloostrov Kenai na Aljašce a poté jsme se přesunuli do státu Washington, kam jsme putovali nejen za přírodními krásami v Olympských horách a na Mount Rainier, ale navštívili jsme také město Seattle a jeho okolí.
Aljaška, to je místo, kam tak často lidé nejezdí. Jak na Vás tato země za-působila?
Bylo to tam skutečně nádherné – čistá pří-roda, kde jsou fantastické hory a ledovce, řeky, jezera, fjordy, permafrost. Podnikli jsme výlety lodí z městečka Seward skrz fjord, kde jsme měli možnost vidět lachtany, velryby i delfíny (dokonce druhy, které jsem do té doby ne-znal). V přístavu Valdez jsme sledovali šťastné a spokojené rybáře, jak po svém návratu z lovu vykládají úlovek – obrovské platýse (halibu-ty), lososy, mořské candáty (lingcod). Zdejší pozorování přírody vyladěné do téměř nesku-tečných barevných odstínů bylo fantastické – nádherné výhledy na oceán a vulkány, spousta ptactva a zvěře. Také menší přístavy Homer a Whittier byly úchvatné.
Podnikli jste rovněž cestu až k ně-kterému z ledovců?
Ano, vypravili jsme se k ledovci Matanuska podél stejnojmenné řeky, která z něho vytéká. Výhodou je, že se ledovcový splaz tohoto led-ního masivu táhne mnoho kilometrů hluboko do údolí a je zakončen ohromnou morénou. Můžete se tak snadno dostat až k němu a pro-jít se po jeho povrchu. Musím říct, že je to zá-žitek, i když poněkud nebezpečný – samý led se spoustou hlubokých trhlin.
Na závěr bychom se ještě jednou vrá-tili k Vašemu jubileu. Když se ohléd-nete zpět na svůj profesní život, musí-te být velmi spokojený. Máte v tomto ohledu ještě nějaké nesplněné přání?
Rád bych na tomto místě poděkoval všem svým spolupracovníkům, bývalým i součas-ným. Jsem jim vděčný za to, že se nám da-řilo a daří naplňovat odborné vize, a to jak ke spokojenosti kolegů na klinikách, tak na-šich pacientů. Největší odměnou je nám pak v Motole úsměv vyléčených nemocných dětí. Mým velkým přáním je, aby naše zdravotnic-tví bylo pružnější, aby tak bylo možné rychleji zavádět nové užitečné metody, které by vedly k rychlejšímu určení diagnózy a tím k brzkému vyléčení. Úkolem laboratoří je právě v tomto směru co nejvíce pomáhat.
PROF. MUDR. RICHARD PRŮŠA, CSC.ÚSTAV LÉKAŘSKÉ CHEMIE A KLINICKÉ BIOCHEMIE, 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA UK V PRAZE A FN V MOTOLEV ÚVALU 84, 150 06 PRAHA 5e-mail: [email protected]
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 5
Onemocnění štítné žlázy jsou po diabe-tu mellitu nejčas-
tějším endokrinologickým onemocněním. Vyšetření parametrů funkce štítné žlázy je nejfrekventovaněj-ším a také v rutinní praxi nejdéle prováděným imu-noanalytickým sledováním. Imunoanalytické metody jsou v tyreologii využívány především pro určení funkč-ního stavu štítné žlázy. Na-víc však umožňují usuzovat na etiologii onemocnění a monitorovat jeho průběh. Běžně se s jejich pomocí volí, optimalizuje a kontro-luje léčba. Jako jedno z mála imunoanalytických vyšet-ření nalezla tato stanovení využití rovněž ve screenin-gu a dokonce i v primární a sekundární prevenci.
Štítná žláza je svou velikostí jednou z největších endokrin-ních žláz. Nalézá se povrchově na přední straně krku, paratra-cheálně před hrtanem a jícnem. Skládá se ze dvou laloků propoje-ných istmem. Laloky jsou velké asi 6 x 3 x 1 cm. Objem štítné žlázy měřený sonograficky je u žen do 18 ml, u mužů pak do 22 ml.
Funkční jednotkou štítné žlázy je folikul, jehož výstelkou je jed-novrstevný epitel. Ten je vyplněn folikulární tekutinou. Základní funkcí štítné žlázy je aktivní vy-chytávání jódu z krevního obě-hu, jeho skladování, organifikace a syntéza hormonů štítné žlázy z mono- a dijodtyrozinů naváza-ných na tyreoglobulin. Jedná se o L-tyroxin (T4), který vzniká ze
dvou aminokyselin tyrozinů a ob-sahuje čtyři atomy jódu a trijodty-ronin (T3). Ve štítné žláze jsou oba hormony uloženy v koloidu foliku-lů ve formě proteinu tyreoglobuli-nu. Někteří autoři považují T4 za prohormon T3. Tomu nasvědčuje skutečnost, že pouze 20 % T3 je syntetizováno ve štítné žláze a transportováno krevním obě-hem. Většina T3 vzniká působením dejodázy 2 z T4 přímo v cílových tkáních. Proti tomuto výkladu svědčí fakt, že i T4 vykazuje vlast-ní biologickou aktivitu v metabo-lických procesech, jež je oproti T3 třetinová. Viz níže tabulka č. 1.
Z tabulky vyplývají další cha-rakteristické znaky obou hormo-nů. V krvi cirkulují oba hormony jednak ve formě vázané, ale také volné. Podíl volné frakce pro T3 je 0,1 % z celkového množství, podíl pro T4 je přibližně 0,01 %, což je z tabulky rovněž patrné.
Tyroxin binding globulin (TBG) – glykoprotein o molekulové hmotnosti 54 kD (obsah glycidů v molekule je 20 %). Má asi 20x větší afinitu pro T4 než pro T3. Za septického stavu dochází půso-bením proteáz k odštěpení části TBG o molekulové hmotnosti asi 5 kD. Takto změněný TBG má da-leko menší afinitu především k T3, ale i T4. Při léčbě estrogeny a fy-ziologicky v těhotenství dochází ke zvýšení syntézy TBG.
Trantyretin TTR, dříve označo-vaný jako tyroxin binding protein, je neglykovaný protein existují-cí v komplexu s retinolem. Jeho molekulová hmotnost je 55 kD
a biologický polo-čas 2 dny. Je hlavní transportní bílkovinou hormonů štítné žlázy v mozkomíšním moku a v mozku. Jeho polo-čas se výrazně zkracu-je a afinita pro T3 a T4 se snižuje při akutních i chronických onemoc-něních.
Albumin – afinita hormonů štítné žlázy k albuminu je výrazně nižší než k výše jmeno-vaným dvěma trans-portním bílkovinám, ale přesto má nezastupitelnou roli v jejich transportu.
T4 binding lipoprotein – tento transportní lipoprotein o mole-kulové hmotnosti 25 kD má pod-statně nižší afinitu než TBG. Jeho význam při přenosu není znám. Předpokládá se, že je důležitý pro transport do některých speci-fických tkání.
Hlavní význam hormonů štítné žlázy u dospělých tkví v regulaci metabolických reakcí. Jsou to hor-mony kalorigenní, mají zprostřed-kované katecholaminové aktivity, optimalizují proteosyntézu a in-termediární metabolizmus lipidů
Imunoanalýza a onemocněníštítné žlázy
Tabulka č. 1: Charakteristika T3 a T4 hormonů
Parametr T3 T4
Produkce ve štítné žláze (%) 20 100
Relativní metabolický efekt 1,0 0,3
Vázaná frakce (%) 99,9 99,99
Volná frakce (%) 0,1 0,01
Distribuční objem (l) 40 10
Buněčná frakce (%) 64 15
Biologický poločas (dny) 0,7 6,5
Tabulka č. 2: Vazebné proteiny tyreoidálních hormonů
Hormon TBG TTR (TBPA) Albumin T4 BL
Tyroxin 65 – 70 % 10 – 15 % 15 – 20 % 3 – 6 %
Trijodtyronin 75 – 80 % 10 % 10 % 3 %
i glycidů. Mají pozitivně chrono-tropní a inotropní vliv na oběho-vou soustavu. Zvyšují činnost CNS (zvýšená dráždivost, zrychlení re-flexní odpovědi), ovlivňují vývoj a diferenciaci CNS – nedostatek T4 během vývoje vede k poruchám růstu a diferenciace nervových buněk. Je rovněž narušena mye-linizace, což může vyústit v ire-verzibilní poškození somatického a současně mentálního vývoje.
Produkce hormonů je řízena hy-potalamo-hypofyzární osou půso-bením zpětnovazebných regulací cestou hypotalamického tripep-tidu thyreotrophin-releasing hor-monu (TRH) a adenohypofyzární-ho glykoproteinu tyreo
6
stimulačního hormonu (TSH). Do řízení produkce však významně zasahují také další vlivy: emoce, chronický stres, imunitní systém, stav výživy, jiné hormonální sys-témy (kortikoidy, estrogeny, so-matostatin či dopamin). Vzhledem k tomu, že má dopamin v hypofý-ze tlumivý efekt, bývá označován coby protiklad tyreoliberinu jako tyreostatikum.
Charakteristika protilátek a význam jejich stanovení
Autoimunitní onemocnění štít-né žlázy je způsobeno tvorbou protilátek proti jejím antigenním strukturám a proti thyreoidální peroxidáze anti-TPO (dříve ozna-čované jako antimikrosomální protilátky). Dalšími jsou protilátky proti thyreoglobulinu (anti-TG). Existují rovněž protilátky proti TSH receptorům. Těch je několik druhů, ale v zásadě je možné roz-členit je do dvou skupin – proti-látky TSH stimulující a protilátky TSH receptory inhibující. Běžnými imunoanalytickými metodami se stanovuje jejich celkové množství. Odlišit od sebe oba typy lze pouze biologickou titrací. Vyšetřování hladin autoprotilátek má dia-gnostický a prognostický význam. Jejich prezence u jednotlivých onemocnění shrnuje následující tabulka č. 4.
U zdravé populace se v ČR vys- kytují pozitivní protilátky proti štítné žláze přibližně v 7 %. V pří-tomnosti protilátek jsou značné geografické rozdíly. S věkem po-čet pozitivních nálezů narůstá, což nepochybně souvisí s tím, že stářím narůstá i frekvence výskytu autoimunních onemocnění.
Anti-TG často doprovázející an-ti-TPO mají menší diagnostický význam. Pozitivita anti-TPO pro-tilátek prakticky vždy předchází pozitivitu anti-TG protilátek. An-ti-TG protilátky reagují a tím neu-tralizují tyreoglobulin a způsobují falešně snížené, nebo dokonce nulové hodnoty tyreoglobulinu. Proto je ve všech doporučených postupech pro diagnostiku one-mocnění štítné žlázy, resp. pro diagnostiku a monitoraci léčby
Tabulka č. 3:Parametry používané v diagnostice onemocnění štítné žlázy
Parametr Zkratka Charakteristika
Tyreotropin TSH Aktivní hormon
Tyroxin celkový a volný TT4(T4), fT4Aktivní hormon
(prohormon)
Trijodtyronin TT3(T3), fT3 Hormon
Reverzní T3 rT3 Inaktivní hormon
Thyreoglobulin TG Prohormon
Calcitonin CT Hormon
Tyreobeiding globulin TBG Transportní bílkovina
Trantyretin(Tyroxinbeiding prealbumin)
TTR, TBPA Transportní bílkovina
T4 binding lipoprotein TBL Transportní bílkovina
Albumin Transportní bílkovina
Protilátky proti tyreoidálníperoxidáze
anti-TPO Protilátky
Protilátky proti tyreoglobulinu anti-TG Protilátky
nádorů, doporučováno vždy sou-časně vyšetřovat TG a anti-TG. An-ti-TG však mohou významně rušit stanovení tyreoglobulinu tím, že ho maskují a způsobují falešně negativní výsledek.
V poslední době řada prací ve světě, ale také z ČR (naše pra-coviště a III. interní klinika VFN – Límanová a kol.), prokázala, že se vysoká hladina anti-TPO pro-tilátek vyskytuje ve vysokém pro-centu u nemocných s nádory prsu a kolorekta, a doporučují asym-ptomatický výskyt anti-TPO proti-látek považovat za rizikový faktor nádorového procesu.
Onemocnění štítné žlázyOnemocnění štítné žlázy jsou
v ČR velmi častá. Udává se, že různými tyreopatiemi trpí až 4 – 6 % naší populace. Ženy jsou postiženy 4 – 8x častěji než muži (10 – 15 % žen ve věku nad 50 let a 30 – 40 % žen ve věku nad 70 let). Tyreoidální onemocnění mají heterogenní příčiny. Z vněj-ších vlivů jsou to nedostatek jódu v potravě a strumigeny (látky na-rušující vstřebávání a organifikaci jódu), infekce, záření či trauma. Z vlivů vnitřních se jedná o ge-netickou predispozici, vrozené poruchy receptorů a enzymů nebo agenezi štítné žlázy.
Tyreopatie lze rozdělit podle poruchy hormonální produkce, podle morfologických změn ve štítné žláze nebo podle etiologie onemocnění. Většinou je však jak diagnostický, tak léčebný pohled komplexní.
Diagnostika onemocnění štítné žlázy se až do objevení imunoa-nalýzy opírala především o sub-jektivní a objektivní příznaky manifestního onemocnění – např. myxedém u hypotyreózy, oční příznaky u hypertyreózy apod. Z laboratorních parametrů se vy-užívalo zejména stanovení chole-sterolu a vyšetření bazálního me-tabolizmu, které v současné době není v klinické praxi prováděno vůbec. Zavedení stanovení TSH, určení celkových hormonů a va-zebné kapacity hormonů štítné žlázy a z těchto hodnot vypočí-
Tabulka č. 4: Výskyt protilátek u jednotlivých onemocnění
OnemocněníVýskyt pozitivních protilátek v procentech
Anti-TPO Anti-TG TRAK
Obecná populace 5 – 20 5 – 25 0
Hashimotova tyreoditida 90 – 100 70 – 80 15
GB thyreoiditida 70 – 80 50 – 60 90
Toxická uzlovitá struma - - 15
Nádory štítné žlázy 10 – 40 30 – 60 5
Těhotenství 8 – 14 8 – 14 1
Autoimunní onemocnění 40 40 10
Diabetes mellitus 1. typu 40 40 0
Nadledvinková insuficience 60 30 0
Perniciózní anemie 40 30 0
Revmatoidní artritida 60 40 0
Ca prsu 50 5 0
Ca kolorekta 40 0 0
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 7
távané indexy volné T4 významně zlepšilo diagnostiku. Optimální diagnostiku pak umožnilo zave-dení ultracitlivého stanovení TSH (tzv. 3. generace), zahájení testo-vání volných hormonů a stanovení protilátek. Přehled testovaných parametrů funkce štítné žlázy viz tabulka č. 5.
Pro rozlišení funkčního stavu štítné žlázy na eufunkci, kdy poru-cha funkce není přítomna, hypo-funkci, kdy je činnost štítné žlázy snížená, nebo hyperfunkci, kdy je činnost zvýšená, nám postačující informaci poskytne vyšetření TSH doplněné o vyšetření T4 (v nezbyt-ně nutném případě odlišení vzác-ných centrálních – hypofyzárních poruch funkce).
Prostá strumaProstá struma je difúzní, nebo
uzlovité zvětšení štítné žlázy bez vrozených enzymatických či re-ceptorových defektů, deficitu jódu, zánětu, nádoru nebo funkč-ní poruchy. Diagnostika se opírá o normální hodnoty TSH a tyreo-idálních hormonů, negativní titry anti-TPO a anti-TG a o sonogra-fický průkaz zvětšení štítné žlázy. Léčí se adjuvantním podáváním hormonů štítné žlázy. V přípa-dě velké strumy retrosternální a s mechanickým syndromem je někdy nezbytné řešení chirurgic-ké. Je rovněž možné pokusit se o zmenšovací léčbu radiojódem.
HypotyreózaJedná se o onemocnění s ne-
dostatečnou produkcí hormonů štítné žlázy, kdy následným nedos- tatkem v tkáních dochází k tyreo-idální hypofunkci. Podle lokalizace poruchy hovoříme o hypotyreóze terciální (hypotalamické), sekun-dární (hypofyzární) nebo primární.
Centrální hypotyreózy jsou vzácná onemocnění způsobená chorobami hypotalamu či hypo-fýzy. U hypotalamického syndro-mu se nejvíce uplatňuje převaha dopaminergního vlivu, nebo zá-nětlivé onemocnění hypotalamu. Etiologie hypofyzárního poškození bývá mnohočetná. Je to poporodní poškození (Sheehanův syndrom),
panhypopituitarismus přítomný ve stáří (Simondsova kachexie), nádory hypofýzy bez hormonální sekrece a utlačující funkční tkáň, nebo benigní či maligní nádory vně hypofýzy působící útlak (např. kranyofaryngeom). V současné době jsou asi nejčastějším auto-imunním onemocněním hypofýzy hypofyzitidy.
Imunologické vyšetření TSH a tyroxinu po zátěžovém testu thyreoliberinem TRH umožní roz-lišit lokalizaci poruchy. Po TRH dojde ke vzestupu TSH a T4, po-kud se jedná o hypothalamickou formu. U hypofyzární formy se hodnoty před a po podání tyreo-liberinu neliší. Vhodné je doplnění vyšetřením všech hypofyzárních hormonů, především pro stanove-ní etiologie onemocnění, případně pro volbu léčby. Ve srovnání s pe-riferní hypotyreózou jde o oligo-symptomatické onemocnění (není přítomen myxedém) a zpravidla se sdružuje s příznaky nedostatku dalších hormonů řízených hypota-lamo-hypofyzární osou (pohlavní žlázy, nadledviny). Hypotalamický syndrom bývá zpravidla způso-
ben zánětem, hypofýza bývá po-škozena spíše adenomem, u dětí pak kraniofaryngeomem. Léčí se základní onemocnění a provádí se hormonální substituce.
Primární hypotyreóza (pe-riferní) se vyskytuje nejčastěji. U nás vzniká hlavně na podkladě chronického autoimunitního zá-nětu (Hashimotova thyreoiditis).
Tabulka č. 5: Chorobné stavy, u kterých je vhodné provádět vyšetření parametrů štítné žlázy
Onemocnění Hlavní Doplňkové Neprovádět
Centrální hypofunkce TSH, fT4 TRH test fT3, protilátky
Medulární karcinom CT, CEA TSH, fT3, fT4, protilátky
Tabulka č. 6: Hodnoty tyrodiálních funkcí u některých onemocnění
Onemocnění TSH fT4 fT3 Výskyt
Centrální hypofunkce ¯ ¯ N (¯) vzácně
Centrální hyperfunkce - vzácně
Struma eufunkční N N N častý
Hypotyreóza ¯ N (¯)- častý
Hashimotova struma ¯ N (¯). častý
Subklinická hypotyreóza N N nízký
Hypertyreóza ¯ (N) častý
Thyreotida GB typu ¯¯ (N) častý
Toxická nodulární struma ¯¯ častý
Subklinická hypertyreóza ¯ N N nízký
Exogenní hormony štítné žlázy v nadbytku
¯¯ N ( ) N častý
Hypotyreóza z netyreoidálních příčin
N (¯) N (¯) častý
Přítomnost HAMA protilátek ¯ N N vzácně
8
Zároveň může být důsledkem zevních vlivů, ozáření oblasti krku a horní poloviny hrudníku, po lé-čebné aplikaci radiojódu131, pů-sobením potravních strumigenů, lithia, léčiv na bázi sulfonamidů (chemoterapeutika, PAD, diure-tika), vzácně vrozenou poruchou (ageneze, dysplazie). Projevuje se únavou, bradypsychickou zapo-mnětlivostí, zimomřivostí, otoky (tuhý myxedém) a přibíráním na váze i při snížené konzumaci po-travin a ztrátě chuti k jídlu. Do obrazu onemocnění patří zácpa, suchá a akrálně chladná kůže, chrapot.
Diagnózu potvrzuje zvýšená hla-dina TSH a snížená hladina T4. Hladina T3 je většinou normální nebo snížená (vyšetření však nemá pro diagnózu význam, proto není účelné jej provádět). Stanovení protilátek anti-TPO potvrdí imu-notoxickou etiologii (Hashimo-tova nebo Riedlova struma). Pro posouzení závažnosti onemoc-nění však nemá význam. Důležité je pouze, zda jsou nebo nejsou přítomny. Výskyt protilátek je vý-znamný především pro frekvenci kontrol nemocných se subakutní hypotyreózou a také pro zahájení léčby u těchto osob. Sonografické vyšetření umožní posoudit veli-kost štítné žlázy, její vztah k okolí, pokud je hypofunkce provázena zvětšením štítné žlázy (strumou), a charakter zvětšení (difuzní nebo uzlovité).
Léčba spočívá v substituci synte-tickými hormony. V řadě preparátů jde o kombinace T4 a T3 v určitém poměru. Hlavní zásadou pro mo-nitoraci léčby je, že při zahájení léčebného procesu, nebo při jeho změně by kontrolní vyšetření ne-mělo být provedeno dříve než za 6 týdnů. Pokud nejsou přítomny komplikace, postačí při nastavené terapii kontrolní vyšetření 1x za 6 měsíců a kontrola hladin anti--TPO 1x za rok, eventuálně jednou za dva roky.
Syndrom nízkého T3Jedná se o stav charakterizovaný
opakovaně nízkým fT3 při fyzio-logických hodnotách fT4 i ssTSH. Je to důsledek ochranné reakce organizmu, při které dochází ke
konverzi T4 periferní dejodázou (typu III) na hormonálně neúčinný reverzní trijodtyronin (rT3). Příči-nou bývá vedle vysokého věku hla-dovění a těžká onemocnění (cir-hóza jater, chronická renální nebo kardiální insuficience, infarkt myokardu, malignity). Organizmus se tak brání vyčerpání energetic-kých rezerv. Léčba tohoto stavu je kontraindikovaná! Spontánní vze-stup fT3 může mít pozitivní prog- nostický význam.
HypertyreózaPodobně jako hypofunkce mů-
žeme tyreotoxikózy dělit na pri-mární a centrální (sekundární + terciální). Paraneoplastické kvartérní tyreotoxikózy jsou vzác-né. Nejzávažnější formou hyper-funkce je tyreotoxická krize, která přes intenzivní resuscitační péči končí v polovině případů smrtí.
Centrální hypertyreózyjsou, podobně jako je tomu v pří-padě hypofunkcí, rovněž zřídka se vyskytující onemocnění. Ade-nom hypofýzy, jenž může vy-volat sekundární tyreotoxikózu s nadprodukcí TSH, patří mezi onemocnění raritní. Paraneoplas-tická hyperfunkce z ektopické nadprodukce TRH byla popsána u ojedinělého případu mozkového nádoru.
Primární hypertyreóza je v naší republice nejčastěji způ-sobena autoimunitní stimulací receptoru pro TSH (Gravesova--Basedowova nemoc). Vzácnější příčinou je tyreotoxikóza vyvolaná autonomním adenomem s nad-produkcí tyroxinu (toxadenomem). Ještě méně obvyklá je u nás difúz-ní autonomie. Ta je uváděna jako frekventovaná příčina tyreotoxi-kózy v některých zemích západní Evropy. Hyperfunkce může být výsledkem předávkování hormony štítné žlázy nevhodně zvolenou léčebnou dávkou, nebo úmyslně u osob s psychickými poruchami. U starších pacientů vzniká hy-pertyreóza v polynodózní strumě, zejména po jódové zátěži (RTG kontrast, Amiodaron). Tyreoto-xické příznaky mohou přechodně provázet také subakutní záněty
nebo generalizaci diferencova-ných karcinomů štítné žlázy (DTC). Klinické projevy jsou vyjádřeny v plném rozsahu jen u autoimu-nitní tyreotoxikózy. Hyperfunkce z jiných příčin postrádají přízna-ky derivačního syndromu (akro-pachie, orbitopatie a pretibiální myxedém). Pacienti jsou hyper-aktivní, mají poruchy spánku, jsou sociálně konfliktní a někdy depresivní. Hubnou i při zvýšeném příjmu potravy, mívají průjmy, jsou horkokrevní, kůže je akrálně tep-lá, jemná a vlhká, nad hrudníkem sálá. Vlasy jsou jemné a lámavé. Charakteristický je jemný třes ru-kou, lépe patrný pohmatem než zrakem. V laboratorním nálezu klesá koncentrace prakticky všech produktů intermediálního meta-bolizmu. Nejnápadnější je hypo-cholesterolemie. Pro diagnózu je typický vzestup fT3, fT4 a snížení ssTSH až k neměřitelně nízkým hodnotám. Tyreotoxikóza je nej-častější příčinou fibrilace nebo flutteru síní u mladých pacientů. RAŠ se zkracuje pod 270 ms. So-nograficky se zobrazuje difúzně zvětšená žláza s vysokými průtoky při měření Dopplerem. V závislosti na fázi onemocnění je parenchym skvrnitě hypoechogenní, nebo anechogenní. V první fázi léčby je třeba utlumit nadprodukci hormo-nů agresivní tyreostatickou terapií (Carbimazol, Propycil, Thyrozol), definitivní léčba je chirurgická (tyreoidektomie), eventuálně ap-likace tyreostatické dávky radio-jódu.
nitní tyreotoxikózu GB typu, ale může se rozvinout i u Hashimoto-vy tyreoiditidy, nebo vzácně bez známek postižení štítné žlázy. Projevuje se příznaky zánětu spo-jivek, hyperpigmentovaným „halo“ kolem očí, rozšířením očních štěr-bin (retrakce víček), polotuhými otoky víček a glabelly, později také protruzí bulbů s prolapsem spoji-vek. Pacienti mívají diplopii, jsou ohroženi vznikem rohovkového vředu a zhoršením až ztrátou zra-ku. Onemocnění je chronické, trvá roky, ale může mít rovněž velmi rychlý průběh.
Záněty štítné žlázyJako u jiných orgánů lze tyreo-
iditidy podle průběhu rozdělit na akutní, subakutní a chronické. Mezi nejčastější patří chronické záněty, které postihují hlavně ženy ve středním a vyšším věku.
Akutní tyreoiditida je velice vzácné bakteriální onemocnění. Vyskytuje se spíše v souvislosti s traumatem nebo chirurgickým výkonem na krku, vzácně ve spo-jitosti s jícnovou píštělí či bron-chiogenní cystou, výjimečně také jako metastatický absces (endo-karditida). Projevuje se velmi bo-lestivým jednostranným zduřením štítné žlázy s lokálním zarudnutím a vysokými teplotami. V laboratoři jsou patrné známky akutního zá-nětu s vysokou sedimentací a gra-nulocytózou, tyreoidální funkce je většinou normální a protilátky (anti-TPO) i (anti-TG) nejsou zvý-šeny. Nejlepšího léčebného efektu můžeme dosáhnout cílenou anti-biotickou léčbou.
Subakutní tyreoiditida de Quervainova
Jedná se o onemocnění viro-vé etiologie. Vyskytuje se u pre-disponovaných osob. Typickým projevem je asymetrická struma. Je spontánně a současně palpač- ně bolestivá. Bývá doprovázena subfebrilií až horečkami a záhy rovněž hyperfunkčními příznaky. V laboratorních testech najde-me obraz zánětu, tedy zvýšenou sedimentaci, a v krevním obrazu leukocytózu. Protilátky anti-TPO, anti-TG zpravidla zvýšeny nejsou. V akutní fázi se obvykle setkáváme se supresí TSH a vyššími hodnota-mi fT4. fT3 bývá zvýšeno poměrně ojediněle. Sonografické vyšetření prokazuje hypoechogennitu, pře-devším zvětšeného laloku. Při cy-tologickém vyšetření nacházíme velké mnohojaderné de Quervai-novy buňky.
Léčíme ji antipyretiky (Paraceta-mol), nesteroidními antirevmatiky, u dětí a starých osob antibiotiky a při protrahovaném průběhu, nebo rychlém rozvoji celkové sym-ptomatologie kortikoidy (Predni-son 40 – 60 mg). Ty mají většinou promptní efekt a lze je vysadit do 2 – 3 měsíců. Po odeznění hy-
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 9
perfunkční fáze nastupuje někdy přechodná fáze hypofunkční, kdy je nutné podat substituční léčbu a optimalizovat ji dle hladin TSH a T4. Přechod do trvalé hypotyreó-zy se vyskytuje velmi vzácně.
Chronická lymfocytární ty-reoiditida Hashimotova
Toto onemocnění patří mezi au-toimunitní choroby. Je nejčastější příčinou hypotyreózy u nás. Kli-nicky se projevuje strumou. Po-stihuje 6 – 10 % žen a 1 – 2 % mužů. S věkem její výskyt výrazně stoupá. Narozdíl od předchozích tyreoitid je průběh onemocnění pomalý, zpravidla bez lokálních bolestí, někdy s pocitem cizího tělesa v krku. Později se přidružují příznaky hypotyreózy.
Laboratorně nalézáme v 90 – 100% vzestup anti-TPO a v 70 % anti-TG. V počátečním období se setkáváme s přechodnými kli-nickými i laboratorními projevy hypertyreózy, které jsou později vystřídány vzestupem TSH a po-klesem fT4, tj. klasickými projevy manifestní hypotyreózy. Struma je zvětšená, tuhá, prostoupená lymfoplazmocytárním infiltrátem se zárodečnými folikuly a pozdě-ji změněná fibrózní přestavbou parenchymu, což se sonografic-ky projevuje jako anechogenní v hloubkovém průměru dominant-ně zvětšené ložiskově nehomo-genní laloky s nižšími průtoky při vyšetření Dopplerem. Diagnózu můžeme potvrdit biopsií tenkou jehlou (FNAB) a následně cytolo-gicky. Kombinace popsaného so-nografického obrazu a pozitivity autoprotilátek je však pro toto onemocnění téměř patognomická, a proto FNAB obvykle neindikuje-me rutinně. Má své místo při nále-zu uzlu v terénu tyreoiditidy, nebo, pokud dojde k růstu strumy, když pomýšlíme na možný vznik lym-fomu (viz kapitola „nádory štítné žlázy“).
Léčba spočívá v hormonální sub-stituční terapii. Jen při začátku onemocnění, nebo při exacerbaci bývá někdy třeba použít antipyre-tik nebo kortikoidů.
Chronická autoimunní ty-reotida
Jde o onemocnění, které se může sdružovat s dalšími autoimunit-ními chorobami. Je součástí au-toimunitních polyglandulárních syndromů: APS II, Schmidtův syn-drom (tyreoiditida + m. Addison) a APS III (tyreoiditida, DM I a per-niciózní anémie). Častěji se pojí s kolagenózami, střevními záněty, vitiligem, vaskulitidami a anémi-emi. Z dalších speciálních forem zánětu je možné zmínit dětskou lymfocytární tyreoiditidu, asym-ptomatickou poporodní tyreoidi-tidu, poiradiační zánět či fibrózní tyreoiditidu (Riedleho strumu). Konečným stádiem zánětu může být atrofie žlázy (atrofická ty-reoiditida). Všechny autoimunní tyroiditidy mají jako trvalý násle-dek hypotyreózu. Využití stanove-ní TSH, fT4 a protilátek je velice důležité pro monitoraci průběhu onemocnění, optimalizaci a kon-trolu terapie. Při stabilizovaném stavu stačí kontrola 1x za půl roku. Při akutní exacerbaci one-mocnění, komplikacích či koinci-denci se závažnými chronickými chorobami, především u starších osob, je pochopitelně nutné zvýšit frekvenci kontrol.
Nádory štítné žlázyNádory štítné žlázy zaujímají
0,5 – 1 % mezi všemi karcinomy s incidencí 36 – 60 případů na 1 mil obyvatel. Přes svoji vzác-nost patří ve věku 15 – 45 let mezi 5 nejčastějších nádorových onemocnění. Výhodou však je, že jejich mortalita je podstatně nižší než morbidita.
Jde o tumory, které vycházejí z folikulárního epitelu štítné žlá-zy. Jsou hormonálně dependentní. Vyskytují se ve všech věkových skupinách, 5x častěji u žen než u mužů. Při jejich vzniku se uplat-ňuje řada faktorů. S nádorem se můžeme setkat asi u 10 % nemoc-ných po předchozím zevním ozá-ření. Pozitivní rodinná anamnéza rovněž hraje roli v etiopatogenezi tyreoidálních malignit. Například nemocní s familiární adenoma-tózní polypózou střev mají 100x vyšší riziko rozvoje papilárního karcinomu štítné žlázy než ostat-
ní populace. Genetická složka s postižením na 10. chromozomu u familiární formy medulárního karcinomu má význam nejen pro pacienty, ale také pro pokrevné příbuzné, kteří tak musí být aktiv-ně vyhledáváni a vyšetřeni v rámci genetického screeningu. Rovněž benigní onemocnění štítné žlázy (Hashimotova autoimunní tyreoi-ditis, Graves Basedowova choroba, tyreotoxikóza, endemická struma, osoby po strumektomii pro ne-zhoubné onemocnění štítné žlá-zy, kde nebyla podávána supresní léčba) mají vyšší pravděpodobnost vzniku karcinomů.
Benigními nádory jsou folikulár-ní adenomy. Jedná se o enkapsu-lovaný nádor s folikulární buněč-nou diferenciací.
Papilární karcinom (70 – 80 %)Papilární karcinom je maligní
epitelový nádor s folikulární dife-renciací, papilárními a folikulární-mi strukturami, často s nálezem matnicových jader, která jsou chu-dá na chromatin. V cytologických nátěrech mluvíme o nálezu pta-čích ok. Podkladem je překrývání jader s tvorbou dělících štěrbin invaginací cytoplazmy.
Nejčastěji se vyskytuje ve 4. – 6. dekádě, obvykleji u žen. Výjimkou však nejsou ani děti a dospívající. Jde o tumor dobře akumulující radiojód. Agresivita papilárního karcinomu je poměrně nízká, šíří se typicky lymfatickou cestou. Pokud jím onemocní starší pacienti, je jeho prognóza horší.
Folikulární karcinom (10 – 15 %)
Představuje maligní epitelo-vý nádor s folikulární buněčnou diferenciací bez diagnostických struktur typických pro papilární karcinom. V oblastech deficitu jódu je jeho výskyt kolem 25 – 40 %. Postižené jsou nejčastěji ženy mezi 50. – 60. rokem ži-vota. Folikulární karcinom tvoří hematogenní metastázy, zejména v plicích a kostech. Frekventovaná je jeho angioinvaze. Metastázy dobře akumulují radiojód.
Anaplastický karcinomPatří k nejagresivnějším lidským
nádorům. S maximální četností tohoto onemocnění se setkáváme mezi 60 – 70 lety. Charakteristicky se vyskytuje u osob s dlouhodobou anamnézou strumy, která se náh-le progresivně zvětšila. Invazivně prorůstá tkáň štítné žlázy, pří-padně také její blízké okolí. Šíří se hematogenní i lymfatickou cestou a tvoří vzdálené metastázy. Tumor špatně akumuluje radiojód. Léčeb-ným opatřením je urgentní zevní aktinoterapie. Chirurgická léčba již často není možná.
Medulární karcinom (5 – 7 %)Vychází z parafolikulárních (C)
buněk. Nádor tvoří vřetenovité či polygonální buňky s nepravi-delnou trámčinou. Cytoplasma je světlá, s granuly pozitivními na kalcitonin (používá se jako nádo-rový marker). Ve stromatu bývá často přítomen amyloid. Medulár-ní karcinom se vyskytuje familiár-ně ve 20 – 25 % s autozomálně dominantním typem dědičnosti. V kombinaci s feochromocyto-mem a hyperparatyreózou jde o MEN 2A. O MEN 2B se jedná při kombinaci se slizničními neuri-nomy, feochromocytomem a Mar-fanovým syndromem. Tento druh tumorů má agresivnější formu. Setkáváme se s ním převážně ve věku 20 – 30 let.
Neepitelové maligní nádory štítné žlázy
Představují vzácné sarkomy a lymfomy štítné žlázy. Jsou to rychle rostoucí karcinomy po-stihující především ženy vyššího věku. Lymfomy téměř vždy vznika-jí u pacientů, kteří mají anamnézu autoimunní tyreoiditidy. Heman-gioendoteliomy jsou vzácné, avšak vysoce zhoubné tumory charak-teristické extenzivními nekrózami nebo hemoragiemi.
Diagnóza nádorů štítné žlázy vychází z klinického obrazu, pal-pace, sonografického a cytologic-kého vyšetření. Z laboratorních vyšetření je nezbytné stanovit hladiny TSH, FT4, TG, protilátek proti tyreoglobulinu, kalcitonin a CEA, u medulárního karcinomu eventuálně další látky, jako jsou metanefriny či chromogranin A.
10
U medulárních karcinomů je vždy nutný aktivní screening pří-buzných, stanovení kalcitoninu bazální hodnoty a po stimulaci pentagastrinem genetické vyšet-ření (stanovení bodových mutací). Léčba tohoto druhu onemocnění je interdisciplinární. Tým tvoří en-dokrinolog, chirurg a lékař nukle-ární medicíny. Léčba diferencova-ného tumoru štítné žlázy zahrnuje provedení oboustranné totální tyreoidektomie (TTE) kombinované s následnou léčbou terapeutickou aktivitou radiojódem 131I. Po léč-bě radiojódem je nemocným nasa-zena supresní léčba tyreoidálními hormony (TSH < 0,1 mIU/l). Ne-zbytná je doživotní dispenzarizace nemocných s pravidelnými klinic-kými, sonografickými a laborator-ními kontrolami, kde se ověřuje přítomnost suprese TSH, hladin TG a protilátek proti TG.
Změny parametrů štítné žlázy u netyreodálních onemocněníCelá řada akutních chorobných
stavů, stresové situace, chronická závažná kardiovaskulární, nádo-rová, ale i pschyiatrická a neuro-logická onemocnění mohou vést k abnorálním hodnotám paramet-rů štítné žlázy. Nejvíce se to proje-ví na sérových hladinách TSH, kde je u hospitalizovaných pacientů obecně uznávané referenční roz-mezí 0,1 – 10 mU/l. Druhým para-metrem, který je výrazně změněn působením endo- a exogenních vlivů, je fT3. Může dosahovat prakticky libovolných hodnot, ty tudíž nemají v podstatě žádnou výpovědní hodnotu. Z prezento-vaných údajů vyplývá nesmyslnost populačního screeningu u hospi-talizovaných osob. Ten je, bohužel, v České republice hojně prováděn. Proč? U pacientů totiž nelze čas-to vyloučit ani ovlivnit přítomnou polymorbiditu a uplatňování se celé škály nepříznivých vnitřních i vnějších faktorů. Proto by se bě-hem hospitalizace měly parame-try štítné žlázy vyšetřovat jen při klinickém podezření na to, že oli-gosymtomatické či manifestní pří-znaky mají příčinu v organickém onemocnění štítné žlázy. Z výše řečeného se to týká především
hypotyreózy. Diagnóza stanove-ná během pobytu v nemocnici by měla být vždy ověřena vyšetřením, které by mělo být provedeno nej-dříve po uplynutí 6 týdnů od doby ukončení hospitalizace.
Vliv hormonů léků na para-metry funkce štítné žlázy
GlukokortikoidyGlukokortikoidy ve vysoké dávce
tlumí sekreci TRH a následně vy-měšování TSH. Tím navíc dochází ke snížení sekrece T4 a T3. Záro-veň však existuje i vzestup hladin rT3, který je vysvětlován stimulací 3 dejodázy kortikoidy. Současně nacházíme také sníženou produkci transportních bílkovin TBG a rov-něž TTR. Při chronické dlouhodobé kortikoidní léčbě bývají tyto změ-ny vyjádřeny málo.
Při nedostatku glukokortikoidů pozorujeme zvýšenou hladinu TSH. Ta má dvojí mechanizmus. Příčinou je na jedné straně zvýše-ná sekrece TRH. V tomto případě jsou pak hladiny T3 a T4 většinou normální, nebo pouze lehce zvýše-né. Jde ale o méně častou situaci. Obvyklejší je stav, kdy je současně s autoimunitním onemocněním nadledvinek přítomno rovněž au-toimunní onemocnění štítné žlázy. Pak nacházíme zvýšené TSH se sníženou T4 a většinou normální T3. Za těchto okolností by měla být při nadledvinkové insuficien-ci vždy vyšetřována i funkce štítné žlázy.
Pohlavní hormonyEstrogeny zesilují syntézu přede-
vším TBG, ale rovněž, avšak méně výrazně, syntézu TTR v játrech. Z toho vyplývá zvýšení celkového T4 a méně signifikantně i T3. Přes-to však je u 15 – 20 % postmeno-pauzálních žen pozorována zvýše-ná hladina TSH a snížená hladina T4.
Androgeny naopak syntézu TBG zeslabují a nemění hladinu tyreoi-dálních hormonů.
Růstový hormonPotlačuje aktivitu 3 dejodázy.
AmidaronAmidaron je jódový derivát ben-
zofuranu, antiarytmikum III. třídy. Každá molekula obsahuje 2 atomy jódu. 10 % celkového jódu z ami-daronu se uvolní do organismu (200mg tableta = 7,4 mg jódu).
Existuje několik forem klinických projevů toxického efektu amida-ronu na štítnou žlázu. Amiodaro-nem indukovaná hypotyreóza se laboratorně projevuje typickým poklesem fT4, vzestupem TSH a pozitivitou anti-TPO protilátek. Léčebně je třeba amiodaron vy-sadit a zahájit substituční terapii.
Amiodaronem indukovaná tyreotoxikóza I. typu je častá u osob s tyreopatií, kdy se vyso-kým příjmem jódu akcentuje syn-téza hormonů v autonomní tkáni. Klinicky i laboratorně se projevuje jako hypertyreóza. Léčba zahrnuje podání tyreostatik a vysazení ami-odaronu.
Amiodaronem indukovaná tyreotoxikóza II. typu je způ-sobena přímým cytotoxickým účinkem amiodaronu na foliku-lární buňky. V klinickém obrazu dominuje obraz klasické hyper-tyreózy. Je nutné brát zřetel na betablokující účinek amiodaronu – varovné jsou nové arytmie či zhoršení anginy pectoris, výrazné jsou známky zánětu. Léčba zahr-nuje vysazení amiodaronu, po-dávání tyreostatik, u AIT II. typu kortikosteroidů. Při nutnosti po-kračování léčby amiodaronem je nutná strumektomie. Výjimečně se rozvine porucha funkce štítné žlázy s hyper- nebo hypotyreózou.
Pro prevenci komplikací ami-daronem se vždy před zahájením léčby doporučuje vyšetřit TSH, fT4 a všechny protilátky anti-TPO, an-ti-TG i proti TSH receptorům. Při rodinné anamnéze onemocnění štítné žlázy či patologických tes-tech radíme léčbu amidaronem nezahajovat. Pokud se nevyskytne žádná z výše uvedených kontrain-dikací, lze léčbu zahájit (při pra-videlné kontrole všech výše uve-dených parametrů v intervalech 1x za 14 dní).
InterferonNejčastěji se používá k léčbě he-
patitidy C. Před zahájením terapie je vhodné zjistit sérové hladiny TSH a všech protilátek. Patologic-ké hodnoty jsou kontraindikací te-rapie. Poruchy funkce štítné žlázy mají obdobný charakter.
RadioterapieZměny funkce štítné žlázy po
radioterapii se vyskytovaly dříve u 70 % osob po zevním ozáření okolí štítné žlázy (hlava, krk, hor-ní polovina hrudníku). V současné době, kdy se provádí daleko cíle-nější radioterapie, se podle na-šich zkušeností frekvence poruch funkce štítné žlázy vyskytuje jen u 15 – 20 % nemocných.
CytostatikaIatrogenně navozená porucha
funkce štítné žlázy při léčbě cy-tostatiky se vyskytuje cca u 20 – 30 % pacientů. Riziko komplikací výrazně snižuje provedení podrob-ného vyšetření před zahájením léčby a úpravu eventuálního pa-tologického stavu. Při cytostatické terapii jsou nutné pravidelné kon-troly. Obdobně jako u amidaronu je možná jak hypo-, tak hyperty-reóza. Častější je však výskyt pře-chodné nebo trvalé hypotyreózy vyžadující substituční léčbu.
Screeningové programyNejrozšířenějším a plošně vyšet-
řením je screening kongenitální hypotyreózy (poruchy vývoje štít-né žlázy u novorozence nebo age-neze štítné žlázy a abnormality v tvorbě TBG). Tento screening je rozšířený pro svou jednoduchost, relativní ekonomickou nenároč-nost a pro eliminaci závažného poškození při zahájení včasné léčby.
Za dvě významné rizikové popu-lační skupiny, u nichž by mělo být vyšetření prováděno, jsou gravidní ženy a ženy po menopauze. V ČR i ve světě se však screening poruch funkce štítné žlázy v těhotenství provádí zatím pouze v omezeném množství. Jeho význam je všeo-becně znám. Byl ověřován řadou grantových projektů a dokonce byl jednoznačně prokázán multicent-rickou studií organizovanou Všeo-becnou zdravotní pojišťovnou. Pro
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 11
9. Okosieme O. E., Belludi G., Spittle K., Kadiyala R., Richards J. Adequacy of thyroid hormone replacement in a ge-neral population. QJM. 2011 May; 104(5):395-401.
10. Rastogi M. V., LaFranchi S. H. Conge-nital hypothyroidism. Orphanet J Rare Dis. 2010 Jun 10; 5:17. Review. PubMed PMID:20537182; PubMed Central PM-CID:PMC2903524.
11. Omwaru L. L., Arnold A. M., Joshi N., Fried L. P., Cappola A. R. High frequen-cy of and factors associated with thy-roid hormone over-replacement and under-replacement in men and women aged 65 and over. J Clin Endocrinol Metab. 2009 Apr; 94(4):1342-5. Epub 2009 Jan 6. PubMed PMID:19126628.
12. Brignardello E., Corrias A., Isolato G., Palestini N., Cordero di Montezemo-lo L., Fagioli F., Boccuzzi G. Ultrasound screening for thyroid carcinoma in chi-ldhood cancer survivors: a case series. J Clin Endocrinol Metab. 2008 Dec; 93(12):4840-3. Epub 2008 Sep 23.
13. Wolter P., Stefan C., Decallonne B., Du-mez H., Bex M., Carmeliet P., Schöffski P. The clinical implications of sunitinib--induced hypothyroidism: a prospective evaluation. Br J Cancer. 2008 Aug 5; 99(3):448-54.
14. Karmisholt J., Andersen S., Laurberg P. Interval between tests and thyroxine es-timation method influence outcome of monitoring of subclinical hypothyroidi-sm. J Clin Endocrinol Metab. 2008 May; 93(5):1634-40. Epub 2008 Feb 26.
15. Zimmermann M. B., de Benoist B., Co-rigliano S., Jooste P. L., Molinari L., Moosa K., Pretell E. A., Al-Dallal Z. S., Wei Y., Zu-Pei C., Torresani T. Assess-ment of iodine status using dried blo-od spot thyroglobulin: development of reference material and establishment of an international reference range in iodi-ne-sufficient children. J Clin Endocrinol Metab. 2006 Dec; 91(12):4881-7.
16. Emmett E. A., Zhang H., Shofer F. S., Freeman D., Rodway N. V., Desai C., Shaw L. M. Community exposure to perfluorooctanoate: relationships be-tween serum levels and certain health parameters. J Occup Environ Med. 2006 Aug; 48(8):771-9.
17. Reid J. R., Wheeler S. F. Hyperthyroidi-sm: diagnosis and treatment. Am Fam Physician. 2005 Aug 15; 72(4):623-30. Review.
18. Luton D., Le Gac I., Vuillard E., Casta-net M., Guibourdenche J., Noel M., Toubert M. E., Léger J., Boissinot C., Schlageter M. H., Garel C., Tébeka B., Oury J. F., Czernichow P., Polak M. Ma-nagement of Graves› disease during pregnancy: the key role of fetal thyroid gland monitoring. J Clin Endocrinol Me-tab. 2005 Nov; 90(11):6093-8.
19. Stagi S., Giani T., Simonini G., Falcini F. Thyroid function, autoimmune thy-roiditis and coeliac disease in juvenile idiopathic arthritis. Rheumatology (Ox-ford). 2005 Apr; 44(4):517-20.
20. Grammatopoulos D., Elliott Y., Smith S. C., Brown I., Grieve R. J., Hillhouse E. W., Levine M. A., Rin-gel M. D. Measurement of thyroglo-bulin mRNA in peripheral blood as an adjunctive test for monitoring thy-roid cancer. Mol Pathol. 2003 Jun; 56(3):162-6.
21. Harris B., Oretti R., Lazarus J., Parkes A., John R., Richards C., Newcombe R., Hall R. Randomised trial of thyroxine to prevent postnatal depression in thyroid--antibody-positive women. Br J Psychi-atry. 2002 Apr; 180:327-30. PubMed PMID:11925355.
22. Nikfar S., Koren G. Managing hypo-thyroidism during pregnancy. Can Fam Physician. 2001 Aug; 47:1555-6. Review.
PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.IMUNOANALYTICKÁ LABORATOŘ, ODDĚLENÍ NUKLEÁRNÍ MEDICÍNY, FN PLZEŇDR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ
nezájem gynekologů se ale prová-dí pouze regionálně, a jeho plošná realizace je tedy zcela v nedohled-nu.
Velice diskutovanou otázkou je frekvence onemocnění štítné žlázy v populaci. Nepochybným faktem je, že velké množství poruch funk-ce štítné žlázy, především u žen ve věku nad 50 let, zůstává nedia-gnostikováno, anebo jsou pacienti celou řadu let léčení podle klinic-ké symptomatologie pro zcela jiné onemocnění. Proto se provádění plošného screeningu u žen uvede-né věkové kategorie přímo nabízí. Tato otázka je sice často diskuto-vána na sjezdech i v časopisech, doposud ale není jednoznačně dořešena. V řadě států je doporu-čováno a prováděno omezené vy-šetření poruch funkce štítné žlázy v ohrožených skupinách. Dalšími doporučenými rizikovými kate-goriemi osob jsou ty s rodinnou anamnézou onemocnění štítné žlázy, se strumou, ženy s porucha-mi menstruačního cyklu a sterili-tou, lidé s poruchami lipidového a lipoproteinového metabolismu, hypertonici, nemocní s diabetem I. typu a všichni pacienti s auto-imunním onemocněním.
Dlouhodobé sledovaní pa-rametrů štítné žlázyJak již bylo řečeno, vyšetřování
parametrů štítné žlázy umožnuje monitorovat jak průběh onemoc-nění, tak i léčbu. Důležité však je, aby sledování bylo cílené a aby při něm nebylo prováděno zby-tečně velké množství parametrů. Obecně platí, že si při monitoraci většiny chorobných stavů vystačí-me s kontrolou TSH, za některých výjimečných okolností je nutné doplnit fT4 nebo stanovení proti-látek. V případě protilátek je po-třeba si uvědomit, že u stanovení anti-TPO je důležité znát, zda jsou či nejsou přítomny. Výše hladiny či dynamika změn nekoreluje se závažností, průběhem onemoc-nění, ani není parametrem efektu léčby. Naproti tomu jsou protilát-ky proti tyreoidálním receptorům měřítkem jak závažnosti onemoc-nění, tak dynamiky změn, a jejich normalizace jednoznačně souvisí s efektem léčby. Jediným velice
živě diskutovaným problémem je vazba mezi protilátkami a očními projevy GB strumititidy. I když, jak bylo zmíněno výše, nerozlišují mezi stimulačními a inhibičními.
ZávěrCílem tohoto přehledu vychá-
zejícího z vlastních dlouholetých zkušeností autorů s používáním imunoanalytických metod sta-novení a za použití nejnovějších citací z literatury jsme vás chtěli přesvědčit, že vyšetření parametrů štítné žlázy je velice důležité a má své perspektivy i do budoucnosti.
Podpořeno projektem Minister-stva zdravotnictví koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00669806 – KL FN Plzen a projek-tem OPVK CZ.1.07/2.3.00/20.0040.
Literatura:
1. Kose S., Gozaydin A., Akkoclu G., Ece G. Chronic hepatitis B with type I dia-betes mellitus and autoimmune thy-roiditis development during interfe-ron alpha therapy. J Infect Dev Ctries. 2012 Apr 13; 6(4):364-8.
2. LaFranchi S. H. Approach to the dia-gnosis and treatment of neonatal hy-pothyroidism. J Clin Endocrinol Metab. 2011 Oct; 96(10):2959-67. Review.
3. Spence M. M., Polzin J. K., Weisber-ger C. L., Martin J. P., Rho J. P., Willick G. H. Evaluation of a pharma-cist-managed amiodarone monito-ring program. J Manag Care Pharm. 2011 Sep; 17(7):513-22.
4. Knox S. S., Jackson T., Frisbee S. J., Ja-vins B., Ducatman A. M. Perfluorocarbon exposure, gender and thyroid function in the C8 Health Project. J Toxicol Sci. 2011 Aug; 36(4):403-10.
5. Chougule A., Kochar B. Thyroid dysfunc-tion following therapeutic external ra-diation to head and neck cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2011; 12(2):443-5.
6. Carlé A., Pedersen I. B., Knudsen N., Perrild H., Ovesen L., Rasmussen L. B., Laurberg P. Epidemiology of subtypes of hyperthyroidism in Denmark: a po-pulation-based study. Eur J Endocrinol. 2011 May; 164(5):801-9.
7. Li H., Zhang Z. S., Dong Z. N., Ma M. J., Yang W. Z., Han C., Du M. M., Liu Y. X., Yang H., Liu W., Duan L., Cao W. C. Increased thyroid function and eleva-ted thyroid autoantibodies in pediat-ric patients with moyamoya disease: a case-control study. Stroke. 2011 Apr; 42(4):1138-9. Epub 2011 Feb 24.
8. Karmisholt J., Andersen S,. Laurberg P. Variation in thyroid function in subc-linical hypothyroidism: importance of clinical follow-up and therapy. Eur J Endocrinol. 2011 Mar; 164(3):317-23
^
12
Chcete mít změřen základní panel thyroid-ní diagnostiky (TSH, FT4 a aTPO) současně a zachovat si přitom dostatečnou kapacitu
pro statimové testy? Tuto možnost nabízí pouze analyzátor DxI 800.
Unicel® DxI 800 je tzv. „random access“ analyzátor s maxi-málním výkonem 400 testů/hodinu pro jednokrokové metody, resp. 200 testů/hodinu pro metody dvoukrokové. Běžný pro-vozní výkon závisí na skladbě v laboratoři užívaných metod, nicméně standardně dosahuje 300 testů/hodinu. Tohoto vý-konu docílí přístroj pomocí 4 nezávislých současně pracují-cích reagenčních pipetorů.
Analyzátor navíc v prvním kroku zpracování vzorku (pri-mární zkumavky) vytváří vnitřní alikvot a primární zkumavku neprodleně uvolňuje ze systému k dalšímu zpracování v la-boratoři. Alikvot je skladován v chlazeném zásobníku po dobu potřebnou k provedení všech požadovaných testů, případně i testů reflexních.
DxI 800 – ověřené unikátní řešení společnosti Beckman Coulter pro každou laboratoř
Poruchy štítné žlázy v těhotenstvíprůběhu je zdravá štítná žláza a dostatečný přísun jódu. Při graviditě dochází k následují-cím změnám, které ovlivňují hladinu hormonů štítné žlázy v krvi matky:
1. Zvyšuje se bazální metabolizmus matky (v průměru o 15 – 20 %).
2. Funkce štítné žlázy je regulována kromě hypofýzy i placentou.
3. Dochází k transplacentálnímu přenosu hor-monů štítné žlázy.
4. Placenta může svým systémem dejodáz mě-nit poměr tyroxinu, trijodotyroninu a re-verzního trijodotyroninu.
5. Vlivem estrogenů stoupá syntéza TBG.6. Zvyšuje se glomerulární filtrace, mohou
stoupat ztráty jódu močí (jodurie).7. Dochází ke změnám imunitního systému.
Zvýšení bazálního metabolizmu s sebou lo-
Hormony štítné žlázy hrají výz- namnou roli při vzniku, udržení a v průběhu těhotenství. Jsou
důležité pro rozvíjení se plodu, průběh porodu a zdravý vývoj novorozence a dítěte. Je všeobecně známým fak-tem, že hypotyreóza je častou příčinou sterility. Méně se již ví, že u snížené plodnosti a především u neúspěšné in vitro fertilizace je přítomnost protilá-tek proti tyroidální peroxidáze nepříz-nivým faktorem. V literatuře se uvádí, že při pozitivitě těchto protilátek je in vitro fertilizace neúspěšná až v 70 %.
Těhotenství je fyziologický stav, jenž klade zvýšené nároky na organizmus matky po mno-ha stránkách. Předpokladem bezproblémového
gicky nese nutnost zvýšené potřeby hormonů štítné žlázy jak pro zajištění metabolických nároků matky, tak i samozřejmě plodu. Za nor-málních okolností existuje zpětná vazba štítná žláza-hypofýza-hypotalamus, v těhotenství však do této regulace vstupuje placenta (hCG (human-chorionic-fonadotropin) a HPL (hu-man placental lactogen)) a placentální sterod-ní hormony, které regulují tyreoidální funkci nezávisle na zmíněné hypotalamicko–hypofy-zární ose. U těhotných proto dochází k poru-šení logaritmické závislosti mezi TSH a tyroxi-nem, jež se vyskytuje u negravidních zdravých žen. Příčinou je především přítomnost pla-centárních hormonů. Ty působí simulačně na štítnou žlázu. Důsledkem tohoto zásahu jsou snížené hodnoty TSH v 1. trimestru a pře-chodně se vyskytující snížené hladiny tyroxi-
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 13
nu a trijodtyrinu. Placenta v důsledku zvýšené produkce estrogenů stimuluje zesílení jaterní syntézy celé řady bílkovin. Mimo jiné dochá-zí také k vybuzení sekrece hlavní transportní bílkoviny hormonů štítné žlázy – TBG (thyroid binding globulinu).
Hladina TBG je zvýšena dvoj- až trojnásob-ně oproti hodnotám u netěhotných žen. Za-číná stoupat mezi 6. – 10. týdnem gravidity, vrcholu dosahuje v její polovině a je zvýšená až do jejího konce. Je provázena vzestupem koncentrace celkového tyroxinu (TT4) a trijo-dotyroninu (TT3) a přechodně rovněž snížením koncentrace volného tyroxinu (fT4) a trijodo-tyroninu (fT3). Spolu s tímto poklesem probíhá zpětnovazebná stimulace osy hypofýza-štítná žláza. U zdravých těhotných žen s dostateč-ným příjmem jódu je úbytek volných hormonů hraniční (pokles o 10 – 15 %). Tento pokles je ale mnohem více vyjádřený u žen s nedosta-tečným příjmem jódu.
Gravidita ovlivňuje imunitní systém matky, protože lidský fétus exprimuje velké množství otcovských histokompatibilních antigenů. Pro-to je zvýšena prevalence spontánních potratů u těhotných s narušenou imunitní adaptací. Současně dochází k downregulaci cytotoxic-ké/cytolytické větve buněčné imunity několika mechanizmy. Adaptace imunitního systému probíhá jak na lokální (feto-maternální), tak na systémové úrovni vlivem progesteronu, es-trogenů a hCG. Adaptační mechanizmy vedou k přesměrování mateřské imunity od buňkami zprostředkované TH1 imunity k humorálně zprostředkované imunosupresi TH2. Autoimu-nitní postižení štítné žlázy může mít vliv na úspěšnost početí, průběh samotného těhoten-ství a na poporodní období. Na druhé straně však mnohdy dochází i k pozitivnímu ovlivnění autoimunitních onemocnění štítné žlázy.
Stagnaro-Green prokázal na souboru 552 gravidních žen, že přítomnost protilátek proti tyreoidální peroxidáze nebo proti ty-reoglobulinu v 1. trimestru těhotenství je ri-zikovým faktorem spontánních potratů (17 % oproti 8,4 % u kontrol). Tyto výsledky potvrdil Glinoer, který nalezl vyšší frekvenci spontán-ních potratů u 45 eutyreoidních žen s protilát-kami proti štítné žláze ve srovnání s 603 kont-rolami (13,3 % oproti 3,3 %). Poté ještě několik dalších studií (Iijima, Lejeune, Singh) podalo souhlasné poznatky o tom, že přítomnost pro-tilátek proti štítné žláze, zejména proti tyreo-idální peroxidáze, je spojena se spontánními potraty.
V prvních měsících po porodu stoupá u vět-šiny žen produkce autoprotilátek a dochází k exacerbaci autoimunitních onemocnění, včetně autoimunitních tyreoiditid (Davies).
Podle většiny studií hladiny IgG a autoproti-látek stoupají v 6. měsíci po porodu nad úro-veň před otěhotněním jako projev nespecifické imunitní stimulace.
Sekrece hormonů štítné žlázy u ploduV minulosti se předpokládalo, že placenta
je pro jodotyroniny zcela nepropustná. Nyní je ale známo, že v průběhu celého těhoten-ství přechází určité množství tyroxinu a trij-odotyroninu od matky k plodu. To vysvětluje fakt, že děti s agenezí štítné žlázy mají při narození měřitelné tyreoidální hormony v am-niové tekutině a v pupečníkové krvi. Rovněž jód placentou přechází a je v ní aktivně kon-centrován. Důležitým faktem je, že placenta propouští také imunoglobuliny. Tyreotropin placentou neprochází a nebyla ani prokázána žádná korelace mezi TSH u matky a u plodu.
Vývoj štítné žlázy plodu začíná až v závěru
1. trimestru. Fetální folikuly a syntéza tyroxi-nu se dají prokázat už v 10. – 12. týdnu tě-hotenství. Ve stejné době se vyvíjí i regulační osa hypotalamus–hypofýza. Sekrece fetální-ho tyroxinu se dá spolehlivě prokázat až od 18. – 20. týdne gravidity. Koncentrace fetál-ního TBG a tyroxinu postupně stoupá asi do 35. – 37. týdne těhotenství. Většina autorů však prokazuje, že fetální sekrece pokrývá asi dvě třetiny potřeby hormonů štítné žlázy. Jed-na třetina potřeby je i po 37. týdnu a až do porodu mateřského původu.
Hormony štítné žlázy jsou důležité ve fetál-ním vývoji, ale také u novorozence a dítěte. Jsou nezbytné především pro vývoj nervové
soustavy a s tím úzce související vývoj psycho-somatiky.
Z výše uvedené tabulky č. 1 jednoznačně vyplývá, že jsou hormony štítné žlázy mateř-ského původu obecně nezbytné pro růst a vý-voj plodu. Jsou pro něj dostupné od počátku embryonálního vývoje, ale rovněž po zahájení vlastní hormonální produkce štítnou žlázou plodu. Přenos mateřských hormonů, které se podílejí na udržení dostatečného zásobení fetálních tkání, přetrvává také v pozdějším období těhotenství. Jejich nedostatek v době časného fetálního vývoje vede k poškození mozku, neboť jsou hormony štítné žlázy důle-
žité především pro vývoj nervové soustavy, jak ukazuje níže tabulka č. 2. Onemocnění štítné žlázy představují značná rizika pro matku i pro plod a dokonce také pro vývoj novorozence a v dětském věku.
Rizika hypotyreózy pro matku: snížená schopnost otěhotnět zvýšené riziko spontánního potratu a předčasného porodu anémie preeklampsie abrupce placenty poporodní krvácení srdeční selhání tyreotoxická krize matky
Tabulka č. 1: Vývoj štítné žlázy plodu
Týdentěhotenství Vývoj štítné žlázy plodu Pokrytí potřeby hormony
štítné žlázy matky v %
6. T4 v coelomové tekutině (mateřského původu) 100
10. – 18. Lze identifikovat folikulární buňky 100
11. – 15. Přítomnost TGL a T4 (fetálního původu) 90
26. Fetální žláza je plně funkční 20 – 30
Při porodu Fetální žláza je plně funkční 20 – 30
TGL= tyreoglobulin, T4 = tyroxin
Tabulka č. 2: Vývoj mozku plodu
Proces Vliv T hormonů Kdy
Primární neurony ??? 3. – 4. týden
Vývoj proencefalu ??? 2. – 3. měsíc
Proliferace neuronů +++ 3. – 4. měsíc
Migrace neuronů +++ 3. – 5. měsíc
Funkční organizace neuronů +++ 5. měsíc – roky postnatálně
Rizika hypotyreózy matky pro plod: zvýšené riziko kongenitálních anomálií nízká porodní hmotnost zhoršená poporodní adaptace zvýšená perinatální mortalita
U hypotyreózy i hypertyreózy, kde je diag- nóza stanovena správně a včas a je ihned zahájena adekvátní léčba, je prognóza pro matku a zároveň plod výborná. Proto, jestliže nebude zaveden screening v těhotenství, je nutné při každém klinickém podezření bez- odkladně provést potřebná kompletní labora-torní vyšetření.
Primární hypotyreóza a hypotyreoxi-némie v graviditě
Nejčastější příčinou hypotyreózy u žen ve fertilním věku je chronická autoimunitní ty-reoiditida, pokud není následkem například předchozí léčby hypertyreózy chirurgicky, nebo radiojódem. V časném stádiu těhotenství má až 1 – 2,5 % zdánlivě zdravých žen zvýšenou hladinu TSH (Glinoer, Klein). Hypotyreóza je spojena se sníženou schopností otěhotnět. Hypotyreózní ženy mají zvýšené riziko spon-tánního potratu, předčasného porodu, anémie, preeklampsie, abrupce placenty, poporodního krvácení. Plod je ohrožen zvýšeným rizikem kongenitálních anomálií, zhoršenou poporodní adaptací a existuje zde i zvýšené riziko peri-natální mortality. Adekvátní substituční léčba tyroidálními hormony tyto abnormality téměř potlačuje.
Změny autoimunitní aktivity a tyreo-idální funkce u autoimunitní tyreoidi-tity
Rovněž zde dochází k poklesu autoimunit-ní aktivity, ale současně s tím také ke sníže-ní produkce tyreoidálních hormonů. Pokud u ženy s autoimunitní tyreoiditidou podáváme již před těhotenstvím substituční léčbu tyroxi-nem, je důležité tuto dávku zvyšovat výrazněji než při hypotyreóze jiného původu, kde se ob-vykle doporučuje zvýšení o 1/4 – 1/3 původní dávky. Za dostatečné zvýšení substituční dávky u autoimunitní tyreoiditidy se považuje navý-šení o 1/2 původní dávky. Konkrétní hodnoty substituční dávky jsou vysoce individuální, je proto potřeba sledovat hodnoty fT4 a TSH v kratších časových intervalech.
Gravidita obvykle vede k poklesu funkce při autoimunitní tyreoiditidě i tam, kde byla pů-vodně normální. Je tedy nutné saturaci sledo-vat a včas nasadit tyroxin. Kromě toho existují názory, že podávání malých dávek tyroxinu přispívá k poklesu protilátek proti tyreoidál-ní peroxidáze (TPO), což snižuje riziko vzniku poporodní tyreoiditidy. Popis významu změn protilátek v těhotenství naleznete v tabulce č. 6 v následujícím článku. Nezbytné je oka-
mžité zahájení substituce již u subklinické hy-potyreózy (vyšší TSH při normálních hodnotách fT4).
V roce 1991 Man a poté v roce 1999 Pop pro-kázali, že je nízká koncentrace hormonů štítné žlázy v časném stádiu těhotenství spojena se signifikantním poklesem IQ dětí testovaných v 7 letech, nebo v 10 měsících. Zájem o možné dlouhodobé psychoneurologické následky pro dítě způsobené nedostatečným přechodem mateřských hormonů štítné žlázy přes placen-tu v první polovině těhotenství obnovil článek Haddowa a spol. v NEJM z roku 1999. Haddow vyšetřil děti 62 žen, které měly v 15. – 17. týd-nu gravidity zvýšené TSH společně s hypoty-roxinémií 7 – 9 let před studií. Děti naroze-né hypotyreózním matkám měly IQ o 4 body nižší než děti zdravých matek (103 oproti 107 p < 0,06). IQ dětí matek s nediagnostiko-vanou, a tedy neléčenou hypotyreózou, bylo o 7 bodů nižší než IQ dětí matek pro hypo-tyreózu léčených. IQ dětí matek léčených le-votyroxinem pro hypotyreózu bylo podobné jako IQ dětí kontrolní skupiny (111 oproti 107). IQ 85 a nižší mělo 19 % dětí matek s hypo-tyroxinemií, zatímco z kontrolní skupiny mělo IQ nižší než 85 pouze 5 % dětí. V roce 2003 Pop et al. prokázali, že děti narozené ženám s hypotyreoxinémií, tedy s hladinou fT4 pod desátým percentilem ve 12. týdnu těhotenství (hypotyroxinémie je definována jako snížení hladiny fT4 nezávislé na vzestupu TSH nebo na přítomnosti protilátek proti tyreoidální peroxi-dáze), měly signifikantně snížený psychomoto-rický vývoj ve srovnání s dětmi, jejichž matky měly vyšší hladiny fT4. Děti hypotyroxinemic-kých matek, u nichž hladina fT4 stoupla ve 24. – 32. týdnu gravidity, měly vývojové skóre podobné jako děti kontrolních matek. U dětí kontrolní skupiny se s poklesem fT4 ve 24. – 32. týdnu těhotenství vývojové skóre nezmě-nilo. Z této studie vyplývá, že screening fT4 ve 12. týdnu gravidity může odhalit skupinu hypotyroxinemických žen, jejichž děti budou mít prospěch ze zvýšení hladiny mateřského fT4. Zatím zůstává nejasné, zda tyto ženy bu-dou mít větší prospěch z léčby jodidem, nebo ze substituční léčby levotyroxinem (Pop 2003).
TyreotoxikózaNejčastěji se v těhotenství vyskytuje tyreo-
toxikóza Graves-Basedowova typu (GB typu). Zbylé příčiny tyreotoxikózy jsou stejné jako v ostatní populaci, ale jsou v období gravidity extrémně vzácné. Její diagnózu stanovujeme především z anamnestických údajů a fyzikál-ního nálezu. Rozpoznání hypertyreózy u tě-hotných žen je ovšem těžší pro podobnost příznaků tyreotoxikózy a normálního těho-tenství (únava, palpitace, intolerance tepla). Užitečným příznakem je ztráta váhy nebo nedostatečné přibývání na váze přes dobrou
chuť k jídlu. Diagnostiku provádíme především z imunoanalytického vyšetření. Nacházíme supresi TSH, elevaci fT4 anebo i zvýšení fT3. V 1. trimestru v době vrcholné produkce hCG může být TSH přechodně suprimováno u 10 – 20 % eutyroidních žen.
V těhotenství se mohou nastat tři možné kli-nické situace:
1. ženy s tyreotoxikózou diagnostikovanou před otěhotněním, léčené tyreostatiky
2. ženy v remisi, nebo považované za vyléče-né po předchozí léčbě tyreotoxikózy
3. ženy, u kterých nemoc nebyla diagnosti-kována před otěhotněním, avšak mají zvýšené protilátky proti TSH receptoru
Pokud je tyreotoxikóza zjištěna až v době gravidity, nasazení tyreostatik vede obvyk-le k rychlému zklidnění procesu při poklesu protilátek stimulujících TSH receptory (TRAK). Přetrvávající vysoká hodnota TRAK signalizuje riziko novorozenecké tyreotoxikózy. V souvis-losti s léčbou tyreostatiky je nutno se zmínit o otázce jejich teratogenního vlivu. Ve skuteč-nosti nebyl při použití běžných dávek propyl-thiouracylu teratogenní vliv prokázán. Tyreo-statika imidazolového typu (např. Thyrozol) mohou vést k poruchám kštice. V důsledku toho se doporučuje v těhotenství (přinejmen-ším v 1. trimestru) podávat Propycil. Jinak se ovšem dlouhodobá léčba Propycilem považuje za riskantní vzhledem k jeho hepatotoxicitě.
Po porodu obvykle aktivita tyreotoxikozy stoupá, takže je nutné dávku tyreostatik zvýšit. Proto někteří autoři doporučují provést na pře-chodu 2. a 3. trimestru gravidity totální tyreo-idektomii. Zákrok neovlivňuje nepříznivě prů-běh gravidity, vyžaduje však pečlivé sledování hladiny volného tyroxinu a okamžité nasazení substituční léčby tak, aby hladina fT4 neklesla pod normální hodnoty.
U nemocných s anamnézou tyreotoxikózy GB typu je třeba pamatovat na to, že protilátky proti TSH receptoru mohou zůstat zvýšené také po předchozí tyreoidektomii, či ablaci štítné žlázy radiojódem, nebo po léčbě tyreo-statiky i několik let před otěhotněním. Proto musíme u těchto žen stanovit protilátky proti TSH receptoru hned v počátku gravidity. Na sympóziu ETA v roce 1997 bylo doporučeno, že je v případě pozitivity protilátek proti TSH receptoru na začátku těhotenství vhodné pro-vést druhé stanovení v 6. měsíci. Teprve pokud ve 2. trimestru protilátky podstatně neklesnou, je možné pomýšlet na možnost fetální hyper-tyreózy.
GB toxikózu je velice důležité diagnostikovat a léčit v období gravidity včas, protože pokud není léčebný proces zahájen, může to vést k závažným komplikacím, jak již bylo výše zmí-něno – k preeklampsii, potratu, předčasnému porodu, abrupci placenty, kongenitálním mal-formacím a k nízké porodní váze plodu. Možné
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 15
je rovněž srdeční selhání anebo tyreotoxická krize matky. Tam, kde je diagnóza stanovena správně a dostatečně brzy a léčba je zahájena ihned, je prognóza pro matku i plod výborná.
HypotyroxinemieHypotyroxinemie je definována jako snížená
hladina fT4 při normální hladině TSH. Nejčas-těji vzniká v důsledku nedostatečné saturace jódu v těhotenství. Obdobně jako hypotyreóza je rizikovým faktorem pro opoždění psycho-motorického vývoje dítěte. Vývoj dětí u matek s hypotyroxinemií, u nichž následně fT4 během těhotenství stoupne, se nezdá být opožděný v časném stádiu gravidity.
Hodnocení výsledků jodurie u dospělých
< 50 mg/l těžký jódový deficit
50 – 100 mg/l relativní nedostatek jódu
100 – 150 mg/l pravděpodobný dostatek jódu
150 – 200 mg/l spolehlivý dostatek jódu
150 – 230 mg/l cílové hodnoty pro těhotné ženy
200 – 350 mg/l “šedá zóna”
> 350 mg/l nadbytek jódu
Přechodná těhotenská tyreotoxikóza Přechodná těhotenská tyreotoxikóza je způ-
sobená přímou stimulací štítné žlázy vlivem hCG. Jedná se o dočasnou formu tyreotoxi-kózy, která vzniká v první polovině gravidity, nemá autoimunitní etiologii a není spojena se zhoršenou prognózou pro matku ani pro plod. Přechodnou těhotenskou toxikózu je tře-ba odlišit od tyreotoxikózy GB typu, protože je různý její průběh, následky pro plod, léčba a sledování. Tyreotoxikóza GB typu je auto-imunitního původu. V séru nacházíme proti-látky proti TSH receptoru (TRAK). Vyskytuje se přibližně v 1 případě na 1 000 – 2 000 těho-tenství. Je spojena se závažnými komplikace-mi, jako je nízká porodní váha plodu, nezralost a eklampsie. Riziko těchto komplikací se zdá být přímo úměrné závažnosti tyreotoxikózy.
V 1. trimestru v době vrcholné produkce hCG může být TSH přechodně suprimováno u 10 – 20 % eutyroidních žen.
Poporodní autoimunitní tyreoiditisPoporodní tyreoiditida je syndrom přechodné
nebo trvalé poruchy funkce štítné žlázy. Ten se objeví v prvním roce po porodu a je způsoben autoimunitou buněčného typu. Prevalence poporodní tyreoiditidy se liší od 1,1 – 21,1 %. Poporodní tyreoiditida je spojena s přítomností protilátek proti tyreoidální peroxidáze a urči-tými MHC geny (Muller).
Charakteristickým znakem je nepřítomnost laboratorních známek zánětu. Má typický dvoj-fázový průběh. První hyperfunkční fáze trvající
obvykle od 2 – 4 týdnů je v laboratorním ná-lezu charakterizována sníženou hladinou TSH, zvýšenou hladinou fT4, eventuálně také zvýše-nou hladinou fT3. V tomto stádiu není vhodné podávání tyreostatik. Pro druhou hypofunkční fázi je charakteristický vzestup hodnot TSH do patologické oblasti, pokles fT4 a fT3. V uvede-ném stádiu onemocnění je naopak substituce tyreoidálními hormony nezbytná. V dalším prů-běhu dochází buď k úplné normalizaci, nebo přechodu do trvalé hypotyreózy. Vzácně může nastat přechod do Graves-Basedovovy tyreoi-tidy. Podle Lazaruse se poporodní tyreoiditida nevyskytla u žen bez zvýšených protilátek proti štítné žláze v průběhu těhotenství. Ženy s po-zitivními protilátkami měly poporodní thyreoi-tidu v 50 %, z toho 19 % z nich prodělalo pou-ze hypertyreózní a 49 % jen hypotyreózní fázi a 31 % pak hypertyreózní fázi následovanou fází hypotyreózy. Poporodní tyroiditida přešla v trvalou hypotyreózu u 25 – 30 % případů.
Podpořeno projektem Ministerstva zdravot-nictví koncepčního rozvoje výzkumné organi-zace 00669806 – FN Plzeň a projektem OP VK CZ.1.07/2.3.00/20.0040.
Literatura:1. Abalovich M. et al. Clinical practice guideline man-
agement of thyroid dysfunction during pregnancy and postpartum and Endocinne Society clinical practice guideline. J. Clin Endocrinol Metab 2007, 91, S2:1-47.
2. Arufe María del Carmen, Francisco Escobar del Rey, Pere Berbel, Gabriella Morreale de Escobar. Early ma-ternal Hypothyroxinemia alters histogenesis and ce-rebral cortex cytoarchitecture of the progeny. J Clin Invest. 2003 April 1; 111 (7): 1073–1082.
3. Bílek R., Čeřovská J. Jod a tyreoidální hormony. Vnitřní
lékařství 2006, 52:881-890.
4. Haddow J. E., Palomaki G. E., Allan W. C., William J. R., Knight G. J., Gagnon J., O´Heir C. E., Mitchell M. L., Her-mos R. J., Waisbren S. E., Faix J. D., Klein R. Z. Maternal Thyroid deficiency during pregnancy and subsequent neuropsychological development of the child. N Engl J Med 1999, 341:549-55.
5. Lazarus J. H., Premawardhana L. D. Screening for thyroid disease in pregnancy. J Clin Pathol 2005, 58:449-450.
6. Límanová Z. Onemocnění štítné žlázy v graviditě. V Lí-manová Z. (ed) Štítná žláza, Galen, Praha 2006.
7. Pop V., Brouwers E. P., Vader H. L., Vulsma T., vanBa-ar A. L., Vijlder J. J. Maternal Hypothyroxenmeia during early pregnancy and subsequent child development: a 3-year follow-up study (2003). Clinical Endocrinolo-gy 59, 282-288.
8. Rovert J. F. Congenital hypothyroidism: long-term out-come. Thyroid 1999, 9:741-748.
9. Zamrazil V. Štítná žláza a těhotenství. Interní medicí-na 2010, 12:191-195.
PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.
IMUNOANALYTICKÁ LABORATOŘ, ODDĚLENÍ NUKLEÁRNÍ MEDICÍNY, FN PLZEŇ
Tabulka č. 1: Přehled použitých imunoanalytických metod
Parametr Normální hodnoty Jednotky Metoda Výrobce
TSH 0,3 – 2,5 (4,5) mIU/l IRMA Immunotech
fT4 9 – 21 pmol/l RIA Immunotech
anti-TPO 15 (60) U/l RIA Immunotech
16
V letech 2001–2005 jsme v úzké spolupráci s gynekology vyšet-řili soubor 650 gravidních žen ve věku od 19 do 49 let. Bylo použito sér rutinně odebíraných ke scree-ningu vrozených vývojových vad v 15. – 21. týdnu těhotenství. Nor-my aplikované pro tuto studii jsou v souladu s prací Lazarurise. Vý-sledky jsou sumarizovány v násle-dujících tabulkách a v závěrečném hodnocení studie.
Kromě této studie bylo na zakázku pro VZP vyšetřeno v letech 2006 – 2007 celkem 450 těhotných žen. V současné době prová-díme na základě požadavků gynekologů asi 200 vyšetření ročně.
Závěry ze studie:Prevalence poruch štítné žlázy v Západočes-
kém kraji v průběhu gravidity je následující:� Zvýšené TSH nalezeno v 1,5 % případů.� Normální TSH spolu se sníženou hladinou
fT4 zjištěno v 1,4 % případů.� Zvýšená hladina antiTPO se vyskytla celkem
v 9,4 % případů.� Jodurie nižší než 100 µg/l v 1. trimestru
těhotenství byla prokázána u 40,4 % žen. Z toho vyplývá, že nedostatečný příjem jódu stále představuje problém v populaci těhotných Západočeského kraje a je zapo-třebí pokračovat v ověřování stavu zásobe-ní jódem u skupiny gravidních, eventuálně i kojících žen.
� Poporodní tyreoiditida se vyvinula u 18 kli-entek, což představuje 58 % z celkového
počtu žen, jimž byly v průběhu těhotenství prokázány pozitivní protilátky proti tyroi-dání peroxidáze.
� Z toho u 10 žen (55,6 %) se jednalo o hy-potyreózu bez úvodní hypertyreoidní fáze, která se ve většině případů (v 8 z 10) změ-nila v hypotyreózu trvalou.
� U zbylých 8 žen (44,4 %) se naopak jedna-lo o hypertyreózu. Ta byla ve 3 případech přechodná (zcela se normalizovala bez přechodu do další fáze), ve 3 případech přešla do druhé hypotyreózní fáze, z toho se následně vyvinula ve 2 případech trvalá hypotyreóza, a ve zbylých 2 případech byla prokázána hypertyreóza GB typu.
� Trvalá porucha funkce štítné žlázy tedy nakonec zůstala u 12, tj. 54 % původně eutyreoidních žen s pozitivitou antiTPO protilátek. Z toho u 10 % zůstala trvalá hy-potyreóza, u 2 tyreotoxikóza GB typu.
Návrh screeningu nemocí štítné žlázy v těhotenství na základě zkušeností s prováděným vyšetřením v Západo-českém kraji:� V 1. trimestru se při první návštěvě gyne-
kologa doporučuje u těhotných žen vyšetřit palpačně štítnou žlázu a laboratorně sta-novit hladiny TSH, fT4, anti-TPO.
� V případě normálních výsledků zůstává pacientka v péči gynekologa, který do-poručí jodovou suplementaci v dávce 150 – 200 µg jódu na den (optimální by bylo stanovit jodurii v 1. trimestru těho-tenství a podle zjištěné hladiny doporučit vhodnou dávkou jodové suplementace).
� Ženy s patologickými výsledky TSH, fT4 se doporučují k vyšetření na specializovaném
endokrinologickém pracovišti a následné léčbě dle výsledků.
� U klientek s patologickým nálezem antiT-PO a normálními hodnotami TSH, fT4 se doporučuje dále sledovat 1x za 2 měsíce v průběhu prvních dvou trimestrů těhoten-ství hladiny TSH, fT4 pro nebezpečí vývoje hypotyreózy či hypotyroxinemie.
� Po porodu u těchto žen radíme zkontrolo-vat hladinu TSH, fT4, eventuálně doplnit fT3 ve 3. a 6. měsíci po porodu k vyloučení po-porodní poruchy funkce štítné žlázy, navíc s možnou trvalou poruchou funkce.
� Tato doporučení by měla vést k vyloučení nedostatku jódu v populaci těhotných žen, ke včasnému záchytu poruch funkce štítné žlázy a jejich kvalifikované léčbě. Tím do-jde ke zlepšení zdravotního stavu matek a jejich dětí, včetně následujícího zlepšení psychomotorického vývoje dětí.
Podpořeno projektem Ministerstva zdravot-nictví koncepčního rozvoje výzkumné organi-zace 00669806 – FN Plzeň a projektem OP VK CZ.1.07/2.3.00/20.0040.
PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY, FN PLZEŇDR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇe-mail: [email protected]
MUDR. ŠÁRKA SVOBODOVÁ, PH.D.III. INTERNÍ KLNIKA, VŠEOBECNÁ FAKULTNÍ NEMOCNICE V PRAZEU NEMOCNICE 2, 128 00 PRAHA 2
MUDR. DANA HAUEROVÁ, PH.D.ENDOKRINOLOGICKÁ AMBULANCESKRÉTOVA 1210/47, 301 00 PLZEŇ
Studie poruch funkce štítné žlázy v těhotenství v Západočeském kraji
^
Tabulka č. 2: Charakteristika souboru vyšetřovaných
N Průměr SD Medián Minimum Maximum
hCG(kIU/l)
650 25,3 17,69 21 1 159
TSH(mIU/l)
650 1,76 1,13 1,6 0,09 50,00
fT4(pmol/l)
650 13,69 2,34 13,4 1,0 23,8
anti-TPO (U/l) 650 79,0 331,61 11 0 3000
Týden těhotenství 650 17,5 1,60 17 12 32
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 17
Tabulka č. 3: Statistická významnost korelací hodnot hCG, TSH, fT4, antiTPO v průběhu těhotenství u souboru 650 těhotných
hCG TSH fT4 antiTPO
hCG(kIU/l)
NS NS NS
anti-TPO(U/l)
NS p < 0,001 p < 0,001
Týden gravidity p < 0,0001 p < 0,001 p < 0,002 NS
Tabulka č. 4: Patologické nálezy u 650 těhotných žen
Celkový počet %
TSH < 0,3 mIU/l 15 2,3
TSH > 4,5 mIU/l 10 1,5
anti-TPO > 60 U/l 60 9,4
fT4 >23,5 pmol/l 0 0
Tabulka č. 5: Základní charakteristiky souboru těhotných s tyreopatiemi
N Průměr SD Medián Minimum Maximum
TSH(mIU/l)
44 3,432 7,3428 2,17 0,09 50,00
fT4(pmol/l)
44 13,38 2,968 13,2 5,2 23,8
anti-TPO(U/l)
44 746,4 808,89 438 9,0 3000
Objem ŠŽ (ml) 44 8,12 2,716 8,0 3,2 16,9
Tabulka č. 6: Základní charakteristika souboru těhotných s pozitivitou protilátek proti TPO po porodu (3. – 12. měsíc)
N Průměr SD Medián Minimum Maximum
TSH (mIU/l) 36 8,812 14,4974 2,95 0,01 50,00
fT4 (pmol/l) 36 17,72 10,799 15,0 2,3 66,9
anti-TPO (U/l) 36 2132,0 999,51 2577 40 3000
Tabulka č. 7: Funkce štítné žlázy u sledovaného souboru žen ve 2. trimestru a v poporodním období
Funkce štítné žlázy
II. trimestrMěsíc po porodu
3. – 8. 9. – 12.
N % N % N %
Eutyreóza 39 89 13 36 19 52
Hypofunkce 5 11 15 42 15 42
Hyperfunkce 0 0 8 22 2 6
Celkem 44 100 36 100 36 100
Tabulka č. 8: Jodurie u těhotných žen v 1. trimestru gravidity
Funkce štítné žlázy
SJJodurie (mg/L)
Pod 50 50 – 100 101 – 200 201 – 300 Nad 300
N = 178 n % n % n % n % n %
Eutyreóza - 1 1,3 37 47,4 33 42,4 4 5,1 3 3,8
Eutyreóza + 2 2,4 30 36,6 30 36,6 9 11 11 13,4
Hypotyreóza 0 0 2 14,3 2 14,3 7 50 3 21,4
GB tyreotoxikóza - 0 0 3 75 0 0 1 25 0 0
SJ = substituce jódem (+ = ano, - = ne)
Obrázek č. 1: Výskyt poporodních tyreopatiíí
Z celkového počtu zjištěných tyreopatií se podařilo systematicky sledovat během těhotenství a po porodu pouze 44 nemocných.
18
Činnost štítné žlázy ovlivňuje jak průběh těhotenství, tak vývoj plodu i schopnost koncepce. Vzhledem k tomu, že výskyt tyreopatií v ČR je relativně vysoký, vzešel od zástupců Endokrinologické společnosti a představitelů ČSKB návrh na provedení této studie. Přípravě pilotního projektu zaměřeného na výskyt funkčních poruch tyreoidey v graviditě předcházela v průběhu 3 let opakovaná jednání mezi reprezentanty odborných společností a vedením VZP. Plán byl nakonec schválen ke dni 1.1.2009. Finanční prostředky na laboratorní vyšetření byly získány z fondu prevence VZP – byly uvolněny 3 mil Kč.
Pro účastníky studie byly dohodnuty následující podmínky:� Projektu se zúčastní laboratoře provádě-
jící screening vrozených vývojových vad v I. trimestru a mající návaznost na en-dokrinologa ochotného ke spolupráci a na terénní gynekologická pracoviště.
� V laboratoři se bude provádět vyšetření ty-reotropinu (TSH), volného tyroxinu (FT4) a autoprotilátek proti tyreoidální peroxidá-ze (ATPO) v séru těhotných žen v 10. týdnu těhotenství. Jednotlivá testování budou re-alizována společně, a to 1x v rámci projektu na 1 rodné číslo.
� Bodové ohodnocení bude pojišťovnou sní-ženo na 500 bodů za soubor těchto vy-šetření (Sazebník výkonů: TSH 140 bodů, FT4 147 bodů a AntiTPO 378 bodů; celkem tedy 665 bodů). V rámci studie hradila pojišťovna laboratoři 580 Kč za klientku, z čehož 80 Kč bylo určeno spolupracující-mu gynekologovi za každou pacientku (tuto částku mu vyplácela laboratoř).
Do pilotní studie byla vybrána také laboratoř Oddělení nukleární medicíny FN Hradec Králové. Na základě počtu těhotných žen nám byl stanoven limit 400 vyšetření. Spolupracujícím endokrinologem byl určen prof. MUDr. Jiří Horáček, CSc. Právní oddělení fakultní nemocnice uzavřelo ve spolupráci s VZP patřičnou smlouvu, poté následovaly písemné dohody mezi nemocnicí a spolupracujícími gynekology. Finanční oddělení FN vytvořilo kód v NIS (nemocniční informační systém), který umožnil plynulou fakturaci pro VZP a platbu gynekologům.
Zároveň jsme vypracovali speciální žádanku. Odběr mohl být prováděn současně s odběrem pro screening v I. trimestru. Gynekolog zajistil informování klientky – se žádankou a materiálem pro vyšetření zaslal do laboratoře
i podepsaný informovaný souhlas s účastí ve studii s kontaktem na maminku v případě pozitivního nálezu.
Zpočátku jsme oslovili pouze asi 20 lékařů, avšak po oznámení požadovaného počtu vyšetření (400) a délky studie (duben až září) jsme byli nuceni navázat spolupráci s dalšími gynekology. Rovněž jsme zjistili, že VZP nemá mezi klientkami příliš velké zastoupení. Při jednání s lékaři, podpisování smluv, předávání potřebných dokumentů a domluvy následných postupů se nám osvědčil osobní kontakt.
Společně s endokrinologem prof. Horáčkem
jsme vypracovali následovný postup pro případ pozitivního výsledku:
1. domluvení termínu v endokrinologické poradně
2. přímý kontakt s maminkou – mobilní te-lefon (s klientkami byla výborná spolu-práce, ihned bylo stanoveno datum další návštěvy u endokrinologa)
3. oznámení ošetřujícímu gynekologovi
Pro stanovení hormonů jsme používali sou-pravy firmy Immunotech, dceřinné společnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o.:
Naše účast v pilotní studii VZP ČR: Screening onemocnění štítné žlázy u těhotných žen
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 19
V souvislosti se stále diskutovanou nutností testování stavu štítné žlázy u těhotných žen nabízí společnost Beckman Coulter v příbalových letácích soupravy pro stanovení FT4 kromě referenčních mezí pro celou populaci i 95% referenční interval pro jednotlivé trimestry těhotenství:
n 95% referenční interval (pmol/L)
1. trimestr 131 6,67 – 13,86
2. trimestr 120 5,79 – 12,70
3. trimestr 121 6,11 – 12,20
Přístroj Zdroj Stát (n) TSH (mIU/L) FT3 (pmol/L) FT4 (pmol/L)
IFU USA 0.34 – 5.60 3.2 – 6.0 7.86 – 14.41
Access Systems D’Herbomez et alFrancie (234)
Německo (337) Itálie (139)
0.35 – 3.5 nesledováno 7.7 – 14.2
DxI 800 Fillee et al Belgium (91) nesledováno 4.0 – 5.7 7.6 – 16.1
DxI 600 Furroqh et al India (319) 0.45 – 4.69 nesledováno nesledováno
DxI 800 Celebiler Cavusoglu et al Turkey (418) 0.41 – 4.25 4.02 – 5.9 7.85 – 13.64
Stanovení hormonů štítné žlázy na imunochemických analyzátorech Access 2 a UniCel® DxI
Stanovení TSH, FT4 a ATPO jsme doposud u těhotných neprováděli. Firma Immunotech nám poskytla několik souprav pro určení hraničních hodnot u gravidních žen. Na základě stanovení těchto tří parametrů u 140 klientek jsme po dohodě s prof. Horáčkem nastavili pro studii tyto hranice:
Uvedená stanovení jsme zařadili mezi rutinní analýzy na automatu STRATEC SR 300.
Projekt byl zahájen dne 1.1.2009. První ma-minka přišla 22. dubna 2009, poslední pak 20. října 2009. Za tuto dobu se nám podařilo provést všech 400 určených stanovení.
V roce 2010 studie pokračovala. Podmínky pro účast byly téměř stejné. Opět s námi spo-lupracoval prof. Horáček. Z předpokládaného počtu 700 vyšetřených jsme od 1.9.2010 do 31.12.2010 zpracovali pouze 221 sér od gra-vidních žen. Buď bylo v toto období méně tě-hotných, anebo se na situaci odrazily jiné pod-mínky pro gynekology (nedostávali již 80 Kč za každou takovou pacientku).
Závěry ze screeningu ve FN Hradec Králové byly publikovány v článku „Jiri Horacek and others: Universal screening detects two-times more thyroid disorders in early pregnancy than targeted high-risk case finding. Eur J Endocri-nol 163(4):645-50 (2010)“.
Ze 400 žen mělo 65 (16,3 %) ≥ 1 abnorma-litu: vyšší TSH bylo nalezeno v 10,3 %, nižší FT4 u 2 % a pozitivní ATPO v 8,3 %. 51 tě-hotných bylo vyšetřeno a sledováno. Léčba Levo-T4 byla indikována u 49 pacientek pro autoimunní tyreoiditidu (u 42), hypotyreózu (u 34) nebo obojí (u 27). Více než polovina (55 %) gravidních žen s tyreopatií by nebyla zachycena, pokud by byly vyšetřovány jen ty se zvýšeným rizikem autoimunitních onemocnění
a dysfunkcí štítné žlázy. Screening se tedy na základě těchto výsledků jeví jako oprávněný.
Celkem bylo v ČR vyšetřeno 3 577 sér ve 13 regionech. V obou částech projektu byly vyčerpány asi 2 mil Kč. V souhrnné zprá-vě o výsledcích pilotní studie, vypracované Doc. MUDr. Z. Límanovou, CSc. a Ing. D. Sprin-ger, PhD., je deklarováno, že Česká endokri-nologická společnost JEP a Česká společnost klinické biochemie JEP zavedení screeningu podporují. Projekt ověřil četnost tyreopatií v těhotenství a schůdnost screeningového vyšetření ve spojení se screeningem vroze-ných vývojových vad v I. trimestru. Důležitým výsledkem studie, dle našeho mínění, je také zvýšená informovanost o tomto problému mezi gynekology a ženami ve fertilním věku.
ING. BLANKA DLABALOVÁODDĚLENÍ NUKLEÁRNÍ MEDICÍNY, FA-KULTNÍ NEMOCNICE HRADEC KRÁLOVÉSOKOLSKÁ 511, 500 36 HRADEC KRÁLOVÉe-mail: [email protected]
Laboratoř by si měla stanovit vlastní referenční meze. Že je tato skutečnost důležitá zejména u hormonů štítné žlázy, kde existují velké geografické rozdíly, ukazuje následující přehled z literatury:
n 95% referenční interval (pmol/L)
316 7,86 – 14,41
20
Novorodenecký skríning (NS) na Slovensku je úspešný preventívny program s dlho-
ročnou tradíciou. Prvým ochore-ním sledovaným v populácii novo-rodených detí bola fenylketonúria, ktorú sme na Slovensku zaviedli v roku 1979. Organizačný model jedného skríningového laborató-ria a troch špecializovaných am-bulancií pre konfirmáciu a liečbu zachytených prípadov bol uvedený v roku 1985 so skríningom konge-nitálnej hypotyreózy.
Kritériá novorodeneckého skríningu boli sfor-mulované v publikácii Svetovej zdravotníckej organizácie Principles and Practices of Scree-ning of Disease v Ženeve v roku 1968. Autormi sú J.M.G. Wilson a G. Jungner. Desať princípov môžeme zhrnúť do kategórií – ochorenie, test, liečba a ekonomika. Rozhodovanie o tom, kto-ré ochorenie zaradiť do programu, je založené na kombinácii faktov o závažnosti ochorenia, pre ktoré existuje vhodný test a liečba pri ro-zumnej cene.
Wilson & Jungner: „Ústredná myšlienka sko-rej detekcie ochorenia a liečby je v podstate jednoduchá. Cesta k správnemu výsledku (na jednej strane začať liečiť pacientov so zachy-teným ochorením a na druhej strane sa vyhnúť poškodeniu pacientov, ktorí nepotrebujú lieč-bu) ale nie je jednoduchá, hoci môže vyzerať zdanlivo jednoducho.“
Kongenitálna hypotyreóza (KH) je najčastej-šia (vrodená) endokrinopatia. Ročne sa no-vorodeneckým skríningom vo svete zachytí približne 12 milónov detí s touto poruchou. Hlavným cielom tohto skríningu je detekcia primárnej hypotyreózy. Jej príčiny sú rozdelené nasledovne:� 85% sporadická KH
2. mutácia v transkripčných faktoroch PAX – 8 a TTF – 2 a TSH receptore
� 15% dedičná KH/dyshormogenéza1. dedičná tvorba syntézy tyroxínu2. mutácia v géne pre Na/I transportér,
TPO a tyreoglobulín (La Franchi 1999)Záchyt bábätiek s KH, ktoré sú v čase odberu
suchej krvnej vzorky najčastejšie bez prízna-
kov, zabráni ťažkej mentálnej retardácii. Liečba novorodencov, ktorá nastúpi najneskôr do jed-ného mesiaca života dieťaťa, normalizuje jeho vývoj. Práca kolektívu autorov okolo profesora Dluholuckého, uverejnená v Československej pediatrii v roku 1983, zhrnula výsledky trojroč-ného skríningu KH v stredoslovenskom regióne na populácii 31 760 novorodencov a zachytila 7 prípadov KH. Prvé štatistické údaje zohlad-ňovali rozdelenie diagnóz KH, stanovenie sen-zitivity, špecificity metodiky merania tyroxínu metódou T4 RIA – spot Ostion. Algoritmus or-ganizačného modelu skríningu KH a označenie vzoriek v jednotlivých novorodeneckých odde-leniach nemocníc vytvorili základ úspešného modelu, ktorý je platný dodnes.
Skríningové centrum novorodencov SR pri DFNsP v Banskej Bystrici je slovenské centrálne laboratórium pre novorodenecký skríning KH, FKU, CAH a CF zo suchej kvapky krvi. V skrínin-gu KH bol vyšetrovaný ako hlavný marker Total T4 metódu RIA. Vo vzorkách pod 90 nmol/L bolo TSH testované kitom RIA. V roku 2002 do-šlo ku zmene primárneho markera na TSH vy-šetrovaného kitom neo TSH ILMA Immunotech (dcérska spoločnosť Beckman Coulter).
Suchá krvná vzorka je novorodencom odo-beraná v 72. – 96. hodine života. U vybratej skupiny detí sa vykoná aj druhý odber suchej vzorky 10. – 14. deň po narodení. Ide hlavne o nezrelá a závažne chorá bábätka. Záväzným pokynom pre NS na Slovensku je 64. odbor-né usmernenie č. 187828/2008 OZS Vestníka MZ SR ku skríningu KH, FKU, CAH a CF. Súčas-ný algoritmus NS KH na Slovensku je znázor-nený na obrázku č. 3.
Laboratórna analýza skríningu KH je v súčas-nosti založená na zmeraní dubletu 3,2 mm terčíka suchej krvnej vzorky mikroplatničkovou luminometrickou analýzou. Cut off limit pre 4. deň života dieťaťa je v našom laboratóriu 10 mIU/L a je denne upravovaný pomocou tzv. „plávajúceho cut –off“. V prípade poziti-vity v oblasti „šedej zóny“ je vyžiadaná druhá vzorka novorodenca. Hodnoty nad 20 mIU/L sú nahlasované na konfirmáciu diagnostickým testom do špecializovaných ambulancií – re-call centier v Bratislave, Banskej Bystrici a Ko-šiciach – podla bydliska dieťaťa. Pozitívne prí-pady KH, potvrdené meraním TSH a fT4 v sére, sú nasadené na liečbu a zostávajú v sledovaní endokrinológov. Výsledky sú spätne monito-rované a negatívne, pozitívne aj tranzientné formy sú štatisticky vyhodnocované.
V rokoch 1985 – 2011 bolo vyšetrených 1 704 805 novorodencov a zachytených 413 porúch štítnej žlazy.
V tabulke č. 1 je uvedená incidencia KH za obdobie 27. ročného skríningu rozdelená na obdobie testovania pomocou T4 a TSH do roku 2002 a samotným TSH od roku 2003.
Výsledky skríningu podla jednotlivých rokov sú uvedené v grafe č. 1.
V rokoch 2003 – 2011 je evidentný zvýšený počet prípadov KH. Z počtu 479 879 narodených detí je incidencia pre
Novorodenecký skríning kongenitálnej hypotyreózy na Slovensku
Obr. 1 a 2: Výsledky trojročného screeningu kon-genitálnej hypotyreózy v spádovej oblasti juh Stre-doslovenského kraja, S. Dluholucký, V. Hornová, M. Bucek, P. Lukáč, Čs. Pediat., 38, 1983, č. 12.
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 21
permanentnú KH 1 : 2 742, tranzientnú KH 1 : 1 121 a pre primárnu KH s neskorým vzostupom TSH 1 : 18 456. Zvýšená incidencia KH sa uvádza vo viacerých krajinách Európy, USA a Austrálii. Medzi možné príčiny patrí nasledovné faktory: � zvýšený počet novorodencov s nízkou pôrodnou hmotnosťou a zrelosťou, zvýšený počet dvojičiek� v laboratórnych postupoch modifikácia skríningových protokolov, ako je nižší cut off limit, opakované odbery pre nezrelé deti� environmentálne faktory (zásobovanie populácie jó-dom, ako aj iné noxy ovplyvňujúce činnosť štítnej žl azy)
Rozvoj neonatálnej medicíny a laboratórnych algoritmov umožňuje zachytiť viac detí s KH. Celkové výsledky novorodeneckého skríningu na Slovensku znázorňuje tabulka č. 2. Za celé obdobie existencie SCN SR bolo v novorodeneckom skríningu na Slovensku zachytených 647 novorodencov.
Novorodenecký skríningový program na Slovensku pokrýva 100 % populácie narodenej na území nášho štátu. Organizačný model centrálneho laboratória a recall centier pre jednotlivé ochorenia umožňuje včas nasadiť liečbu a zachovať kvalitu programu aj v zložke terapie a dispenzáru pacientov.
RNDR. MÁRIA KNAPKOVÁSKRÍNINGOVÉ CENTRUM NOVORODENCOV, DETSKÁ FAKULTNÁ NEMOCNICA S POLIKLINIKOU BANSKÁ BYSTRICANÁMESTIE L. SVOBODU 1, 974 01 BANSKÁ BYSTRICAE-MAIL: [email protected]
MUDr. A. Nogeová, Recall centrum KH v Bratislave: „Fotka pacienta s KH – retrosternálna ektopia ŠŽ, substitučná terapia Eutyroxom. Takéto krásne sú detičky aj napriek KH, keď dodržujú predpísanú liečbu a pravidelne chodia na kontrolu.“
Graf č. 1: Zachytené prípady KH. Ročná správa SCN SR za rok 2011.
1985 – 2011 Incidencia KH 1 : 4 128
1985 – 2002 Incidencia KH 1 : 5 190
2003 – 2011 Incidencia KH 1 : 2 742
KH
10
17
1212111012
912
17
101415
121314
2016
1115
12
17
222323
29
22
0
5
10
15
20
25
30
35
1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
Choroba Počet novorodencov Záchyt Incidencia
KH 1 704 805 413 1 : 4 128
FKU 927 524 157 1 : 5 908
CAH 442 540 51 1 : 8 677
CF 164 199 26 1 : 6 315
Tabulka č. 1: Incidencia KH za obdobie 27. ročného skríningu
Tabulka č. 2: Celkové výsledky novorodeneckého skríningu na Slovensku
Obr. 3: Súčasný algoritmus NS KH na Slovensku.
22
V letošním roce představila společnost Beckman Coulter na svých imunochemických analyzátorech řady DxI novinku – skupina testů byla rozšířena o možnost automatického ředění vysokých koncentra-cí bez nutnosti jakéhokoli zásahu ze strany obsluhy.
Jakým způsobem funkce „on board dilution“ vlastně pracuje? Do reagenčního pros- toru analyzátoru se umístí reagenční kazeta obsahující buď ředící roztok Sample di-luent A, nebo promývací pufr Wash buffer, případně obě tyto kazety. Jestliže přístroj při načítání požadavků z LISu narazí na test, u něhož existuje možnost ředění, auto-maticky při alikvotaci vzorku pipetuje i tzv. rezervní objem pro reflexní test. Pokud se výsledek pohybuje nad rozsah stanovení určitého testu, je rezervní objem použit na reflexní stanovení daného parametru současně s definovaným ředěním séra.
Funkci automatického zpracování testů lze vypnout. Je to užitečné především teh-dy, jestliže máte k dispozici pouze malé množství séra. Ale ani v případě, že tuto funkci vypnete, se nezbavujete možnosti ředění vzorku strojem. Pro stanovení re-analýzy vzorků s vysokou koncentrací je jen nutné znovu vložit primární zkumavku.
Reagenční kazety s ředícím roztokem A a promývacím pufrem obsahují 5 nádobek, z nichž každá je upotřebitelná 56 dní od dne prvního použití. To znamená, že obě kazety mají celkovou stabilitu přibližně 10 měsíců.
U testů, které bylo dosud možné ředit automaticky pufrem přímo z promývací láh-ve, zůstává tato možnost zachována. To je výhodné především v případě screeningu vrozených vývojových vad ve druhém trimestru těhotenství, kdy by se kapacita kazet s promývacím roztokem zdála nedostačující vzhledem k vysokým hladinám hCG ve všech vzorcích.
Podrobnosti o automatickém ředění vzorků najdete v příbalových letácích.Kazety s ředící pufrem A a promývacím roztokem lze objednat pod následujícími
katalogovými čísly:
A79783 Sample diluent A
A79784 Wash Buffer II
Název Diluent
AFP Wash Buffer
DHEA-S Wash Buffer
Ferritin Wash Buffer
Folate Wash Buffer
PAPPA (IVD) Wash Buffer
PAPPA (RUO) Wash Buffer
PSA (Hybritech) Wash Buffer
PSA (WHO) Wash Buffer
SHBG Wash Buffer
sTfR Wash Buffer
Total BhCG Wash Buffer
Triage BNP Wash Buffer
Název Diluent
BR Monitor Sample Diluent A
CK-MB Sample Diluent A
Digoxin Sample Diluent A
EPO Sample Diluent A
Fast TSH Sample Diluent A
GI Monitor Sample Diluent A
hFSH Sample Diluent A
hGH Sample Diluent A
hLH Sample Diluent A
IL-6 (IVD) Sample Diluent A
IL-6 (RUO) Sample Diluent A
Inhibin A Sample Diluent A
Insulin Sample Diluent A
Intact PTH (Intraop) Sample Diluent A
Intact PTH (Routine) Sample Diluent A
Myoglobin Sample Diluent A
Ostase Sample Diluent A
OV Monitor Sample Diluent A
Prolactin Sample Diluent A
TPO Ab Sample Diluent A
TSH Sample Diluent A
Vit B12 Sample Diluent A
Přehled testů, kterých se funkce „on board dilution“ týká:
On board dilution – nová funkce analyzátorů řady DxI
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 23
Společnost Beckman Coulter nabízí ve svém imunochemic-
kém portfoliu dvě varianty stanovení progesteronu, a to metodiky s názvem Prog a P4DE. V České re-publice a na Slovensku se doposud používala pouze
metoda Prog, metoda P4DE byla aplikována především v Německu (P4DE neboli Proge-steron for Deutschland). Při účasti externí-ho hodnocení kvality SEKK se tyto sesterské metodiky dostávaly do křížku, jelikož je každá z nich navázána na jiný referenční materiál. Ve výsledku tak měly české a slovenské laborato-ře v SEKKu, který je společný jak pro nás, tak pro Německo v rámci jedné skupiny, problém s úspěšností. Laboratorních pracovišť má náš západní soused o poznání více, a naši zákaz-níci se tedy ocitali mimo požadovaný rozsah a „nevycházeli“ v cyklu.Proto jsme se rozhodli pro naše klienty kalibrá-tor P4DE zajistit a převést je na tuto metodu. Co to pro uživatele imunochemických systémů Beckman Coulter a vyšetření progesteronu znamená? V první řade je potřeba nakonfigu-rovat metodu P4DE s číslem testu 259 (kon-
CHARAKTERISTIKA METODY PROGESTERON PROGESTERON DE
název reagencie Progesteron Progesteron
objednávkové číslo 33550 33550
název kalibrátoru Progesteron kalibrátor Progesteron DE kalibrátor
objednávkové číslo kalibrátoru 33555 A80773
název testu ve stroji Prog P4DE
označení kalibrátoru ve stroji ProgCal P4DECal
číslo testu 114 259
kód do LISu A43 A116
typ vzorku sérum sérum
objem vzorku 20 µl 20 µl
P4DE konečně i pro Českou republiku a Slovensko
figurace – testy). Dále pak načíst kalibrátor P4DE (reagencie zůstává stejná), nastavit nové referenční meze a komunikační kód pro LIS. Více informací o obou metodikách naleznete
v tabulce. V případě dotazů se, prosím, nevá-hejte obrátit na produktové specialistky.
Ako sme vás už informovali v čís-le 20 nášho časopisu, spoloč-nosť Beckman Coulter Česká
republika s.r.o. pod záštitou České společnosti pro biochemii a moleku-lární biologii usporiadala ďalší, v pora-dí už štvrtý ročník súťaže vedeckých prác – Cena Arnolda Beckmana.
Účastníci z českej, ako aj slovenskej republi-ky mohli prihlasovať svoje práce tradične do troch kategórií:� Genomika, genetika a analýza nuk-
leových kyselín
� Proteomika
� Bunečná biológia a imunológia
Komisia zastúpená významnými vedcami v čele s predsedom spoločnosti ČSBMB prof. Pače-som mala v tomto ročníku naozaj velmi ťažké rozhodovanie.Výhercovia svoje práce predstavili na XXIII. Biochemickém sjezdu České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a Sloven-skej spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu, ktorý sa tento rok konal v dňoch 26. – 29. Augusta 2012 v Brne. Tu im taktiež počas otváracieho ceremoniálu bola z rúk Ing. Vác-lava Mádra, riaditela spoločnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o., cena slávnostne odovzdaná.
Hlavnú výhru 50 000 Kč a možnosť čerpať 50% zlavu (najviac však 2 mil. Kč) na akýkolvek analyzátor z produkcie koncernu Beckman Coulter získali v jednotlivých kategóriách tieto práce:
Genomika, genetika a analýza nukleo-vých kyselín
MGR. LENKA NOSKOVÁÚSTAV DĚDIČNÝCH A METABOLICKÝCH PORUCH, 1. LF UK V PRAZE
Za prácu:Mutations in DNAJC5, Encoding Cysteine-String Protein Alpha, Cause Autosomal-Dominant Adult-Onset Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
The American Journal of Human Genetics 89, 241–252, August 12, 2011
Proteomika
ING. TOMÁŠ TAKÁČ, PH.D.CENTRUM REGIONU HANÁ PRO BIOTECHNOLOGICKÝ A ZEMĚDĚLSKÝ VÝZKUM UP V OLOMOUCI
Za prácu:Proteomics on Brefeldin A-Treated Arabi-dopsis Roots Reveals Profilin 2 as a New Protein Involved in the Cross-Talk between Vesicular Trafficking and the Actin Cytos-keleton
Journal of Proteome Research 2011, 10, 488–501
Cena Arnolda Beckmana- vyhlásenie víťazov pre rok 2012
Arnold O. Beckman
Bunečná biológia a imunológia
MGR. JITKA FUČÍKOVÁODDĚLENÍ IMUNOLOGIE, 2. LF UK V PRAZE
Za prácu:Human Tumor Cells Killed by Anthracyclines Induce aTumor-Specific Immune Response
Cancer Res 2011;71:4821-4833
Víťazom ešte raz srdečne blahoželáme a zá-roveň všetkým súťažiacim ďakujeme za zaslané práce. Už teraz sa tešíme na vaše príspevky do ďalšieho, jubilejného 5. ročníka ceny Arnolda Beckmana, ktorý sa uskutoční v roku 2014 a kde budeme prijímať práce publikované v ro-koch 2012 – 2013.
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 25
Neuronální ceroidní lipofuscinózy (NCL) jsou heterogenní skupi-nou vzácných geneticky podmí-
něných neurodegenerativních onemoc-nění. Jejich incidence se pohybuje mezi 1 – 30 na 100 000 narozených jedinců. Společnými charakteristikami těchto poruch je akumulace autofluorescent-ního materiálu v lysozomech neurál-ních a periferních tkání a neurodege-nerace1. NCL se projevují progresivním zhoršováním kognitivních i fyzických schopností, poruchami vidění a epi-leptickými záchvaty. Dělí se tradičně podle věku prvního nástupu nemoci na infantilní, pozdně infantilní, juvenilní a adultní. Doposud bylo popsáno více než 400 mutací v devíti genech (http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml).
Adultní NCL (ANCL) je velmi vzácnou for-mou tohoto druhu onemocnění. Její moleku-lární podstata nebyla dosud známa. Sporadic-ké nebo autozomálně recesivní případy jsou popisovány jako Kufsova choroba (CLN4A, MIM 204300), zatímco autozomálně domi-nantní adultní NCL je nazývána jako Parryho choroba, případně Parryho typ Kufsovy choro-by (CLN4B, MIM 162350). ANCL se objevují ve věku mezi 10 – 50 lety. Projevují se epilepsií, ataxií, parkinsonismem, křečemi a zhoršová-ním kognitivních funkcí. Narozdíl od ostatních forem NCL nejsou nikdy přítomny poruchy vi-dění.Na Ústavu dědičných metabolických poruch
1. LF UK a VFN v Praze byla diagnostikována česká rodina s autozomálně dominantní adult-ní formou NCL. Byly u ní provedeny moleku-lárně genetické analýzy s cílem odhalit dosud neznámý kauzální gen způsobující tuto varian-tu ANCL. Pro studium její molekulární podsta-ty byla použita kombinace vazebné a expresní analýzy a exomového sekvenování. Genomová DNA všech dostupných členů rodiny byla nej-prve použita pro genotypovaní a vazebnou analýzu. Identifikovali jsme pět kandidátních oblastí obsahujících zhruba 450 známých genů. U sedmi pacientů bylo dále provedeno genotypování a rozbor změn počtu kopií. Ne-nalezli jsme však žádné potenciálně patogenní rozsáhlejší delece nebo duplikace. Paralelně jsme analyzovali genové exprese z leukocytů čtyř pacientů a čtyř kontrol. Získali jsme se-znam 2 131 diferenciálně exprimovaných genů, z nichž 65 leželo v oblastech identifikovaných
vazebnou analýzou. Tyto údaje však stále ne-byly dostačující pro nalezení mutace v kauzál-ním genu. Proto jsme se rozhodli sekvenovat celý exom jednoho pacienta na sekvenátoru SOLiD 4 v institutu CeGaT. Po filtrování dat jsme dostali 957 změn (jednonukleotidových polymorfismů a indel záměn) unikátních pro sekvenovaného jedince. Po propojení výsledků vazebné a expresní analýzy a exomového sek-venování (obrázek 1A) se nám podařilo identi-fikovat kandidátní gen DNAJC5 ležící v kan-didátní oblasti na chromozomu 20q13.33. Jeho exprese byla v leukocytech pacienta statisticky významně zvýšena ve srovnání s kontrolami a obsahoval unikátní heterozygotní mutaci c.346_348delCTC (p. Leu116del). Segregace této záměny byla ověřena u ostatních členů rodiny Sangerovým sekvenováním.Díky spolupráci s Rare NCL Gene Consorti-
um shromažďující vzorky pacientů s vzácnými typy NCL jsme získali genomovou DNA dalších 23 případů, a to buď familiárních, nebo spora-dických. U jednoho z dosud nepublikovaných případů jsme identifikovali totožnou záměnu v genu DNAJC5 c.346_348delCTC, u jiných tří případů pak byla nalezena heterozygotní mutace v DNAJC5 c.344T>G (p. Leu115Arg) (obrázek 1B). Žádná z uvedených záměn v genu DNAJC5 není popsána v databázích dbSNP a 1 000 Genomů. Nenalezli jsme ji ani u 200 kontrolních vzorků evropské populace. Abychom ověřili, že mutace vznikly nezávisle, provedli jsme homozygotní mapování genomo-vých oblastí DNAJC5 a ukázali, že obě mutace vznikly opakovaně na různých haplotypech.DNAJC5 kóduje cysteine-string protein alpha (CSPα). Ten patří do skupiny J-proteinů, molekulárních chaperonů interagujících s ro-dinou proteinů Hsp70, které hrají významnou roli v inhibici neurodegenerativních procesů2. CSPα je membránovým proteinem lokalizo-vaným v synaptických váčcích. Obsahuje na cystein bohatou oblast, jejíž palmitoylace kotví protein do synaptické membrány3-5. In-teraguje s proteinem Hsc70 a SGT, a vytváří tak enzymaticky aktivní chaperonový komplex, jenž ve spolupráci s dalšími chaperony zpro-středkovává správnou konformaci řady protei-nů účastnících se synaptických dějů6. Deplece CSPα vede u myši a u Drosophila melanogaster k progresivní neurodegeneraci a redukované délce života7, 8.CSPα je vysoce konzervovaný protein. Námi
popsané mutace ovlivňují evolučně konzer-vované leuciny lokalizované v cystein bohaté oblasti. Provedli jsme několik funkčních stu-dií, které měly ukázat efekt mutací na funkci proteinu. Pomocí in silico analýz jsme proká-zali, že obě mutace ovlivňují lokalizaci CSPα v buňce tím, že mění hydrofobicitu a efekti-vitu palmitoylace. Tato změněná lokaliza-ce byla potvrzena v in vitro studiích pomocí transientní exprese wt a mutovaných forem EGFP-CSPα konstruktů v CAD5 neuronálních buňkách (obrázek 2). Imunohistochemická studia dále ukázala snížené množství proteinu (u p.Leu16del mutace) či naprostou absenci proteinu (u p.Leu115Arg mutace) v šedé hmotě mozkové kůry pacientů (obrázek 3A). U paci-enta s p.Leu116del mutací byla dále metodou Western blot prokázána nepřítomnost solubil-ního CSPα v mozkovém homogenátu a velké množství agregovaného nerozpustného mate-riálu obsahujícího CSPα protein (obrázek 3B). Tyto agregáty pravděpodobně obsahují jak wt, tak mutovanou formu proteinu, a mohou tím způsobovat depleci CSPα.Funkčními studiemi jsme dokázali, že mutace
Mutace v genu DNAJC5 kódující cysteine-string protein alfa jsou příčinou autozomálně dominantní adultní neuronální ceroidní lipofuscinózy
Obrázek 1:A/ Počty kandidátních genů získaných pomocí vazeb-né analýzy, analýzy diferenciální genové exprese a ce-loexomového sekvenování. Jejich průnikem byl jediný kandidátní gen – DNAJC5.B/ Chromatogramy sekvencí DNAJC5 v rodinách shromážděných v rámci mezinárodního konzorcia Rare NCL Gene Consortium ukazující sekvenci kon-trolního jedince (horní panel), sekvenci probanda z původní české rodiny nesoucí heterozygotní mu-taci c.346_348delCTC (p.Leu116del) (prostřední pa-nel) a sekvenci probanda jedné ze tří rodin, u nichž byla identifikována heterozygotní mutace c.344T>G (p.Leu115Arg) (spodní panel).
26
v genu DNAJC5 jsou příčinou adultní formy neuronální ceroidní lipofuscinózy. Zároveň byla doložena existence neuroprotektivní funkce CSPα na modelu vzácného onemocnění a tímto způsobem se otevřela další cesta pro studium role CSPα u neuronálních ceroidních lipofuscinóz i v dalších neurodegenerativních procesech. V současné době probíhá ve spolupráci s Biotechnologickým institutem v Seville a Univerzitou v Kalifornii studium funkce CSPα na úrovni neuronálních kmenových buněk derivovaných z fibroblastů pacientů s ANCL a ve spolupráci s Ústavem molekulární genetiky AV ČR je připravován transgenní zvířecí model.
Brefeldin A (BFA) je chemická sloučenina (makrocyklický lakton) narušující sekre-torické a recyklační váčkové (vezikulární)
transportní procesy v kvasinkových, savčích a také rostlinných buňkách. Na molekulární úrovni BFA inhibuje aktivitu adenosine diphos-phate ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factor (ARF-GEF) proteinů, které mají významnou funkci ve váčkovém transpor-tu. Subcelulární projevy rostlin jsou v odpově-di na BFA druhově, ale i orgánově specifické. V kořenech Arabidopsis BFA způsobuje akumu-laci sekretorických a recyklačních váčků (vezi-kul) trans-Golgi systému (TGN). Ty se agregují do tzv. BFA kompartmentů. Tento proces závisí na BFA senzitivním ARF-GEF proteinu GNOM.
Kromě váčkového transportu bylo prokázá-
no, že BFA narušuje také aktinový cytoskelet v rostlinných buňkách. Málo je však známo o molekulární podstatě této interakce. Ví se, že regulace dynamiky aktinu je v rostlinných buňkách uskutečňována aktin-vážícími protei-ny, jako jsou profiliny, aktin vazebné proteiny nebo villiny. Přestože je BFA široce využíván v buněčně-biologických studiích zkoumajících váčkový transport individuálních proteinů, jeho komplexní účinek na buněčný proteom není dobře znám. Navíc vliv BFA na proteom kořene Arabidopsis nebyl dosud zkoumán.
Proto jsme se zaměřili na identifikaci BFA--ovlivněných proteinů váčkového transportu a proteinů regulace cytoskeletu v kořenech Arabidopsis thaliana proteomickými přístupy (Takáč et al., 2011). Pro detailní charakterizaci
vybraných proteinů byly aplikovány moderní buněčné biologické metody. Pro diferenciál-ní proteomické analýzy jsme použili kořeny Arabidopsis ovlivněné BFA po dobu 2 hodin v koncentraci, která způsobuje výše zmíněné subcelulární projevy. Ty byly zdokumentová-ny pomocí elektronové a konfokální laserové skenovací mikroskopie. Kontrolní rostliny byly ovlivněny stejným roztokem bez inhibitoru. Proteiny jsme extrahovali z kořenů pomocí fenolové extrakce a následné precipitace. Pro-teom jsme analyzovali pomocí počáteční sepa-race proteinů dvourozměrnou elektroforézou, následným štěpením proteinů a identifikací s využitím MSMS hmotnostní spektrometrie. Ve druhém přístupu byly proteiny štěpeny přímo v extraktu a peptidy rozděleny a iden-
Literatura:1. Jalanko A., Braulke T. (2009). Neuronal ceroid li-
pofuscinoses. Biochimica Et Biophysica Acta-Mo-lecular Cell Research 1793, 697-709.
2. Zhao X., Braun A., Braun J. (2008). Biological roles of neural J proteins. Cellular and Molecular Life Sciences 65, 2385-2396.
3. Greaves J., Chamberlain L. (2006). Dual role of the cysteine-string domain in membrane binding and palmitoylation-dependent sorting of the molecu-lar chaperone cysteine-string protein. Molecular Biology of the Cell 17, 4748-4759.
4. Chamberlain L., Burgoyne R. (1998). The cysteine--string domain of the secretory vesicle cysteine--string protein is required for membrane targe-ting. Biochemical Journal 335, 205-209.
5. Greaves J., Salaun C., Fukata Y., Fukata M., Cham-berlain L. H. (2008). Palmitoylation and membra-ne interactions of the neuroprotective chaperone cysteine-string protein. J Biol Chem 283, 25014-25026.
6. Tobaben S., Thakur P., Fernandez-Chacon R., Sudhof T., Rettig J., Stahl B. (2001). A trimeric protein complex functions as a synaptic chapero-ne machine. Neuron 31, 987-999.
7. Zinsmaier K., Eberle K., Buchner E., Walter N., Benzer S. (1994). Paralysis and early death in cys-teine string protein mutants of drosophila. Sci-ence 263, 977-980.
8. Fernandez-Chacon R., Wolfel M., Nishimune H., Tabares L., Schmitz F., Castellano-Munoz M., Rosenmund C., Montesinos M., Sanes J., Schneggenburger R. et al. (2004). The synaptic vesicle protein CSP alpha prevents presynaptic degeneration. Neuron 42, 237-251.
MGR. LENKA NOSKOVÁÚSTAV DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH PORUCH 1. LF UK A VFNKE KARLOVU 2, 128 00 PRAHA 2e-mail: [email protected]
Obrázek 2:Imunofluorescenční analýza lokalizace wt a mutovaných forem EGFP-CSPα v CAD5 neuronálních buňkách. Wt for-ma je lokalizována především na plazmatické membráně; mutované formy vykazují difúzní cytoplazmatické barvení a částečně kolokalizují s markery endoplazmatického reti-kula (PDI) a Golgiho systému (GS28).
Obrázek 3:A/ Imunohistochemická analýza CSPα v mozkové kůře kontroly u pacientů ukázala absenci CSPα u paci-enta s p.Leu115Arg mutací a významné snížení množství CSPα u pacienta s p.Leu116del mutací.B/ Analýza mozkových homogenátů pacienta s p.Leu116del mutací pomocí metody Western blot potvrdila nepřítomnost rozpustného CSPα a hromadění nerozpustných agregátů obsahujících CSPα uvolněných po chemické depalmitoylaci.
Brefeldin A
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 27
tifikovány prostřednictvím dvourozměrné kapalinové chromatografie spojené s MSMS hmotnostní spektrometrií. V obou případech byly abundance proteinů kvantifikovány a byl porovnán proteom kořenů ovlivněných a kon-trolních rostlin.
Proteomická analýza identifikovala 33 pro-teinů, které signifikantně změnily svou abundanci po ovlivnění BFA. S ohledem na známý efekt BFA jsme předpokládali dife-renciální regulaci proteinů váčkového trans-portu. V této souvislosti jsme detekovali va- kuolární protonovou ATPasu B tvořící kom-plex s VHA-a1 lokalizovanou na TGN. Podobně jsme odhalili tzv. reversibly glycosylated polypeptide 1 (RGP1) – protein, jenž je rovněž lokalizován na TGN. Tyto výsledky naznaču-jí, že BFA způsobuje akumulaci TGN proteinů v BFA kompartmentu v kořenových buňkách Arabidopsis. Bezgelová proteomická analýza identifikovala také profilin 2 jako protein zvy-šující své zastoupení po ovlivnění BFA.
Profilin 2 se váže na aktin a podporuje jeho polymerizaci. Zvýšená abundance profilinu 2 po BFA v proteomické analýze byla rovněž potvrzena nezávislou imunoblotovou analýzou. In vivo mikroskopická sledování kořenů transgenních rostlin Arabidopsis ne-soucích fúzní GFP-profilin 2 ukázala jeho lo-kalizaci v cytoplazmě a jádře. Po ovlivnění BFA akumuloval tento profilin v BFA kompartmen-tech. Protože profilin reguluje polymerizaci aktinu, pozorovali jsme i dynamiku aktinové-ho cytoskeletu pomocí aktin-reportérového konstruktu 35S::GFP:FABD2 exprimovaného v kořenech Arabidopsis. Zjistili jsme narušení
struktury aktinových filament a nárůst cyto-plazmatického fluorescenčního signálu po přidání BFA. Zbytky aktinu se částečně aku-mulovaly okolo BFA kompartmentů, jejichž přítomnost byla potvrzena specifickou mem-bránovou barvičkou FM4-64. Pozorovali jsme, že BFA kompartmenty se pohybovaly podél zbytků aktinových vláken.
Tyto výsledky ukazují, že profilin 2 se účastní interakce mezi váčkovým transportem a cy-toskeletem, pravděpodobně v podpoře po-lymerizace aktinu při tvorbě a pohybu BFA kompartmentů. Kromě zmíněných změn jsme našli zvýšenou akumulaci proteinů lokalizova-ných v endoplazmatickém retikulu (ER). Jeden z nich, luminal binding protein 2, je zodpověd-ný za skládání nově syntetizovaných proteinů v ER. Je známo, že zvýšená abundance BiP2 může znamenat indukci tzv. reakce na ne-správně složené proteiny (unfolded protein re-sponse; UPR). Tuto hypotézu potvrzuje také in-hibice AAATPázy (AAA-ATPase subunit RPT3), která reguluje transport nesprávně složených proteinů do cytoplazmy k degradaci v protea-zomovém kom-plexu, pod vlivem BFA. Akumulaci ER-rezidentních proteinů jsme dokázali pomo-cí transgenních rostlin Arabido-psis nesoucích GFP-HDEL kon-strukt (HDEL je signální pepti-
dová sekvence pro ER lokalizované proteiny). Objevili jsme akumulaci signálu GFP-HDEL po přidání BFA. Detailní pozorování pomocí elek-tronové mikroskopie také ukázala zvětšování objemu ER a akumulaci elektrondenzního ma-teriálu v ER kořenových buňkách Arabidopsis ovlivněných BFA.
Böhm N., Obert B., Ren H., Niehaus K., Šamaj J. (2011) Proteomics on brefeldin a-treated arabidopsis roots reveals profilin 2 as a new protein involved in the cross-talk between vesicular trafficking and the actin cytoskeleton. J. Proteome Res 10:488–501.
ING. TOMÁŠ TAKÁČ, PH.D.CENTRUM REGIONU HANÁ PRO BIOTECH-NOLOGICKÝ A ZEMĚDĚLSKÝ VÝZKUM, PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA, UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCIŠLECHTITELŮ 11, 783 71 OLOMOUCemail: [email protected]
Obrázek 1: Vizualizace membrán a vezikul v neovlivněných kořenech Arabidopsis thaliana (A) a BFA indukovaných kompartmentů pomocí membránové styry-lové barvičky FM4-64 epifluorescenční mikroskopií. Šipky ukazují na tři nejvý-raznější BFA kompartmenty v každé buňce. Měřítko je 2,5 μm pro C a 10 μm pro A a B.
Obrázek 2: Reprezentativní dvourozměrný PAGE gel kořenového proteomu Arabidopsis tha-liana(A; 7 cm IPG stripy (pH 5 – 8), 10% SDS-PAGE gel). Pomocí softwarové kvantitativní analý-
zy (software PDQuest, Bio-Rad) jsme detekovali 90 spotů se změněnou abundancí (p < 0,05) po vlivu BFA. Šipky ukazují na pozici identifikovaných proteinů se změněnou abundancí.(B) Zvětšené porovnání spotů mezi kontrolními (vlevo) a BFA ovlivněnými kořeny
(vpravo). Spot 1 byl identifikován jako jacalin lectin protein, 2 je monodehydroascor-bate reductase, 3 hydrogen ion transporting ATP synthase, 4 HSC70-1, 5 BIP2, 6 pfkB--type carbohydrate kinase family protein, 7 26S proteasome AAA-ATP-ase subunit RPT3, 8 putative T-complex protein 1, theta subunit, 9 triosephosphate isomerase, cytosolic, 10 RGP1, 11 elongation factor 1B-gamma, putative, 12 GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, 13 L-ascorbate peroxidase 1, 14 chalcone-flavanone isomerase, 15 monooxygenase family protein, 16 auxin-induced atb2, 17 probable mitochondrial-processing peptidase subunit beta, 18 microtubule associated protein, 19 chaperonin, putative, 20 phenylalanine am-monia-lyase, 21 map 4 kinase alpha1, 22 isopropyl malate isomerase large subunit 1, 23 je 2- oxoglutarate dehydrogenase E2 subunit a 24 beta-glucosidase.
Obrázek 3: Subcelulární lokalizace profilinu 2 v kontrolních (A) a BFA-ovlivně-ných (B) kořenech Arabidopsis thaliana pomocí 35S::PROFILIN2:GFP konstruktu. Šipky (B) ukazují na BFA kompartmenty obsahující Profilin2-GFP, přičemž troj-úhelníky označují pozice jader v těchto buňkách. Měřítko je 15 μm.
28
Obrázek č. 1: Antracykliny indukují imunogenní buněčnou smrt: A) Kinetika exprese immunogeních molekul HSP70, HSP90 a kalretikulinu na buněčném povrchu leukemické nádorové linie REH; data získaná po-mocí cytometrické analýzy.B) Kinetika uvolňování pozdně apoptotického markeru HMGB1 do bu-něčného supernatantu nádorových buněk ošetřených spektrem klinicky používaných chemoterapeutik.Obrázek byl převzat a upraven z publikace Fucikova J. et al, Cancer Re-search, 2011.
Obrázek č. 2: Kinetika fagocytózy nádorových buněk ošetřených testova-nými chemoterapeutiky:A) Procento fagocytovaných nádorových buněk po 24hodinové kultivaci dendritických buněk s nádorovými buňkami; data získaná pomocí cyto-metrické analýzy.B) Detekce procenta fagocytujících buněk pomocí konfokální mikrosko-pie.Obrázek byl převzat a upraven z publikace Fucikova J. et al, Cancer Re-search, 2011.
Obrázek č. 3: Indukce antigen specifické T buněčné odpovědi:A) Detekce CD8 antigen specifických T lymfocytů pomocí cytometrické analýzy.B) Reprezentativní dotplotové znázornění populace antigen specifických T lymfocytů.Obrázek byl převzat a upraven z publikace Fucikova J. et al, Cancer Re-search, 2011.
Buněčná smrt indukovaná antra-cykliny je v současné době považo-vána za imunogenní typ buněčné smrti. Je charakterizována expresí molekul teplotního šoku (HSP)2 a kalretikulinu3. Tyto molekuly ex-primované na povrchu nádorových buněk jsou následně schopné in-dukovat maturaci dendritických buněk, a usnadňují tak prezentaci nádorových antigenů dendritický-mi buňkami dalším buňkám imu-nitního systému4. Pozdně imuno-genní marker buněčné smrti High mobility group box 1 (HMGB1), vážící se na toll-like receptor 4 (TLR4) na povrchu dendritických buněk, usnadňuje prezentaci anti-genů nádorových buněk dendritic-kým buňkám.
Všechny dosavadní studie, které se zabývaly imunogenní buněč-nou smrtí, byly provedeny na my-ších modelech. V naší práci jsme naproti tomu sledovali schopnost různých klinicky aplikovaných che-moterapeutik, včetně antracyklinů, indukovat imunogenní buněčnou smrt na ovariální (OV90), prosta-tické (DU145) a leukemické ná-dorové linii a primárních buňkách karcinomu ovaria a leukemických blastech pacientů s ALL (akutní lymfoblastická leukémie). Dalším naším cílem bylo charakterizovat, zda jsou imunogenní buňky schop-né indukovat ve zvýšené míře fa-gocytózu dendritickými buňkami a jejich aktivaci, jelikož pouze dokonale aktivovaná dendritická buňka je schopná indukovat pro-tinádorově specifickou imunitní odpověď.
Z výsledků vyplývá, že z testova-ných cytostatik pouze antracykliny indukují translokaci kalretikuli-nu, HSP70 a 90 na buněčný po-vrch a uvolnění molekuly HMGB1 po 12hodinové expozici chemote-rapeutiku (obr. č. 1). Dendritické buňky fagocytují ve zvýšené míře imunogenní nádorové buňky ošet-řené antracykliny (doxorubicinem) (obr. č. 2), což přímo souvisí s ex-presí kalretikulinu na jejich bu-něčném povrchu. U dendritických buněk pulzovaných nádorovými buňkami ošetřenými antracykliny dochází k mírnému zvýšení ex-prese kostimulačních molekul. Pro studium schopnosti dendritických
buněk pulzovaných nádorovými buňkami indukovat aktivaci au-tologních lymfocytů byla vybrána nádorová linie REH, pocházející z pacienta s akutní lymfoblastic-kou leukémií. Dendritické buňky pulzované nádorovými buňkami ošetřenými antracykliny aktivují nejvíce specifických T lymfocytů produkujících IFNγ (obr. č. 3) a zá-roveň inhibují vznik imunosupre-sivních regulačních T lymfocytů.
Tato data definují molekulární charakteristiku imunogenní bu-něčné smrti jako klíčového para-metru protinádorové imunitní od-povědi a ukazují možnou strategii imunogenní chemoterapie u on-kologických pacientů.
Použitá literatura1. Fucikova J., Kralikova P., Fialova A.,
Brtnicky T., Rob L., Bartunkova J., Spisek R. Human tumor cells killed by antracyclines induce a tumor--specific immune response. Cancer Res 2011;71:4821-33.
2. Spisek R., Charalambous A., Mazum-der A., Vesole D. H., Jagannath S., Dhodapkar M. Bortezomib enhances dendritic cell (DC)-mediated induc-tion of immunity to human myelo-ma via exposure of cell surface heat shock protein 90 on dying tumor cells: therapeutic implications. Blo-od 2007;109:4839-45.
3. Obeid M., Tesniere A., Ghiringhelli F., Fimia G. M., Apetoh L., Perfettini J. L. et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med 2007;13:54-61.
4. Tesniere A., Panaretakis T., Kepp O., Apetoh L., Ghiringhelli F., Zitvogel L. et al. Molecular characteristics of immunogenic cancer cell death. Cell Death Differ 2008;15:3-12.
MGR. JITKA FUČÍKOVÁÚSTAV IMUNOLOGIE, 2. LF UK A FN MOTOLV ÚVALU 84, 150 06 PRAHA 5e-mail: [email protected]
2Gynekologicko-porodnická klinika,2. LF UK a FN Motol
Human tumor cells killed by antracyclines induce a tumor-specific immune response
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 29
V následujícím článku bychom vám rádi představili nový modul hematologické linky DxH 800, kterým je nátěrová a barvicí jed-notka DxH 800 SMS (Slidemaker Stainer). Jeho hlavní výhodou je možnost naprosté standardi-zace procesů nátěrů a barvení. Umožňuje navíc zpracování jak nátěrů získaných automaticky z hematologické linky podle uži-vatelem nastavených kritérií, tak i manuálně připravených nátěrů nejen krevních vzorků, ale také kostní dřeně apod. Tento kom-paktní blok v sobě sdružuje dvě funkčně nezávislé jednotky – ná-těrovou jednotku a barvicí auto-mat. Věnujme se nyní podrobněji jednotlivým částem systému Uni-Cel® DxH™ 800 SMS.Vlastní nátěrová jednotka využívá unikátní patentované technologie „Hemasphere“, která uživateli do-voluje hranou roztěrového sklíčka (wedge-pull) vytvořit u každého vzorku vždy standardní (v soula-du s WHO CLSI H20) tenkovrstvý nátěr. Základem uvedené tech-nologie je malá válcová optická komora, v níž se (pomocí reflexe a absorpce 505 nm světelného
Nátěrová a barvicí jednotka v lince UniCel® DxH™ 800 SMS
LED zdroje) testuje stupeň ulpí-vání každého krevního vzorku na skleněném povrchu komory. Po-dle této hodnoty (dané především viskozitou vzorku) se pak nastaví celá dynamika pohybu roztěrové-ho sklíčka (akcelerace, rychlost, úhel). Výsledkem jsou jednotné normované nátěry.Uživatel si dokonce může nastavit velikost krevní kapky pro nátěr, délku, šířku, tvar konce a polo-hu nátěru na sklíčku. Jednotka je schopná vytvořit až 140 nátěrů/hod a navíc může, podle zadání obsluhy, poskytnout i více nátěrů od jednoho vzorku. Maximální po-čet nátěrů z jednoho aspirovaného vzorku je 12.Systém používá běžná, typizova-ná, alespoň jednostranně zabrou-šená sklíčka libovolné provenien-ce s matovanou oblastí pro tisk identifikace vzorku. Potisk vzorku probíhá přímo na matovaný po-vrch sklíčka. Odpadá tak problém se samolepicími štítky, které často způsobovaly přenos jednotlivých reagencií při barvení a tím jejich vzájemnou kontaminaci. Vedlej-ším efektem je tedy rovněž úspora barviv. Připravené nátěry se pak
při 37ºC usuší a podle uživatelem programovatelného pořadí (mož-nost statim barvení) se uloží do transportních košíků a postoupí do barvicí jednotky.Barvicí jednotka pracuje stan-dardní laboratorní metodou má-čení nátěrů v barvících roztocích. Zásobníky roztoků jsou uloženy ve stojanu (Floor stand). Jejich doplňování či výměna jsou plně automatické a uživatelsky nasta-vitelné.Je možné používat nejen více bar-vicích protokolů, ale také různé typy barviv. Uživatel si může na obrazovce přímo v reálném čase programovat propojení jednotli-vých lázní se zásobníky, míchání reagencií, ředění atd.Ve stojanu jednotky se nachází i zásobník demineralizované vody a dva separované odpadní kanyst-ry. Samostatný odpad pro barviva zjednodušuje ekologickou likvida-ci odpadů.Pro barvení lze, díky standardní metodice barvení, používat libo-volná barviva od různých výrob-
ců. Z ekologického a zdravotního hlediska jsou preferované bezme-tanolové barvy na vodní bázi fran-couzského výrobce RAL. Výstupní zásobník barvicí jednotky obsahu-je nejen hotová obarvená a vysu-šená sklíčka, ale shromažďují se v něm současně neobarvené nátě-ry (ty, u nichž uživatel nastavil po-kyn „nebarvit“). Navíc slouží jako vstup pro barvení manuálně při-pravených nátěrů, statimů, vzorků z kostní dřeně apod. (viz foto).Nátěrová a barvicí jednotka DxH 800 SMS představuje součas-ný technologický vrchol v kvalitě nátěrů, standardizaci laborator-ních metod a komfortu obsluhy. Jeho vysoká kapacita 140 nátěrů/hod zaručuje nátěry v reálném čase. Ve spolupráci se třemi blo-ky je DxH 800 při propustnosti cca 350 KO/hod bezkonkurenční i v nejnáročnějších klinických pro-vozech s vysokým počtem těžce patologických vzorků.
Nová verze pipetovací stanice Biomek 3000 ACP (Antibody Cocktail Preparation) je určena pro laborato-
ře průtokové cytometrie, které zpracová-vají velké množství mnohabarevných tes-tů. Systém připravuje koktejly protilátek z jednotlivých lahviček s monoklonálními protilátkami do zkumavek v karuselu pro průtokový cytometr různých výrobců. Současně je možné namíchat bulk koktejl pro další použití a pipetování.
Jeho hlavní výhodou je rychlost přípravy a eliminace manuálního pipetování a chyb při přípravě vzorků mnohobarevných panelů.
Biomek 3000 ACP slouží k použití monoklonálních protilátek z lahviček IOTest, CYTO-STAT, tetraCHROME a dalších výrobců. Protilátky jsou pipetovány do zkumavek v karuselu cytometrů FC500, Navios, Gallios a cytometrů jiných producentů. Umí pipetovat také do 96jamkových destiček, zkumavek 12 x 75 ml nebo 5ml lahviček.
Systém obsahuje uživatelsky příjemný software optimalizovaný pro použití v rutinní laboratoři průtokové cytometrie. Software nabízí předdefinování panelů protilátek, včetně pipetovaných objemů, podle vlastních potřeb a tím velmi rychlou volbu panelu pro použití. Umožňuje rovněž sledování používaných monoklonálních protilátek a zbývajících objemů v lahvičce.
Biomek 3000ACPrep
Pipetovací stanice Biomek
Vyzkoušejte zdarma software Kaluza na:
www.KaluzaNow.com
Automatizované pipetovací stanice Biomek® představují komplexní řešení pro laboratoře, které potřebují pipetovat ve formátu zkumavek nebo destiček. Biomek® umožňuje provádění veškerých manipulací s kapalinami od prostého rozpipetování, ředění a distribuce vzorků, až po speciální manipulace, jako je izolace a purifikace DNA/RNA, PCR set-up nebo přípravu vzorků pro další analýzy.
Biomek 3000
Biomek 4000
Biomek NXp
Biomek FXp
Nová aktualizovaná verze katalogu Cell Analysis pro září 2012 je ke stažení na stránkách www.coulterflow.com pod záložkou „eCatalog Downloads“.
www.Gallios561.comNavštivte stránky s informacemi o průtokovém cytometru Gallios se 4 lasery:
Aktuální verze katalogu “2012 Cell Analysis”
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 31
Obj. číslo Fluorochrom klon Počet testů
B17491 CD163 purif. Mac2-48 1 ml
B17494 CD163 purif. Mac2-158 1 ml
B17499 Hemoglobin F (HbF) purif. WBAC HBF1 1 ml
B17492 CD163 FITC Mac2-158 1 ml
B17497 Hemoglobin F (HbF) FITC WBAC HBF1 1 ml
B17490 CD163 PE Mac2-48 1 ml
B17493 CD163 PE Mac2-158 1 ml
B17498 Hemoglobin F (HbF) PE WBAC HBF1 1 ml
B17495 CD24 ECD ALB9 50
B21205 CD8 PC5.5 B9.11 50
B19719 CD11c PC5.5 BU15 50
B20025 CD40 PC5.5 MAB89 50
B21172 CD61 PC5.5 SZ21 50
B20022 CD123 PC5.5 SSDCLY107D2 50
B20026 CD235a PC5.5 11E4B-7-6 (KC16) 50
B20024 HLA-DR PC5.5 Immu357 50
B19714 CD13 PC7 366 (MY7) 50
B12935 CD23 PC7 3P25 50
B13647 CD123 PC7 SSDCLY107D2 50
B16894 CD41 APC P2 50
B14807 CD45RA APC 2H4LDH11LDB9 50
B15091 CD66b APC 80H3 50
B12934 CD107a APC H4A3 50
B13981 TCR alpha/beta APC IP26A 50
B10823 CD3 APC-Alexa Fluor® 700 UCHT1 50
A99020 CD14 APC-Alexa Fluor® 700 RMO52 50
B12112 CD20 APC-Alexa Fluor® 700 B9E9 50
B16892 CD7 APC-Alexa Fluor® 750 8H8.1 50
B13649 CD9 APC-Alexa Fluor® 750 ALB6 50
B13979 CD25 APC-Alexa Fluor® 750 B1.49.9 50
B12701 CD27 APC-Alexa Fluor® 750 1A4CD27 50
B16893 CD49d APC-Alexa Fluor® 750 HP2/1 50
B12700 CD127 APC-Alexa Fluor® 750 R34.34 50
B19718 CD64 Pacific Blue 22 50
B19717 CD81 Pacific Blue JS64 50
Nové monoklonální protilátkyV návaznosti na průtokové cytometry Navios, Gallios a CyAn a sortery MoFlo XDP a MoFlo Astrios, které jsou určeny pro
komplexní mnohabarevné aplikace, se průběžně rozšiřuje nabídka monoklonálních protilátek a fluorochromů.
V následujícím článku by-chom vám chtěli ukázat, jak lze sestavením komplexního
screeningového mnohobarevného panelu s využitím 3laserového 10ba-revného průtokového cytometru Navi-os, 17 protilátek a vhodné gatovací strategie kompletně určit fenotyp jednotlivých populací leukocytů.
Přípravu takto komplexního vzorku s množ-stvím protilátek lze zabezpečit jak manuálně, tak s využitím dedikovaného cytometrického pipetoru Biomek 3000 ACP (Antibody Cocktail Preparation) při frekventnější potřebě přípravy mnohobarevných analýz. Ve spojení s výsledky z hematologického analyzátoru UniCel DxH lze poté získat ucelený pohled na daného pacienta a jasnou indikaci, jakým směrem dále v diag- nostice postupovat.
Při sestavování komplexního panelu je samo-zřejmě nutné respektovat několik důležitých okolností, jako jsou vzájemné přesvity fluo-rochromů, vzájemná exkluzivita či koexpre-se markerů, dále zda je marker silně či slabě exprimován, zda má daná populace diskrétní nebo souvislý (modulovaný) signál a mnoho dalších. V neposlední řadě je rovněž nutné při-hlédnout k dostupnosti kombinací jednotlivých CD markerů a fluorochromů.
Konečný design panelu pro screening leuko-cytů se 17 protilátkami v 1 zkumavce s využi-tím protilátek Beckman Coulter a průtokového cytometru Navios a při respektování všech důležitých výše uvedených souvislostí může vypadat takto (viz níže).
Diferenciál leukocytů pomocí mnohobarevné průtokové cytometrie aneb komplexní screeningový panel s použitím 17 protilátek v 1 zkumavce
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 33
www.coulterfl ow.com
MoFlo Astrioscell sorter
� až 7 nezávislých laserů (včetně pravého UV)� 7 pinhole� analýza až 100 000 buněk/sekundu� sortování až 70 000 buněk/sekundu� automatické nastavení drop delay
bez použití partikulí� 6-cestné sortování � sorting na sklíčka, do zkumavek a až do 1536
- jamkových destiček� 32 bitové zpracování dat� přes 4 MILIARDY zobrazených kanálů pro každý parametr� Index sorting� možnost umístění do Biosafety II boxu� automatický QC proces
www.coulterfl ow.com
MoFlo Astrioscell sorter
� až 7 nezávislých laserů (včetně pravého UV)� 7 pinhole� analýza až 100 000 buněk/sekundu� sortování až 70 000 buněk/sekundu� automatické nastavení drop delay
bez použití partikulí� 6-cestné sortování � sorting na sklíčka, do zkumavek a až do 1536
- jamkových destiček� 32 bitové zpracování dat� přes 4 MILIARDY zobrazených kanálů pro každý parametr� Index sorting� možnost umístění do Biosafety II boxu� automatický QC proces
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 35
Průtoková cytometrie (flow cytometry, FC) nepatří u monoklonálních gamapatií (MG) mezi diagnostické metody, nicméně její význam stále roste a FC se stává nezbytnou nejen v době stanovení diagnózy MG, ale také při studiu léčebné odpovědi (Paiva et. al, 2010; Kovářová et al., 2011a). Jako velmi důležité se u MG ukázalo monitorování minimální reziduální nemoci (MRN), a to zejména stanovení přísné kompletní remise (stringent complete remisson, sCR) (Rajkumar et al., 2011). Kritéria sCR se v současnosti mění nejen z důvodu nástupu účinnějších léčebných protokolů, ale také na základě technického pokroku v oblasti průtokové cytometrie. Ukazuje se, že 4barevná FC není dostatečná pro stanovení tzv. „imunofenotypové remise“ (iCR) – nepřítomnost klonu plazmocytů (PC). Pro optimální hodnocení MRN je vyžadována 8barevná FC kombinující povrchové a intracelulární znaky důležité pro identifikaci a stanovení klonality PC (Hájek et al., 2012; Kovarova et al., 2011b).Skupina Euroflow se společně s Evropskou
myelomovou sítí (European Meloma Network, EMN) snaží o standardizaci FC analýz u MG, což by mohlo napomoci zisku většího počtu vzájemně kompatibilních dat. Tento přístup je nicméně poněkud finančně náročný, proto prozatím většina laboratoří využívá své vlastní postupy (van Dongen et al., 2012).Cílem práce bylo prokázat výhody
multiparametrické FC v analýze MRN, přičemž
šlo zejména o odhalení a enumeraci klonálních PC.Analýzy proběhly u pacientů s MM, kteří
prošli autologní transplantací periferních kmenových buněk (peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT), a to ve 3. měsíci (ideálně 100. den) od provedené PBSCT. Kombinace monoklonálních protilátek (MoAb) obsahovala vybrané povrchové a intracelulání znaky v 8barevném nastavení: CD38-Pacific Blue/CD45-Krome Orange/ck-FITC/cl-PE/CD138-PerCP/CD19-PC7/CD56-APC/CD27-APCeFluor780 (Beckman Coulter, Exbio, eBiosciences), přičemž bylo využito Intraprep kitu (Beckman Coulter). Rozbor byl proveden na přístroji BD FACSCanto II (BD Biosciences). Reanalýza byla uskutečněna pomocí SW Infinicyt (Cytognos). Množství použitého biologického mateiálu (kostní dřeně, KD) bylo optimalizováno tak, aby bylo možno z analýzy získat minimálně 1 000 PC. Tím byla zachována dostatečná citlivost a výpovědní hodnota analýzy.Bylo zjištěno, že relativní množství
CD38+CD138+ PC koresponduje s typem léčebné odpovědi dosažené u pacientů. Např. vyšetřované osoby v CR měly nižší infiltraci PC než ty s velmi dobrou parciální odpovědí (very good partial response, VGPR). Co se týče zastoupení jednotlivých subpopulací, na základě znaků CD19 a CD56 rozlišujeme zjednodušeně CD19+CD56- normální PC a CD19-CD56+ abnormální PC. Jak však
bylo ověřeno cytoplazmatickou analýzou imunoglobulinových lehkých řetězců kappa a lambda, toto rozdělení je pouze orientační a nemusí jednoznačně odpovídat polyklonálním a klonálním PC, zejména v období po proběhlé léčbě. To potvrzuje nezbytnost stanovení klonality PC např. také u nově diagnostikovaných nejasných MG. Ovšem v některých případech k odhalení klonální populace napomohl až znak C27, resp. jeho absence na patologických PC (viz obrázek), jelikož malý klon PC nemohl být spolehlivě identifikován na pozadí početně převažujících polyklonálních PC. Pomocí FC byla potvrzena nepřítomnost klonu PC u všech pacientů v sCR. V jednom případě pak vymizení klonu následkem udržovací léčby vedlo k přechodu z CR do sCR.Je tedy evidentní, že multiparametrická
analýza klonality PC přináší dostatek informací k potvrzení normality PC, či k odhalení i velmi malého klonu PC. Při analýze dostatečného množství PC se pak senzitivita FC přístupu blíží až k 10-4, a je tak vhodnou metodou nejen pro detekci MRN.
Podpořeno projekty MSM0021622434, IGA NT12425 a GAČR P304/10/1395.
Literatura:1. Paiva B., Almeida J., Pérez-Andrés M. et al.
Utility of flow cytometry immunophenotyping in multiple myeloma and other clonal plasma cell-related disorders. Cytometry B Clin Cytom 2010; 78(4):239-252.
2. Kovářová L., Hájek R. Prognostický význam imunofenotypizace u nemocných s monoklonální gamapatií nejasného významu a mnohočetným myelomem. Klin Biochem Metab. 2011; 19(40)2:96-100.
3. Rajkumar S. V., Harousseau J. L., Durie B. et al. Consensus recommendations for the uniform reporting of clinical trials: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 1. Blood 2011; 117(18): 4691-4695.
4. Hájek et al. Diagnostika a léčba mnohočetného myelomu. Transfuze a hematologie dnes 2012; Suppl1.
5. Kovarova L., Varmuzova T., Zarbochova P. et al. Flow cytometry in monoclonal gammopathies. Klin Onkol. 2011; 24 Suppl:S24-29.
6. van Dongen J. J., Lhermitte L., Böttcher S. et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012; 26(9):1908-1975.
MGR. LUCIE ŘÍHOVÁ, PH.D.1,2
ODDĚLENÍ KLINICKÉ HEMATOLOGIE, FN BRNO, JIHLAVSKÁ 20, 639 00 BRNOBABÁKOVA MYELOMOVÁ SKUPINA PŘI ÚSTAVU PATOLOGICKÉ FYZIOLOGIE, LF MU, KAMENICE 5, 625 00 BRNOe-mail: [email protected]
1Oddělení klinické hematologie, FN Brno2Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno3Interní hemato-onkologická klinika, FN Brno
Uplatnění polychromatické průtokové cytometrie při monitorování minimální reziduální nemoci u pacientů s mnohočetným myelomem
Multiparametrická analýza fenotypu a klonality PC. V době stanovení diagnózy je u pacienta (A1-3) nalézána naprostá převaha klonálních PC jednoznačného fenotypu CD56+. Naopak ve 3. měsíci po transplantaci (B1-B3) nelze dle CD19/CD56 rozpoznat normalitu PC. Malý klon PC je nalezen až pomocí kombinace CD19/CD56 a CD27.
36
Letošní kongres ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embryology) se konal v Istanbulu v ICC (Istanbul Congress Center). Registro- váno bylo zhruba 9 000 účastníků z celého světa, což překonalo Stock-holm 2011 o celých 1 000 osob.
ICC bylo vybudováno ve svahu nad bospor-skou úžinou. Svou rozlehlostí je tato stavba opravdovým labyrintem. Na jedné z fotografií se mi podařilo zachytit pouze levou část kom-plexu. Ta je určena spíše ke kongresovým úče-lům. Pravá část je podobně rozlehlá, ale slouží především k pořádání koncertů vážné hudby. Velký sál, představující její centrum, má vy-nikající akustiku. Velikost areálu však zůstala po celou dobu konání akce její největší slabi-nou. Na každém kroku jsem potkával bloudící účastníky kongresu, kteří marně hledali sál s jimi zvolenou přednáškou. Druhou komplikací byly detektory kovů a RTG kontrola zavazadel u všech vstupů do objektu. U nás se s něčím podobným setkáváme na letištích, v soudních budovách nebo v O2 Aréně. V Turecku najdete detektory ve všech veřejných budovách a ná-kupních centrech. Před zahájením každého dne se tedy u těchto zařízení tvořily nekoneč-né fronty. Někteří návštěvníci si po ránu něko-likrát u bezpečnostních rámů zapípali, než si uvědomili, v jaké kapse nechali klíč od svého hotelového pokoje apod.
Odborný program byl velmi bohatý. Přednáš-
ky probíhaly paralelně ve dvou velkých a několika menších sá-lech. Po celou dobu konference byla k dispozici také posterová sekce – jak jsem posléze zjis-til, tak i s několikerou českou účastí.
Pronikavou inovací prošel kongresový sborník abstraktů Human Repro-duction, který byl v loňském roce nádherně tlustou knihou čítající 350 stran. Letos, zřejmě pod tlakem snižování hmotnosti zavazadel ze strany leteckých společností a ve jménu tech-nického pokroku, nabyl sborník formy malého, nenápadného flash disku, což mě coby zapři-sáhlého bibliofila rozhodně nepotěšilo.
Součástí kongresu byla, jako již tradičně, rozsáhlá expozice firem. Tahákem pro rok 2012 stánku společnosti Beckman Coulter byla prezentace stanovení AMH pomocí přístroje Access. Oficiální zahájení prodeje tohoto kitu je ohlášeno na 2. čtvrtletí roku 2013.
Na istanbulském kongresu byla vyhrazena celá jedna sekce vztahu AMH a PCOS. Očividně tak pokračuje trend zkoumání uvedené vzá-jemné vazby, jak již bylo naznačeno v květnu v Lille. Dále jsem shlédl prezentaci o Inhibi-nu A jako screeningového markeru trisomie 21 a příspěvek na téma Inhibin B a kvalita oocytů. Též jsem navštívil přednášku indických autorů o měření IGF1 v plodové vodě, avšak soubor prezentovaných výsledků byl poměrně malý
a vztah mezi správným vývojem plodu a hla-dinou IGF1 nebyl úplně přesvědčivý. Autoři ale slíbili brzkou prezentaci většího souboru výsledků.
Výraznou kapitolou celé akce byl společen-ský večer ve VIP clubu Suada Istanbul, který je situován na umělém plovoucím ostrově na Bosporu a je všude prezentován jako jediný klub na pomezí Evropy a Asie. Součástí tohoto zařízení je restaurace s velkým společenským sálem, několik barů a 50 m dlouhý plavecký bazén. Klub je opravdovým ostrovem, protože jedinou možností, jak se tam dopravit, je krátká plavba na kolébajících se malých loďkách, což většinou činí problém při návratu společensky unavených klubových členů zpět na pevninu.
Než jsme se však mohli na tyto bárky nalo-dit, museli jsme absolvovat cestu autobusem od ICC do přístavu před Suada klubem. Trasu dlouhou zhruba 3 km jsme zdolávali téměř hodinu. Pokud bychom šli pěšky, byli bychom v cíli pravděpodobně dříve. Všudypřítomná dopravní zácpa je v Istanbulu naprosto nor-mální věc. Celá aglomerace dnes čítá odhadem
Kongres ESHRE1. – 4. července 2012, Istanbul
Přednáškový sál
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 37
15 miliónů obyvatel. Pražská dopravní špička je tedy ve srovnání s tou istanbulskou jen sla-bým odvarem.
Kongresová společenská akce byla zaháje-na rautem. Turecká kuchyně je opravdu vyni-kající, též červené i bílé víno zdejší produkce bylo překvapivě velmi dobré. Rautová večeře probíhala poklidně za zvuku tlumené reprodu-kované turecké hudby. Mírumilovná idyla však vzala za své, když se na pódium vyřítila trojice tureckých muzikantů a rozjela svůj originální bigbít. Něco takového jsem ještě nikdy v životě neviděl, ani neslyšel. Ve chvíli, kdy na jeviště vyběhl frontman kapely, jsem nabyl přesvědče-ní, že jo to Frank Zappa, který pouze simuloval svůj odchod do rockového nebe. Ve skutečnosti emigroval do Turecka a začal tam pracovat na novém rockovém stylu s prvky turecké lidové hudby. To, co se na nás začalo valit, totiž ne-dokážu ani dnes, s velkým časovým odstupem, spolehlivě popsat. Hudební styl místní kapely bych zařadil někam mezi Metallicu a turecký soubor lidových písní a tanců. Rovněž nástroje,
na nichž hudebníci předváděli svoji produkci, jsem nikdy neviděl. Možná by to byla pro Me-tallicu vhodná inspirace, aby nemuseli objíždět svět stále s tím samým Černým albem ještě dalších 20 let.
Večírek tedy probíhal báječně, v sále turecká bigbítová smršť, v baru poklidná konzumace s výhledem na dva světadíly, neformální dis-kuze v tlumeném světle v křeslech u bazénu a konečně také fotografování účastníků jako vzpomínka na tento kongres. Poté, co se větši-na přítomných dam nechala zvěčnit na bazé-nové židličce v pozici, kdy jednou půlkou svého pozadí seděla v Evropě a druhou půlkou v Asii, vyvrcholil turecký bigbít za podpory několika břišních tanečnic v mohutnou extázi. Nako-nec nás malé kolébavé bárky začaly postupně převážet zpět na pevninu. Nikdo se neutopil a dokonce i žaludky všech účastníků přečkaly houpavý transport bez úhony, přestože někdy to bylo opravdu jen o fous.
V mém dřívějším článku ze Stockholmu (IVD 19/2011) následovala na tomto místě ve-
selá historka o hledání hotelu v pro mě ne-známém městě. Istanbul jsem ale v minulosti již několikrát navštívil a navíc jsem výběr mís-ta pro nocleh svěřil svým tureckým přátelům z firmy, s níž obchodně spolupracujeme. Mu-sím říci, že se svého úkolu zhostili dokonale. Našli mi totiž celkem slušný hotel cca 5 minut chůze od ICC. Zdaleka ne všichni měli tak vyni-kající ubytovací agenty jako já. Někteří účast-níci kongresu museli do ICC dojíždět ze vzdá-lených hotelů taxíky či autobusy, a účastnit se tak každodenně nikdy nepolevující istanbulské dopravní zácpy.
Protože již tedy žádnou veselou historku z natáčení v zásobě nemám, budu považovat za vtipnou story vylíčení průběhu společenského večera. A tím jsem dospěl na konec svého vy-právění. Závěr je tudíž jediný: příští rok Londýn.
Ve dnech 12. – 15. září pořádala Evropská společnost pro klinickou analýzu buněk (European Society for Clinical Cell Analysis, ESCCA) v Buda-pešti již 12. ročník Eurokonference – Klinická analýza buněk.
Sjezdu tradičně předcházel 8. Evropský kurz – Klinická cytometrie (11. – 12.9.2012), na němž měli účastníci možnost volby z 5 témat:
1) základní principy v klinické cytometrii, kde přednesl svůj příspěvek rovněž předseda České společnosti pro analytickou cytometrii (ČSAC) doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D. z LF UK a FN Motol
2) kvantitativní cytometrie a buněčné sortování
3) vaskulární biologie (trombóza a cytometrie)4) hemolytická onemocnění5) imunofenotypizace leukémií/lymfomů pro
pokročilé
Vlastní konference pak tématicky postihovala celou šíři klinické cytometrie. Zazněly zde přednášky ze základního i klinického výzkumu. Plenární sekce řešily např. pozdní vývoj B lymfocytů, a to na úrovni fyziologické, nebo u autoimunitních onemocnění či v rámci malignizace, a dále problematiku vzniku a diagnostiky alergií. Rovněž byly představeny nové přístupy v cytometrii jako nádorová nanomedicína, propojení průtokové cytometrie s molekulární diagnostikou a velmi zajímavé využití hmotnostní cytometrie ve
studiu buněčných signálních drah. Další sekce byly věnovány např. prognostickým markerům a jejich uplatnění u hematologických malignit nebo regulaci imunitního systému a transplantacím hematopoetických kmenových buněk. Poslední den bylo možné si vyslechnout příspěvky na téma cytometrické přístupy u rakoviny prsu či antigen-specifická odpověď T lymfocytů. Proběhla také debatní sekce řešící problematiku harmonizace vs. standardizace v oblasti diagnostiky hematologických malignit.
Jednotlivé přednáškové bloky byly prokládány firemními prezentacemi. Mnoho dalších zajímavých témat bylo řešeno v rámci paralelních sekcí. V té s názvem Hematologické malignity I. zazněla mimo jiné i přednáška Dr. Novákové a spol. z CLIPu, LF UK a FN Motol (Composition of bone marrow populations in children with aplastic anemia and refraktory cytopenia in childhood). V uvedené sekci byla dále rozebírána problematika imunofenotypové identifikace lymfomů a leukémií z B lymfocytů či monoklonálních gamapatií. V tématicky navazující sekci byly předneseny příspěvky zabývající se analýzou klonů paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH) či detekcí minimální reziduální choroby. V části zaměřené na buněčné funkce bylo možné shlédnout prezentace odborníků z oblasti imunologie studujících, např. význam detekce aktivace basofilů u alergií.
Nedílnou součástí konference byla též posterová sekce. Bylo zde vystaveno celkem 47 posterů, z toho 10 z nich bylo vybráno
k ústní prezentaci. Pracovníci z ČR (ÚHKT, Praha; BMG, LF MU a OKH, FN Brno) představili 3 postery (práce brněnského pracoviště naleznete v tomto čísle časopisu).
Kromě odborného programu byla pro zájemce zorganizována společenská večeře spojená s plavbou lodí po Dunaji. Ta účastníkům poskytla nevšední pohled na historické památky města, např. budovu Parlamentu, řetězový most či hradní komplex tyčící se nad řekou.
Celkově lze říci, že je tato akce, včetně kurzů, velmi dobrou příležitostí k dalšímu vzdělávání v oblasti klinické cytometrie. Zároveň umožňuje prezentovat vlastní výsledky. Nevýhodou je poměrně vysoká cena, kterou však lze snížit členstvím v ESCCA, nebo statutem studenta. Nutno dodat, že ČSAC i letos vypsala tzv. cestovní grant, díky němuž bylo možné u 2 aktivních účastníků, členů ČSAC, prominout konferenční poplatek.
MGR. LUCIE ŘÍHOVÁ, PH.D.1,2
ODDĚLENÍ KLINICKÉ HEMATOLOGIE, FN BRNO, JIHLAVSKÁ 20, 639 00 BRNOBABÁKOVA MYELOMOVÁ SKUPINA PŘI ÚSTAVU PATOLOGICKÉ FYZIOLOGIE, LF MU, KAMENICE 5, 625 00 BRNOe-mail: [email protected]
SPOLUAUTOŘI:Všianská P.1,2, Varmužová T.1,2
1Oddělení klinické hematologie, FN Brno2Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno
ESCCA konference12. – 15. září 2012, Budapešť
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 39
Ve dnech 23. – 25. září proběhlo již XII. setkání uživatelů hematologických analyzátorů spo-lečnosti Beckman Coulter. Pro uspořádání akce letos organizační tým vybral šumavský Frym-burk nacházející se na břehu Lipenské nádrže. Wellness Hotel Frymburk, v němž se meeting konal, se ukázal jako výborná volba. Na zákla-dě vašich reakcí z odpovědních formulářů si vysoce ceníte jak úrovně ubytování a stravo-vání, tak i celého zázemí hotelu. Bez nadsázky se dá konstatovat, že právě tato destinace je zatím vámi nejlépe hodnoceným místem v his-torii uživatelských setkání. Krásné prostředí ještě doplnilo nádherné počasí. To již tradičně doprovází všechny naše user meetingy, samo-zřejmě až na drobné výjimky (pravidelní účast-níci si jistě pamatují na dvojitý pokus o rafty bez deště).Zpočátku se nám poněkud lepila smůla na paty. Ti z vás, kteří s námi jeli hromadně z Ostravy, to poznali na vlastní kůži, protože jejich autobus u Jihlavy nečekaně zkolaboval. Navzdory nepohodlí, jež cestující museli sná-šet, než se podařilo zajistit náhradní dopravu, však nakonec dorazili do Frymburku všichni s dobrou náladou a úsměvem na rtech.
Uživatelské příspěvky otevřely řadu opravdu zajímavých témat. Získali jsme velmi ucelenou
představu o anemiích, hereditární sferocytóze, diagnostice CLL či trochu sci-fi připomínající pohled na mesenchymální kmenové buňky. Naší snahou bylo ukázat propojení mezi tra-diční hematologií a možnostmi průtokové cytometrie. Velmi oceňované jsou Clinical Cases – validační kurzy našeho hematologic-kého „guru“, kolegy, globálního vědeckého ředitele koncernu MUDr. Ramona Lopez Simo-na. Jeho příspěvky i osobnost ozvláštňují naše uživatelská setkání již celých 9 let. Abstrakta přednášek a kompletní validační kurzy dosta-nou všichni účastníci na CD.
Soustředění a pozornost při přednáškách byly vystřídány chvilkami pro aktivní odpočinek, setkání s kolegy z jiných laboratoří a příjemnou zábavou při hudbě a tanci. Většina z nás pod-nikla výlet lanovkou na vrch Kramolín a od-tud stezkou v korunách stromů na rozhlednu. Stezka nabídla řadu různých prolézaček a po-hybových aktivit. Sestup z rozhledny byl velmi rychlý a plný adrenalinu. Místní suchý tobogan je nejdelší v ČR – 52 m, doba trvání jízdy cca 10 sec. Pravdou je, že cesta pěšky dolů by byla jistě rychlejší než čekání v nekonečné frontě, ale není nad to si pěkně provětrat hlasivky v temné rouře toboganu. Zbytek odpoledne jsme pak strávili na bobové dráze. Ambiciózní
jezdci se snažili pokořit traťový rekord na mě-řeném úseku, který prý byl podle provozovatele dráhy neuvěřitelných 72 km/hod. Jeden z nás, nejmenovaný výborný houslista od lesa Řáhol-ce, se k němu alespoň přiblížil svým úctyhod-ným výkonem 48 km/hod.
Za všechny organizátory bychom vám chtěli poděkovat za neobvykle srdečnou a přátelskou atmosféru, která nás provázela celým uživatel-ským setkáním a kterou pomohl vytvořit každý z vás.
Pevně věřím, že příští rok se opět potkáme a prožijeme společně další nejen užitečné, ale také příjemné chvíle.
František Vičar (ochránce autobusů, sirotků a dětí)
XII. setkání uživatelů hematologických analyzátorů Beckman Coulter23. – 25. září, Frymburk
40
Předposlední zářijovou neděli přivítaly vý-chodočeské Pardubice opět po dvou letech účastníky sympozia FONS, a to krásným a slu-nečným počasím. Navzdory tomuto faktu byl zájem o úvodní přednášku, která byla věnova-ná památce pana profesora Jaroslava Maso-pusta, poměrně velký. Součástí cyklu byl i křest velmi zajímavé publikace Prof. Kazdy s názvem „Kritické stavy“. Nedělní program byl ukončen uvítacím přípitkem ve foyer nové univerzitní budovy, do níž se přestěhovala chemicko-tech-nologická fakulta z již nevyhovujících prostor v centru města. Pro zájemce byla přichystána také prohlídka posluchačských laboratoří v do-provodu proděkana Prof. Kalendy, který přidal k dobru několik úsměvných historek z bohaté minulosti fakulty.
Pondělní dopoledne bylo zahájeno blokem přednášek na opravdu aktuální téma – eko-nomika laboratorní medicíny. Zájem ze strany posluchačů byl velký, univerzitní aula téměř „praskala ve švech“. Z obsahu příspěvků bylo možné odtušit směr, jakým by se financování klinických laboratoří mohlo ubírat. Potom se až do konce odpoledního odborného programu vystřídalo několik tematických bloků, např. au-
tomatizace a konsolidace klinických laboratoří nebo glykovaný hemoglobin v roce 2012.
Paralelně s hlavním programem běžel v ma-lém sále cyklus přednášek, který byl zaměřen na specifická témata. Například z oblasti mo-lekulární biologie pocházela vskutku zajímavá prezentace o zoonózách hrozících v ČR. Vyvr-cholením dne byl workshop naší společnosti, kde byla představena úplná novinka – unikátní integrovaný analyzátor PowerLink. Potom ná-sledovala prezentace přístroje iPaw, stolního laboratorního systému zavádějícího automa-tizaci do ruční přípravy a sledování zkumavek v laboratoři.
Druhý den sympozia byl završen spole-čenským večerem pořádaném na Pardubic-kém zámku. Zde bylo přichystáno pohoštění a ochutnávka moravských vín. Příjemnou at-mosféru podkreslovala svými tóny jazzová ka-pela, která hrála nejen k poslechu.
V úterý krátce po poledni bylo sympozium FONS 2012 ukončeno a účastníci se začali rozjíždět do svých domovů. Nás ještě čekala demontáž firemního stánku. Nakonec jsme s Pardubicemi za zády vyslovili přání, aby i při příštím ročníku vyšlo počasí tak jako letos.
XII. setkání uživatelů hematologických analyzátorů Beckman Coulter 23. – 25. září, Frymburk
FONS 201223. – 25. září 2012, Pardubice
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 41
Vážení čitatelia, dnes vám v našej rubrike „Vizitka“ predstavíme RNDr. Elenu Tibenskú, Ph.D.,
odbornú garantku pre klinickú imu-nológiu v laboratóriách Medirex a.s. Tie sú lídrom a najväčším komplexom klinických laboratórií na Slovensku. Laboratórium klinickej imunológie po-važuje za svoje „najmladšie dieťa“ a je naň aj patrične hrdá, pretože ho spo-luzakladala. So svojimi kolegami sa ho tiež snažia neustále rozvíjať, čo sa im darí.Ako však sama hovorí, každý rodič by mal mať okrem „detí-práce“ aj vlastné záľuby. A pretože tanec predstavuje pre dievča asi najprirodzenejší pohyb, venovala sa mu odmalička. V triná-stich rokoch zakotvila pri folklórnom tanci a zostala mu verná až do skonče-nia vysokoškolského štúdia, neskôr už len pasívne ako divák.
Život však neustále prináša nové výzvy, preto, keď v roku 2008, počas boomu speváckej sú-ťaže Superstar, zorganizovali nadšenci folklóru festival bývalých tanečníkov bratislavských folklórnych súborov nazvaný s trochou nad-sázky „Superstarí“, sme si na ňom, síce trochu s obavami, ale s o to väčším nadšením, zatan-covali aj my – bývalí tanečníci súboru Dimit-rovec. Oprášili sme tanec zo Zemplína z našich „mladých čias“. Avšak zistili sme, že už naozaj nemáme tolko energie a nemôžeme prezento-
vať tie isté tance ako pred 20 rokmi. Súčasne sme však chceli v tancovaní a stretávaní sa po-kračovať. Preto sme sa spojili so známym slo-venským folklórnym choreografom. Ten si nás „vzal pod svoje krídla“ a začali sme trénovať nový tanec, tiež z východného Slovenska zo Šariša z okolia dediny Kyjov.K nácviku nového tanca patrí samozrejme aj „sústredenie“ so všetkým, čo k tomu patrí... V máji 2009 sme absolvovali prvý „zahraničný zájazd“ – zúčastnili sme sa Folklórneho festi-
„Superstarí 2012“
„Superstarí 2008“
42
valu „Senioři“ v moravskom Petrove. Vystúpe-nia a hlavne sústredenia sa nám tak zapáčili, že sme sa rozhodli v tanci pokračovať. Len bolo treba vymyslieť, ktorej časti Slovenska sa bu-deme venovať, pretože všetky sú už pomerne prebádané. Tiež bolo nutné nájsť tance „pri-merané nášmu veku“. Pri dobrom vínku sme si v Petrove spomenuli na krásnu diplomovú prá-cu nášho choreografa spred 35 rokov. V tej sa venoval folklóru tzv. dolnozemských Slovákov a ona odvtedy zapadla prachom. Náš umelec-ký vedúci teda oprášil staré nahrávky a videá a pustili sme sa do práce. Postupne sme posta-vili choreografie tancov Slovákov z Rumunska, Vojvodiny a Maďarska pripomínajúce našim krajanom rodákov, ktorých osud zavial ďaleko od domoviny a ktorí si napriek tomu dokázali udržať slovenský jazyk a ludovú kultúru.Od roku 2009 sme absolvovali už viacero vy-stúpení, vrátane dvoch samostatných pro-gramov, troch ročníkov festivalu „Superstarí“ (ten už stal tradíciou) a festivalu Parade Der Kulturen vo Frankfurte, kde sme zastupova-li komunitu Slovákov žijúcich v tomto mes-te. Avšak asi najväčším zážitkom bol pre nás náš ostatný zájazd (začiatkom júna 2012) na folklórnom festivale Slovákov pochádzajúcich z dolnej zeme v rumunskom Čerpotoku. Tu už vyše ako 200 rokov žije slovenská komunita, ktorá si i pres ťažké podmienky udržiava svoj vzťah k ich rodnej zemi.Všetky naše vystúpenia a zájazdy nám potvr-dili, že to, čo robíme, dokáže spojiť nielen ro-dákov, ale aj ludí z rôznych končín sveta. Aj preto plánujeme nové tance, nové vystúpenia, festivaly, zájazdy a samozrejme sústredenia...
Sťažuje sa vrchný finančný riaditeľ čertov Luciferovi: „Stále na nás tlačíte, aby sme nosili viac a viac úpisov, a pritom nám krátite finančné prostriedky na diagnostiku, či krv, s ktorou sa nám tie milučké hebučké dušičky…?!“ (Tajnička.)
alyča, amabile,
kulač, Nena
nečas
jednotkadélky v Rusku
kladnávlastnost
uhnulo(slovensky)
primitivnípapírovina
styl
3ulice (zkr.)
kus (zkr.)
Heyerdahlovoplavidlo
subtropickárostlinapobídka
ohrazená lesníplocha
Eastern HockeyLeague (zkr.)
vrkoč ihaha
jíl (slovensky)
slavnostní síň
starý (angl.)
brousek(slovensky)
zbraň (fran.)
mongolskýpastevec
avšak
tělocvičnénářadí
zahalují
zakavkazskáslíva
český oscarovýfilm
byznys
voj. jednotka
potomstvo
střelado minometuvelký afr. savec
úkon
Olga (dom.)
pohřebníhostina
agent, poselřecké písmeno
hrubián (hanl.)
stupeň citlivostifilmu
keře pod vyso-kým porostem
obyvatel Irska
všechno (angl.)2
prezident USA
značka bicyklů
staršírumunskýfotbalista
lepidlo zkypřovatpůdu
skupina jezdcůznačkavysavače
mražený krém
kočkovitá šelmapodobná rysovi
jaká(slovensky)
nikl(chem. zn.) 1německá
zpěvačkavojenskávýprava
líbezně(hud.)potomovar
(slovensky)vykonávatpeníze(slovensky)
jenom(nářečně)
autor:Ivan
Šarkanlije
Stěžuje si vrchní finanční ředitel čertů Luciferovi: „Pořád na nás tlačíte, abychom nosili více a více úpisů, a přitom nám krátíte finanční prostředky na diagnostiku, jestli krev, s níž se nám ty miloučkéheboučké dušičky …?!“ (Tajenka.)
Sťažuje sa vrchný finančný riaditeľ čertov Luciferovi: „Stále na nás tlačíte, aby sme nosili viac a viac úpisov, a pritom nám krátite finančné prostriedky na diagnostiku, či krv, s ktorou sa nám tie milučké hebučké dušičky…?!“ (Tajnička.)
alyča, amabile,
kulač, Nena
nečas
jednotkadélky v Rusku
kladnávlastnost
uhnulo(slovensky)
primitivnípapírovina
styl
3ulice (zkr.)
kus (zkr.)
Heyerdahlovoplavidlo
subtropickárostlinapobídka
ohrazená lesníplocha
Eastern HockeyLeague (zkr.)
vrkoč ihaha
jíl (slovensky)
slavnostní síň
starý (angl.)
brousek(slovensky)
zbraň (fran.)
mongolskýpastevec
avšak
tělocvičnénářadí
zahalují
zakavkazskáslíva
český oscarovýfilm
byznys
voj. jednotka
potomstvo
střelado minometuvelký afr. savec
úkon
Olga (dom.)
pohřebníhostina
agent, poselřecké písmeno
hrubián (hanl.)
stupeň citlivostifilmu
keře pod vyso-kým porostem
obyvatel Irska
všechno (angl.)2
prezident USA
značka bicyklů
staršírumunskýfotbalista
lepidlo zkypřovatpůdu
skupina jezdcůznačkavysavače
mražený krém
kočkovitá šelmapodobná rysovi
jaká(slovensky)
nikl(chem. zn.) 1německá
zpěvačkavojenskávýprava
líbezně(hud.)potomovar
(slovensky)vykonávatpeníze(slovensky)
jenom(nářečně)
autor:Ivan
Šarkanlije
Stěžuje si vrchní finanční ředitel čertů Luciferovi: „Pořád na nás tlačíte, abychom nosili více a více úpisů, a přitom nám krátíte finanční prostředky na diagnostiku, jestli krev, s níž se nám ty miloučkéheboučké dušičky …?!“ (Tajenka.)
43
KŘÍŽOVKA O CENY
Česk
á kř
ížov
kaSl
oven
ská
kríž
ovka
Pro 3 vylosované úspěšné luštitele jsou připraveny zajímavé ceny! Tajenky zasílejte e-mailem na adresu: [email protected] do 31. 1. 2013. Do předmětu uveďte „TAJENKA“. Nezapomeňte také, prosím, uvést své kontaktní údaje a název pracoviště. TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: TAK DĚTI NEDOSTANOU PENÍZE Z ŽIVOTNÍ POJISTKY. Výherci: Věra Forejtová, Katarína Kovaličová, Ivana Skřivánková.
´
Stěžuje si vrchní finanční ředitel čertů Luciferovi: „Pořád na nás tlačíte, abychom nosili více a více úpisů, a přitom nám krátíte finanční prostředky na diagnostiku, jestli krev, s níž se nám ty miloučké heboučké dušičky …?!“ (Tajenka.)
Sťažuje sa vrchný finančný riaditel čertov Luciferovi: „Stále na nás tlačíte, aby sme nosili viac a viac úpisov, a pritom nám krátite finančné prostriedky na diagnostiku, či krv, s ktorou sa nám tie milučké hebučké dušičky…?!“ (Tajnička.)
Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 22 - 2012 22
Kde se můžeme setkatformou stánku ( listopad 2012 - březen 2013)
