Jurnal Primatologi Indonesia, Vol. 7 No.1 Juni 2010, p.11-15.ISSN 1410-5373. Pusat Studi Satwa Primata, Institut Pertanian Bogor.

Intervensi Nikotin terhadap Level Low Density Lipoprotein,dan Ekspresi UCP-1 (Uncoupling Protein 1) pada Monyet EkorPanjang (Macaca fascicularis) Obes dengan Resiko Aterogenesis

[NICOTINE INTERVENTION ON LDL AND UCP-1 EXPRESSION INOBESE CYNOMOLGUS MONKEY WITH ATHEROGENESIS RISKS]

Anwar Wardy W1, Irawan Jusuf2, Dondin Sajuthi3,4

Erni Sulistiawati3, Sri Supraptini Mansjoer3, Ria Oktarina5

1Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Jakarta2Fakultas Kedokteran Universitas Hasanudin Makassar

3Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian & Pengabdian Kepada MasyarakatInstitut Pertanian Bogor

4Departmen Klinik Reproduksi dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor5PT. Bimana Indomedical

Korespondensi : anwarwardy@gmail.com

Abstrak: Lima belas monyet ekor panjang obes (Macaca fascicularis) dengan resiko aterogenesis digunakanuntuk memperoleh informasi tingkat low density lipoprotein (LDL) dan ekspresi protein uncoupling-1 (UCP-1) setelah tiga bulan intervensi nikotin dosis rendah per oral. Kelompok hewan dibagi menjadi tiga dengankomponen diet berbeda, yaitu diet A (lemak), diet tipe B (lemak dan kuning telur), dan diet tipe C (komersialdiet-monyet chow), dan setiap kelompok terdiri dari lima monyet. Ketiga diet tersebut dicampur nikotin dandiberikan ke dalam makanan sehari dengan dosis 0,50-0,75 mg/kg/12 jam. Pengamatan terhadap lipid darahdilakukan setiap bulan dan pada saat nekropsi diambil jaringan adiposa coklat untuk evaluasi dengan teknikfluoresensi antibodi. Berdasarkan analisis lipid menunjukkan bahwa ada peningkatan yang signifikankonsentrasi LDL (p <0,05), terutama untuk kelompok yang memperoleh pakan lemak dan telur. Berdasarkanhasil analisis teknik fluoresensi antibodi, diperoleh sel-sel immunoreaktif terhadap ekspresi UCP-1 selamaintervensi nikotin.

Abstract: Fifteen obese cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) were used to obtain information of LDLlevel and to study uncoupling protein-1 (UCP-1) expression during three months oral low dose nicotineintervention. Animals were grouped into three groups based on their diets, diet type A (tallow), type B (tallowand egg yolk) and type C (commercial diet-monkey chow), and each groups consisted of five monkeys.Nicotine was mixed into diet with dose 0.50-0.75 mg/kg/12 hours. Blood samples were colected every monthfor lipid analyses and during necropsy brown adipose tissues were taken for fluorescence antibody techniqueevaluation. Based on the lipid analysis showed that there was significant increase in LDL concentration(p<0.05), particularly for animals consuming diet type B. Florescens antibody evaluation revealed that therewas immunoreactive cells to UCP-1 expression during nicotine intervention.

Keyword: nicotine, expression UCP-1, Lipoprotein Low Density (LDL), cynomolgus

Pendahuluan

Nikotin adalah bahan alkaloid toksik (senyawaamin tersier) yang terdiri dari cincin piridina danpirolidina. Nikotin dapat melewati barier darah otak(blood brain barrier) dan diedarkan ke seluruhbagian otak sehingga menyebabkan ketergantunganyang cukup lama bagi seseorang dan berdampakburuk pada perokok pasif. Namun demikian, peranpositif nikotin dalam tubuh juga tidak dapat diabaikan,diantaranya otak dalam menjalankan fungsi intelekmenggunakan bahan-kimia neurotransmitters nikotinyang selalu ada dan diproduksi oleh sel untuk selaluberfungsi. Efek lain nikotin berperan dalampengaturan energi dalam tubuh dan dapat mengurangi

bobot badan dengan mengaktivasi UCP-1 (uncouplingprotein 1) pada otot rangka, otot subkutan danperitoneal, melalui mekanisme transpor ion proton H+

mitokondria dan pengaturan serta mereduksi produksiReactive Oxygen Species (ROS) (Yamasaki &Sasaki 2006).

Nikotin memiliki margin of safety atau batasaman pemakaian yang luas sampai dengan 60 mg/kgbobot badan baru dianggap toksik atau mematikanpada hewan penelitian. Nikotin setelah melaluimetabolisme di hati secara sistemik didistribusikanke jaringan neuron preganglionik autonomik,neuromuscular junction somatic (N1) dan neural(N2). Kemudian nikotin menstimulasinorepinephrine (NE) melalui signal ß3 adrenergik

12 Jurnal Primatologi Indonesia, Volume 7, Nomor 1, Juni 2010, p.11-15

dalam sel mitokondria dan melalui mekanisme siklusCREB (cAMP response element binding)mengekspresikan UCP-1. Berkurangnya UCP-1dalam sel-sel darah dan jaringan lainnya dapatmempercepat perkembangan plak aterosklerosisdengan menginduksi peningkatan jumlah makrofagdan mengurangi kolagen dalam jaringan tersebut.Komponen utama dari plak aterosklerosis yangterbentuk di dalam dinding pembuluh darah adalahkolesterol dan lebih kurang 65% total kolesterolberada dalam bentuk LDL. Sedangkan sekresi UCP-1 dalam jaringan endokrin brown adipose tissue(BAT) diduga sebagai faktor antiobesitas (Horimoto& Resnick 2002).

Peningkatan pembakaran cadangan makanandalam tubuh dapat meningkatkan panas tubuh yangkemudian memberikan sinyal simpatis pada reseptoradrenergik nervus sistem jaringan sel adipos (Cannon& Nedergard. 2006). Signal intrasel ini akanmerangsang cAMP dan protein kinase A (PKA)yang selanjutnya akan melepaskan triglyceride fattyacid. Mekanisme ini diatur oleh aktivitas pelepasanUCP-1 mitokondria sebagai substrat termogenesistubuh. Berdasarkan hal-hal diatas, diharapkan melaluipenelitian ini dapat diperoleh informasi pengaruhnikotin terhadap ekspresi UCP-1 dan profil lipid padamonyet ekor panjang yang obes dengan resikoaterogenesis.

Metode Penelitian

Hewan laboratoriumHewan percobaan yang digunakan adalah

monyet ekor panjang (Macaca fascicularis)sebanyak 15 ekor, yang telah diberi pakan obesselama 12 bulan dengan tiga jenis pakan perlakuanSetiap kelompok terdiri lima ekor dan mendapatkannutrisi pakan dengan kandungan lemak yang berbeda,dengan dosis nikotin yang sama yakni 0,50–0,75 mg/kg/12 jam selama tiga bulan. Nikotin dalam bentukcairan ditambahkan dalam ketiga jenis pakan tersebut.Adapun pembagian kelompok berdasarkankandungan lemak yang berbeda disajikan pada Tabel1.

Seluruh perlakuan yang melibatkan hewanpercobaan dilakukan berdasarkan peraturan yangtelah ditetapkan oleh Animal Care and UseCommittee (ACUC) yang merupakan KomisiKesejahteraan dan Penggunaan Hewan PercobaanPT IndoAnilab dengan nomor protokol: 04-IA-ACUC-09.

Koleksi sampelPengambilan sampel darah dilakukan pada vena

femoralis sebanyak 5 ml pada hewan yang disedasi

dengan ketamin HCl 10-15 mg/kg bobot badan. Serumdarah yang diperoleh dilakukan pemeriksaan terhadapLDL kolesterol dengan metode enzimatikmenggunakan fotometer seri 5010.

Pada akhir penelitian hewan dietanasia dengantiopental dosis 1 mL/2kg bobot badan dan dilanjutkandengan pengambilan. BAT pada daerah tulangskapula. Jaringan ini difiksasi menggunakan nitrogencair dan selanjutnya penyimpanan dalam nitrogen cairsampai siap untuk analisis tingkat selular ekspresiUCP-1 melalui teknik imunofloresensi.

Imunofloresensi menggunakan goat electronanti-UCP-1 antibody yang telah dilabel zat warnaagar dapat dilihat dengan mikroskop-fluoresensi.Penggunaan enzim sebagai pengganti zat warnafluorokrom untuk menandai elektron, sehingga dapatdigunakan dengan mikroskop biasa. Enzim yangdigunakan enzim peroksidase dari C-20 SantacruzBiotechnology.

Hasil dan Pembahasan

Pengaruh Nikotin terhadap Profil Lipid LDLBerdasarkan hasil analisis LDL kolesterol darah

dari ketiga kelompok perlakuan dapat dilihat bahwakelompok yang mendapat pakan B mengalamipeningkatan yang signifikan (p<0,05) dibandingkankedua kelompok perlakuan lainnya (Gambar 1).

Mekanisme intervensi nikotin secara oralmemodifikasi LDL kolesterol tidak sepenuhnya dapatdijelaskan. Namun, diketahui bahwa nikotin dalambentuk basa menghambat pelepasan asam lemakbebas dari jaringan adiposa yang masuk ke hati.Dengan demikian, asam lemak kurang mengalamiesterifikasi untuk trigliserida dan kemudian masuk kedalam VLDL, yang dapat mengurangi LDL. Denganmeningkatkan aktivitas lipoprotein lipase, asamnikotin dapat meningkatkan laju removalchylomicron trigliserida dalam plasma. Demikian

KandunganNutrisi

Pakan A Pakan APakan A

Protein (%)

(kal/kg)

(mg/kg)

Lemak (%)

Gross energi

Nikotin cair

12,02 13,47 26,82

19,5220,80 4,15

4.479,11 4.399,86 4.492,87

0,75 0,75 0,75

Tabel 1. Komposisi nutrisi formula pakan perlakuan

Sumber : Hasil analisis Laboratorium Ilmu danTeknologi Pakan Fakultas Peternakan IPBBogor 2009.

pula, asam nikotinat menurunkan laju sintesis hati dariVLDL dan LDL. Pada dosis pemeliharaan yangdirekomendasikan, menghasilkan pengurangan klinispada rasio total kolesterol HDL, LDL dan trigliseridasampai 35% dengan peningkatan HDL 16% sampai26%. Selain pengurangan tersebut di atas dalamtingkat LDL, nikotin menyebabkan pergeserankomposisi LDL dari partikel kecil LDL (lipoproteinaterogenik) ke yang lebih besar, lebih ringan partikel2LDL berarti kurang aterogenik. Peningkatan HDLjuga terkait dengan pergeseran dalam distribusi HDLsubfraksi termasuk peningkatan HDL2 dan rasioHDL3, efek perlindungan dari HDL terutama karenaHDL2. Selain itu komponen protein utama darilipoprotein densitas sangat rendah (VLDL) dan fraksiLDL dikenal memainkan peran penting dalamatherogenesis; dan yang homolog dengan LDL tetapidianggap sebagai faktor resiko independen untukpenyakit jantung koroner dan strok (Kamanna et al.2008).

Hasil pengamatan ekspresi UCP-1 disajikan padaGambar 2 dibawah ini yang dapat menjelaskansensitivitas immunoreactive UCP-1. Jalur aktivasithermogenesis pada jaringan otot coklat, adalah a-adrenergik reseptor (a-AR) agonis yang merangsanggenerasi cAMP akan mengaktifkan protein kinase A(PKA).

PKA fosforilase dalam CREB yangmenyebabkan transkripsi gen meningkat. CREBdiaktifkan secara langsung kemudian menginduksiekspresi PGC-1 dan Tipe II tiroksin diodinase (DII).PGC-1 koaktivase faktor transkipsi melekat padaenhancer UCP1 sehingga meningkatkan ekspresiUCP-1 dalam sel. Selain itu, DII meningkatkansintesis ekspresi gen triiodothironina (T3). Sebagailigan untuk reseptor hormon tiroid, peningkatan inilebih lanjut mengekspresikan UCP-1. PKA jugamengaktifkan hormon sensitif lipase (HSL),

meningkatkan konsentrasi asam lemak bebas (FFAs)yang pada gilirannya mengaktifkan protein UCP1.Aktivitas PGC-1 juga koaktifase faktor transkripsi,NRF-1 yang menyebabkan peningkatan gendiperlukan untuk biogenesis mitokondria, termasukNRF-1 dan NRF-2. Hal ini menyebabkan stimulasiyang ditandai biogenesis mitokondria (Jia and Lubetkin2005). Selama pemberian oral nikotin selama 3 bulandan ekspresi UCP-1 dapat dilihat pada ujiimmunoreactive UCP-1 setelah dilakukan nekropsijaringan. Pada MEP obes dengan tingkat pengeluaranenergi normal berpatokan pada massa tubuh dan padaumumnya, kurus atau gemuk memiliki tingkat yangsama dalam pengeluaran energi. Dari hasil penelitiantersebut, MEP obes tidak memiliki defisit pengeluaranenergi. Gambaran ini dapat dilihat dari sensitivitasimmunoreactive UCP-1 pada jaringan BAT padaGambar 2.

Monyet ekor panjang obes pada kelompok Bmemiliki tingkat pengeluaran energi yang normaladanya hipotesis bahwa individu-individu ini memilikiregulasi cacat pengeluaran energi dan pengeluaranenergi menjadi berkurang, sebelum perkembanganobesitas terjadi. Bobot badan mereka diasumsisebagai patologis. Dukungan pada pandangan iniberasal dari studi prospektif, ditemukan bahwapengeluaran energi yang rendah, normalisasi untukmassa tubuh, maka prediksi kenaikan bobot badanakan berlebih (Jia and Lubetkin 2005). Penjelasanpengamatan ini menjadi hipotesis bahwa setiapindividu memiliki “titik massa homeostatik” lemak.Hal ini adalah titik aktivasi proses yang berfungsiuntuk kembali ke massa lemak normal untukmenetapkan titik masing individu. Bila massa lemakmeningkat, kontrol homeostatik diaktifkan yangberfungsi untuk menahan bobot badan lebih lanjut.

Kontrol homeostatik ini yang diduga melibatkanpeningkatan pengeluaran energi pada mitokondriadengan adanya ekspresi UCP-1. Pada akhirnya,seorang individu yang ditakdirkan untuk menjadigemuk, tiba pada “titik gemuk” dan menetapkan padatitik homeostatik, dalam pengeluaran energinyanormal. Sejumlah studi mendukung pendapat ini,bahwa individu memiliki massa lemak set-point, danset-point ini berbeda dari individu ke individu lain,dan hanya mengalami perubahan menjelang dewasa;hal ini yang menjadi landasan kuat penelitian, bahwadiperlukan suatu intervensi substansi yangmendorong adanya kontrol massa homeostatiksepanjang hidup.

Pada penelitian ini ditemukan bahwa variasipenambahan bobot badan diet induced dapatdipertanggungjawabkan oleh variasi dalamkemampuan diet untuk meningkatkan pengeluaran

0

100

200

300

Pakan C

Ko

lest

ero

l LD

L (

mg/

dL)

Warongan et al., Intervensi Nikotin terhadap Ekspresi LDL (Low Density Lipoprotein) 13

Gambar 1. Rerata lipid kolesterol LDL Macaca fascicularis pada awal dan akhir intervensi nikotin.

0

100

200

300

Pakan A Pakan B Pakan C

AwalAkhir

Kol

este

rol L

DL

(mg/

dL)

Ekspresi UCP-1

14 Jurnal Primatologi Indonesia, Volume 7, Nomor 1, Juni 2010, p.11-15

energi. Namun lebih lanjut bahwa variasi inidisebabkan oleh komponen pengeluaran energidisebut aktivitas thermogenesis nonexercise ataunonshivering thermogenesis, yang diperkirakandipicu oleh adanya intervensi nikotin dari energi yangdikeluarkan selama adanya perubahan motilitas. Halin dapat dilihat pada evaluasi MEP obes selama 3bulan mendapat nikotin; menunjukkan pola perbaikandan penurunan bobot badan dan indek massa tubuh;namun intervensi ini juga bermakna nyatameningkatkan keaktifan MEP dan peningkatanfrekuensi makan, minum dan bergerak (Zakariah etal. 2010). Penjelasan dan evaluasi sebelum dilakukannekropsi pada MEP karena adanya norepineprin yangdiinduksi oleh proses termogenesis oleh nikotin padaotot akan menghasilkan protein kinase A, hormonsensitif lipase akan melepaskan trigliserida, asetil CoAyang mengaktifasi FFA dan pada akhirnya melaluicAMP terjadi proses CREB dengan protein padaproses aktif lebih lanjut terjadi citric acid cycle(CAC) dan akhirnya terjadi pelepasan UCP-1sehingga proses metabolisme menjadi meningkatdalam sel. Observasi secara alami menyebutkansuatu mata rantai antara metabolisme lipid dan

perilaku oskilatori glikolitik yang dapat menyarankansuatu kerangka baru untuk melihat imbangan yangdinamis antara ekspresi pelepasan protein danpenggabungan dalam mitokondria (Edwards et al.2003).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Conklin etal. (2002) terhadap efek nikotin-kotinin pada kelenjarparakrina otot rangka terbukti menaikkan kadarVEGF mRNA endothelial dan menaikkan kadarprotein dalam darah serta merangsang nafsu makanbila di induksi selama lebih dari 10 minggu (70%).Namun induksi nikotin dengan dosis optimal dapatmenurunkan lecithin dan terjadi peninggian depositkolesterol dan platelet CO kemudian mengakibatkanhipoksia (200-250 x lebih afinitas terhadap Hb),kemudian terjadi pelepasan NE menginduksi proteinkinase A (PKA) dan CREB-protein serta menginduksiekspresi UCP-1 melalui influk proton H+ Ekspresiprotein (UCPs) mitokondria pada jaringan adiposaotot rangka adalah suatu yang unik dari komponenspesifik sel mamalia. Pada DNA komplementer tikusbesar dan tikus kecil, pelepasan UCPs diisolasi padabeberapa laboratorium (Rousset et al. 2004), cDNAdigunakan untuk menentukan sekuens dari UCP tikus

a) ID 7742 ID C1237 ID C7220 ID C7221

b) ID 9458 ID 9677 ID C0844 ID C7236

c) ID T2858 ID C1233 ID C0629 ID 4674

Gambar 2. Floresensi antibodi terhadap UCP-1 dari jaringan adiposa coklat pada individu kelompok a)

pakan A, b) pakan B, dan c) pakan C

besar dan untuk memonitor perubahan padaUCPmRNA level di berbagai keadaan fisiologik,patologik, dan farmakologik. Suatu kontroversimengenai makna yang fisiologik dari jaringan adiposapada manusia dan kontribusi yang mungkin terjadipada resistensi obesitas tetap ada, akan tetapisejumlah besar bukti, menunjukkan bahwa jaringanyang ada pada bayi dan anak, juga pada dewasa mudaterdapat situasi nonpatologik dan hanya beberapa padakeadaan patologik tertentu. Pada penelitian iniseluruh MEP obes pada ketiga kelompok perlakuanmemperlihatkan ekspresi dengan peningkatan proton-proton yang dilepaskan melalui UCP-1 pada jaringanadiposit coklat yang bertanggung jawab untuknonshivering thermogenesis. Mekanisme yangditemukan pada manusia usia muda dalammemelihara suhu tubuh, akan tetapi, pada orangdewasa kontribusi dari UCP-1 dimediasithermogenesis dan peran pada regulasi bobot badan,sebab yang kontroversial jaringan adiposa coklatsecara relatif langka (Fabian-Fine et al. 2004). Padamanusia, otot skeletal adalah jaringan yang palingpenting untuk adaptif thermogenesis, karena UCP-1tidak terdapat pada otot skeletal, ekspresi UCPs laindiharapkan untuk eksis. Kedepan untuk hal-hal yangdemikian akan diperlukan intervensi nikotin dalamjumlah yang kecil untuk mengekspresikan UCP-1 olehtubuh.

Simpulan dan Saran

Simpulan1.Penggunaan nikotin dosis rendah memberi pengaruh

interaksi transeluler dengan hormon endokrin baiksentral maupun perifer dalam mengatur energitubuh.

2.Penggunaan nikotin dapat meningkatkan nilaikolesterol LDL melalui peningkatan laju removalchylomicron trigliserida dalam plasma, namun hasilpenelitian ini secara statistik tidak bermakna.

3. Aktivasi motorik non-shivering thermogenesisdapat mengurangi proses aterogenesis.

Saran1.Penelitian lanjutan pengaruh nikotin pada reseptor

ACh-nicotine area ventromedial nucleushypothalamus (VMN) yang memberikan efekpenurunan bobot badan, dalam jangka waktutertentu.

2. Disarankan penggantian No Tobacco Day menjadiNo Cigarette Day, karena yang bermasalah bukanpada tembakau, tetapi pada pemanfaatan nikotin.

Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada DewiApri Astuti, I Nengah Budiarsa, dan PT. IndoAnilabdalam dukungan penelitian ini.

Daftar Pustaka

Cannon B, Nedergaard J. 2006. Brown adiposetissue: function and physiological significance.Phys. Rev. 84:277-359

Conklin BS, Zhao W, Zhong DS, Chen C. 2002.Nicotine and cotinine up-regulate vascularendothelial growth factor expression in endothelialcells. Am. J. Pathol. 160(2):413-8.

Edwards JG, Kaminski PM, Ungvari Z, CsiszarA. 2003. Increased Superoxide Production inCoronary arteries in HyperhomocysteinemiaRole of Tumor Necrosis Factor-a, NAD(P)HOxidase and Inducible Nitrit Oxidase Synthase.Arterioscler .Tromb. Vasc .Biol. 23:418-424

Fabian-Fine R, Skehel P, Errington ML, DaviesHA, Sher E, Stewart MG, Fine A. 2001.Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinicacetylcholine receptor subunit in rathippocampus. J. Neurosci.21:7993–8003

Horimoto M, Resnick MB. 2002. Expression OfUncoupling Protein 2 in Human Colon Cancer.Clin. Cancer. Res. 10:6203-6207

Jia H, Lubetkin EI. 2005. The impact of obesityon health-related quality-of-life in the generaladult US population. J. Public. Health.(oxf)27:156–164

Kamanna VS, Vo A, Kashyap ML. 2008. Nicotinicacid: recent developments. Curr. Opin. Cardiol.23(4): 393-8.

Rousset S, Alves-Guerra M, Mozo J, MirouxB, Cassard-Doulcier A, Bouillaud F,Ricquier D. 2004. The Biology of MitochondrialUncoupling Protein. Diabetes. 53: S130 - S135.

Yamasaki H, Sasaki H. 2006. Uncoupling Protein2 Promoter Polymorphism – 866G/A AffectsPeripheral Nerve Dysfunction In Japanese Type2 Diabetics Patients. American DiabetesAssociation. 29:

Zakariah S. 2010. Analisis Hematologi, NilaiKecernaan dan Tingkah Laku Monyet EkorPanjang (Macaca fascicularis) Jantan Obesyang Diintervensi Nikotin. [Tesis]. Sekolah PascaSarjana IPB. Bogor.

Warongan et al., Intervensi Nikotin terhadap Ekspresi LDL (Low Density Lipoprotein) 15