RCSB
PDB
Progr.
NMR
RCSB PDB
NMR biomakromolekul
Typy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR
● proteiny a peptidy
– rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul
● nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy
– omezení malou rozmanitostí chemického složení
● polysacharidy a oligosacharidy
– omezení malou rozmanitostí chemického složení
● kombinace výše uvedených
NMR Proteinů
• α
•
•
•
•
•
•
• ř
•
•
Ala Asp Asn Arg Cys Glu Gln Gly His Ile
Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
Stavba a struktura proteinů
+
Ala1 Ala2 Ala1–Ala2 H2O
+
Vznik peptidové vazby:
Struktura proteinů
helikální struktura
(α-helix)
extendovaná
struktura (β-sheet)
náhodné klubko
(random coil)
Struktura proteinů U proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní
struktura.
● Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve
směru od N k C konci.
● Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku.
Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovaná
struktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb.
● Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu.
● Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.
Využívaná jádra v biomakromolekulách
+ vysoké přirozené zastoupení
+ vysoká citlivost (1,00)
− malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)
+ velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm)
− nízké přirozené zastoupení (1,11 %)
− nízká citlivost (1,76.10−4); po 100% isotopovém obohacení 1,59.10−2
• střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm)
− nízké přirozené zastoupení (0,37 %)
− nízká citlivost (3,85.10−6); po 100% isotopovém obohacení 1,04.10−3
• speciální účely
1H
13C
15N
2H
Zdroje Proteinů
• Původní organismus • + přirozená forma včetně všech modifikací • - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy,
složitá izolace,…. • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) • + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení • - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců • Chemická syntéza • + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny • - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se
správným sbalením proteinu • In-vitro translace • + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení • - drahé, posttranslační modifikace
Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR ● měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností
prostředí
● sledování průběhu biochemických dějů
● vysoce selektivní odezva na úrovni atomů
Čím jsme omezeni:
● velikost molekuly (ovlivnění T2)
– do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA]
□ lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů
– do 20 kDa [< 180 AA]
□ nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N
– do ~100 kDa
□ 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)
– větší proteiny
□ přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura
● koncentrace vzorku
– alespoň 0,2 mM
● dlouhodobá stabilita vzorku
– několik týdnů
Vzorek proteinu pro NMR měření ● nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2–
0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe)
– používá se filtrace přes membrány s mikropóry
(protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné
rozpuštění
● úprava pH pufrem (pH typicky 4–8)
– vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu
amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu
signálů
● přidání redukčních činidel (R–SH)
– zabránění oxidace cysteinů a následného
vysrážení vzorku
● přidání 5–10 % D2O
– referenční jádro pro spektrometr (lock) roztok vzorku
250–300 µl
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorku naměření NMR
spekter
přiřazení signálů
atomům v molekule
přiřazení NMR
parametrů
pro výpočet
struktury
obecné informace o
molekule (primární
struktura, S–S vazby,...) výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnocení
kvality struktur
oprava přiřazení
výpočet
souboru struktur
validace struktur
✓
1. publikované NMR spektrum proteinu
● spektrum proteinu RNasy A, měřeno
40 MHz spektrometrem, 1957
● 40 MHz CW spektrometr
Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood
J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.
První 1GHz NMR spektrometr ● instalován firmou Bruker v Centre
de RMN à Très Hauts Champs,
Lyon, France
1H NMR spektrum proteinu měřené tímto
spektrometrem
Nutný krok – potlačení signálu vody ● jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O z těchto důvodů:
– jde o fysiologické prostředí
– při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium
● tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O, protože její signál je 104–
105krát intensivnější než signály měřené látky
● spektrum proteinu bez potlačení H2O:
Potlačení signálu H2O – metoda presaturace
selektivní CW-ozařování H2O
během relaxační periody
π/2
Δ
zbytkový signál
H2O
1H NMR spektrum proteinu po presaturaci vody
● spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole
Potlačení signálu H2O – metoda WATERGATE
(π/2)-y
1
H
Gz
Δ
πy (π/2)
x
sel. sel. Δ
(π/2)-y
zbytkový signál
H2O
1H NMR spektrum proteinu po WATERGATE excitační
profil
selektivního
π/2 pulsu
● charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin
– kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)
H alifatické
HN peptidické
H aromatické
HN
postranní Hα
CH3
Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu
AA3 AA2 AA1
C C N C
N C
C
O H
H H R2
O
H R1
H R3
N
H
C
O
●1H spinové systémy (3J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami
● 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a
● k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N
Vícedimensionální NMR experimenty
● rozlišení informací obsažených v 1D spektrech
– korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N
– propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin
– pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení
http://www.protein-nmr.org.uk
1H
(ppm)
1H
(ppm)
15N
(ppm
)
15N
(ppm
) 1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu
● ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních
strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, …
nesbalený protein sbalený protein
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorku naměření NMR
spekter
přiřazení signálů
atomům v molekule
přiřazení NMR
parametrů
pro výpočet
struktury
obecné informace o
molekule (primární
struktura, S–S vazby,...) výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnocení
kvality struktur
oprava přiřazení
výpočet
souboru struktur
validace struktur
✓ ✓
Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí
● přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule
● postup:
1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO)
2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)
● je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu
C C N C
N C
C
O H
H H R2
O
H
R1
H
R3
N
H
C O
CO
Cα
O
Hα Cβ
N
HN
Hβ
označení jednotlivých
atomů v
aminokyselině
Přiřazení resonancí – atomy hlavního řetězce
● pro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních
třídimensionálních korelačních experimentů
– přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí (1J, 2J)
● základní experimenty (je mnoho dalších kombinací):
C C
N C
C
O H
H C
O
H C
N
H
H
H
HNCA
C C
N C
C
O H
H C
O
H
C
N
H
H
H
HN(CO)CA
C C
N C
C
O H
H C O
H
C
N
H
H
H
CBCANH
C C
N C
C
O H
H C
O
H
C
N
H
H
H
CBCA(CO)NH
modrá: jádra excitovaná i detekovaná
zelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu)
červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace
Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA
13Cα
13C' 15N
13Cα
13C'
15N
O
O 1H
1H 13Cβ
13Cγ
1H
1H 13Cβ
13Cγ
90
11
15
7
55 140
55
35
i − 1 i
< 1
13Cα
13C' 15N
13Cα
13C'
15N
O
O 1H
1H 13Cβ
13Cγ
1H
1H 13Cβ
13Cγ
90
11
15
7
55 140
55
35
i − 1 i
< 1
interakční konstanty J v
Hz
HN(CO)CA
– po excitaci HiN je magnetizace je
přenesena na Ni (1JHN,N), dále na
Ci−1 (1JN,C ) a na Ci−1α (1JC ,Cα)
– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα
– každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(Hi
N), ω(Ni), ω(Cα
i−1)}
HNCA
– po excitaci HiN je magnetizace
přenesena na Ni (1JHN,N) a dále
současně na Ciα (1JN,Cα) a Cα
i−1 (2JN,Cα)
– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα
– každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(Hi
N), ω(Ni), ω(Ci
α)} a {ω(HiN), ω(Ni),
ω(Cαi−1)}
Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA
● 2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých
amidických N
HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA
někdy chybí pík… H
N
C
● různé implementace experimentů TOCSY a COSY
Přiřazení signálů postranních řetězců
Cα
C'
N
Cα
C'
N
O
O H
H Cβ
Cγ
H
H
Cβ
Cγ
H H
H
H H
H
HC(CCO)NH-TOCSY H(C)CH-COSY
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorku naměření NMR
spekter
přiřazení signálů
atomům v molekule
přiřazení NMR
parametrů
pro výpočet
struktury
obecné informace o
molekule (primární
struktura, S–S vazby,...) výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnocení
kvality struktur
oprava přiřazení
výpočet
souboru struktur
validace struktur
✓ ✓
✓
Interpretace NMR spekter – přiřazení strukturních parametrů
NOE ≡ meziatomová vzdálenost
skalární interakční konstanta ≡ dihedrální úhel
chemický posun ≡ chemické okolí
residuální dipolární interakce ≡ vzájemná orientace vazeb
vodíkové vazby ≡ detailní lokální struktura
Nukleární Overhauserův efekt (NOE) ● přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace
● rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1H, σIS:
γH ... gyromagnetická konstanta 1H
τc ... korelační čas molekuly
ω ... Larmorova frekvence
rIS ... vzdálenost interagujících jader
H H
dosah interakce do 5–6 Å
●NOE je hlavní zdroj informace o struktuře
proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE
interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím
konkrétních vodíkových atomů v molekule.
●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří
charakteristické sítě NOE kontaktů.
●Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků,
ale rozdělí se do pásem podle intenzity.
●Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å.
X-editované NOESY experimenty
● excitace pouze 1H atomů vázaných
na atomy 15N nebo 13C, přenos
magnetizace vlivem NOE na blízké
atomy 1H, detekce
1HN
1
H
řez 3D spektrem v rovině 1HN–1H na
pozici 122 ppm v 15N doméně = signál
Tyr66
Skalární interakce – zjištění dihedrálních úhlů
● peptidová vazba tvoří rovinu definovanou
atomy O–Cα–N–HN
● vzájemná orientace dvou sousedních
peptidových vazeb, a tedy i konformace
páteře proteinu je určena dihedrálními úhly
φ a ψ
– φ (C –N–Cα–C ) a ψ (N–Cα–C –N)
● Karplusova rovnice
– závislost velikosti interakce 3J na
dihedrálním úhlu (θ)
– konstanty A a B zjištěny pro různé
kombinace interagujících jader
● problém: jedné hodnotě 3J mohou
odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního
úhlu
N
C
'
C
N
C
'
3J
[Hz]
10
8
6
4
2
0 -120 60 0 120
H–N–Cα–H
CO–N–Cα–H
H–N–Cα–Cβ H–N–Cα–CO
θ [deg]
Chemický posun ● chemický posun některých jader je
charakteristicky závislý na
sekundární struktuře
přiřazení resonancí
hlavního řetězce (Hα, Cα a C')
výpočet indexů chemického posunu (CSI)
odhad sekundární struktury podle
lokální hustoty CSI
náhodné klubko
δ(Hα)
α-helix β-sheet
klesá roste
chemický posun
Histogram indexu chemického
posunu jader Hα, Cα a C'
C N
−1
0 +1
sekvence proteinu
helix I
helix II
helix III
helix IV
Residuální dipolární interakce (RDC) ● přímá dipól–dipólová interakce dvou jader
– v isotropním roztoku nedetekovatelná
– pozorovatelná v neisotropním prostředí u
molekul částečně orientovaných vůči
magnetickému poli
● tvorba neisotropního prostředí
– kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny
(virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý
polyakrylamidový gel
– samotné vnější magnetické pole
● příspěvek ke skalární interakci ⇒ snadná
měřitelnost
● velikost interakce DIS závisí na orientaci vazby
vůči směru B0
I
S
rIS
Θ Θ...úhel mezi
vektorem I–S a B0
fosfolipidové bicely
orientované v magnetickém
poli
Vodíkové vazby ● identifikace:
– výměnné experimenty H ↔ D
– teplotní závislosti chemických posunů
● charakterizace:
– měření skalární interakce (J) přes H-vazbu
● stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR
příprava vzorku naměření NMR
spekter
přiřazení signálů
atomům v molekule
přiřazení NMR
parametrů
pro výpočet
struktury
obecné informace o
molekule (primární
struktura, S–S vazby,...) výpočet souboru
počátečních struktur
vyhodnocení
kvality struktur
oprava přiřazení
výpočet
souboru struktur
validace struktur
✓ ✓
✓
✓
Přiřazení resonancí
a) páteř
b) postranní řetězce
Strukturní omezení z NMR parametrů
✔vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a
interresiduální)
✔dihedrální úhly ze skalárních interakčních
konstant
✔relativní orientace vazeb z dipolárních
kaplingů
✔případně další omezení
Výpočet trojrozměrné struktury
molekulová mechanika
+ simulované žíhání
Identifikace prvků
sekundární
struktury
Výpočet struktury proteinu ● molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy
pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)
energetická plocha v závislosti na
dvou dihedrálních úhlech v
disacharidu
●použití všech dostupných experimentálních
omezení, minimalizace celkové energie systému
–simulované žíhání: molekula se ohřeje na
vysokou teplotu (103 K) a nechá se postupně
chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá
nová energie systému. Cílem je překonat lokální
energetická minima a najít (nejlépe) to globální.
–přidáme nové energetické členy pro
experimentální omezení: čím bližší bude shoda
vypočítané struktury s experimentálními údaji,
tím nižší bude celková energie
–například pro NOE:
V případě proteinu se jedná o plochu
závislou na n proměnných (n je počet
optimalizovaných souřadnich/úhlů).
Vypočítané struktury ● obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi
– Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale
o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale
jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur,
které by se ovšem měly lišit jen nepatrně.
– Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem
experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.
● struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru
soubor struktur vybraná reprezentativní
struktura RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)
Interakce proteinu s ligandem • Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace
• Interaguje specificky?
• Kde interaguje?
• Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)
• Farmaceutický průmysl
• Proteomické studie
• Metody pro měření interakce pomocí NMR
• Sledování změn chemických posunů
• Intermolekulární NOE
• Transferred NOESY
• Mapování H-D chemické výměny NH skupin
• Mapování pomocí paramagnetické látky
• Sledování změny dynamiky proteinu
Změny chemických posunů • Titrace proteinu ligandem
• Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji HN)
• Interakční povrch
• Disociační konstanta
STD – Saturation transfer difference • Interakce protein-malá molekula
• Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce
• Přebytek ligandu
• Zjistíme, která část ligandu interaguje
• Odhad KD
STD – Saturation transfer difference
Transferred NOESY
• Princip: informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické
• výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována
• Uspořádání: „malý“ ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký substrát (Mw > 40 kDa) neviditelný pro NMR
• Podmínka vhodná kinetika systému 10-8 > Kd > 10-3 M-1
• Využití: - struktura ligandu
• - nepřímo struktura vazebného místa
• - způsob vazby
H
H
H
H
r < 5 Å
r > 5 Å
chemická
výměna
NOE
•Peptid antikolagulační kaskády •Inhibitor trombinu
Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem
• 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu
NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu
NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu
Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5C v komplexu s thrombinem
Complex between thrombin and TM52+5C Struktura komplexu thrombinu a ligandu TM52+5C
Intermolekulární NOE
• NOE efekt mezi dvěma molekulami
• U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE
• Rozdílné izotopové značení
• 13C filtrované 13C editované NOESY
• Vychází z 13C editovaného NOESY
• Obsahuje filtr, na NOE mezi 1H na 13C
• Projeví se NOE jen mezi 1H na 13C a 1H na 12C
Neznačený ligand
protein (13C značený)
13C filtrované 13C editované NOESY
13C filtrované 13C editované NOESY
13C editované NOESY 13C filtrované 13C editované NOESY
1H
1H
1H
Studium dynamického chování molekul ● molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách
– různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují
● funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě
– regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace
● vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů – možnost
charakterizace
časové škály pohybů
– různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních
pohybů
ps ns μs ms s > s
relaxace R1, R2, het. NOE
relaxace R1ρ, CPMG
analýza tvaru signálu
saturation transfer, NOESY
výměna H/D
pohyb N–H rotace CH3
pohyb smyček
pohyb domén
transport, katalýza, další biologické děje... příklady
jevů
metody studia
lokální pohyby globální pohyby
