22
Metody fragmentace DNA
Z hlediska metod molekulární biologie jsou významné dva typy
fragmentace DNA – sekvenčně specifická a nespecifická. První typ
je zajišťován výhradně pomocí enzymů, tzv. restrikčních endonukleáz (zkráceně restriktáz). Nespecifická fragmentace bývá enzymová nebo mechanická.
Z hlediska metod molekulární biologie jsou významné dva typy
fragmentace DNA – sekvenčně specifická a nespecifická. První typ
je zajišťován výhradně pomocí enzymů, tzv. restrikčních endonukleáz (zkráceně restriktáz). Nespecifická fragmentace bývá enzymová nebo mechanická.
Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. modifikačních systémů, kterými jsou vybaveny hlavně některé druhy prokaryotických buněk. Každý systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit. První aktivita, restrikční, katalyzuje štěpení dvojřetězcové DNA. Druhá, metylační, modifikuje sekvenci rozeznávanou restriktázou a chrání ji proti štěpení. Modifikační aktivita chrání před degradací buněčnou DNA, zatímco cizorodá DNA, která vstoupí do buňky, může být degradována dříve než jsou metylázou rozeznávané sekvence modifikovány.Z hlediska genomických a diagnostických metod jsou využívány zejména restriktázy typu II. Tyto enzymy nenesou modifikační aktivitu (je zajišťována jiným enzymem), nevyžadují ATP a štěpí dsDNA v oblasti rozeznávaného místa (tzv. restrikčního místa anebo v jeho blízkosti). Rozeznávané sekvence sestávají obvykle ze 4 až 6 bp a jejich schematický záznam se vyznačuje dvojčetnou osou symetrie.
Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. modifikačních systémů, kterými jsou vybaveny hlavně některé druhy prokaryotických buněk. Každý systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit. První aktivita, restrikční, katalyzuje štěpení dvojřetězcové DNA. Druhá, metylační, modifikuje sekvenci rozeznávanou restriktázou a chrání ji proti štěpení. Modifikační aktivita chrání před degradací buněčnou DNA, zatímco cizorodá DNA, která vstoupí do buňky, může být degradována dříve než jsou metylázou rozeznávané sekvence modifikovány.Z hlediska genomických a diagnostických metod jsou využívány zejména restriktázy typu II. Tyto enzymy nenesou modifikační aktivitu (je zajišťována jiným enzymem), nevyžadují ATP a štěpí dsDNA v oblasti rozeznávaného místa (tzv. restrikčního místa anebo v jeho blízkosti). Rozeznávané sekvence sestávají obvykle ze 4 až 6 bp a jejich schematický záznam se vyznačuje dvojčetnou osou symetrie.
Co jsou restrikční endonukleázy a kde se vzaly???Co jsou restrikční endonukleázy a kde se vzaly???
Restrikčně-modifikační systém bakterií
19197070 (Smith & Wilcox) izolace první restrikční endonukleasy - HindIII19197070 (Smith & Wilcox) izolace první restrikční endonukleasy - HindIII
- součástí RM systémů typu II u bakterií- rozeznávají a štěpí palindromatické sekvence DNA
5' A C T G T A C T A T G G A T C C A A T A C G T C A G T C 3' 3 ' T G A C A T G A T A C C T A G G T T A T G C A G T C A G 5'
Restrikční endonukleázy, RE (restriktázy)Restrikční endonukleázy, RE (restriktázy)
5' A C T G T A C T A T G G A T C C A A T A C G T C A G T C 3' 3 ' T G A C A T G A T A C C T A G G T T A T G C A G T C A G 5'
Bacillus amyloliquefaciens H – BamH I
Palidromatickásekvence
V součastnosti je známo cca 3 000 restriktázV součastnosti je známo cca 3 000 restriktáz
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
G/GATCC
GGTAC/C
CCC/GGG
5´přesahující konec
3´přesahující konec
tupé konce
Star activity aneb hvězdičková aktivita *Star activity aneb hvězdičková aktivita *
Hvězdičková aktivita restrikčních endonukleáz j jev, který byl zaznamenán u řady enzymů této skupiny. Projevuje se zejména za extrémních podmínek výrazně odchylných od podmínek optimálních u normálních nepoškozených molekul enzymů, anebo u molekul pozměněných (po projití záruční doby, anebo v důsledku nevhodného skladování).
Hvězdičková aktivita se projevuje zejména za těchto okolností:1. Při vysoké koncentraci glycerolu2. Při vysoké koncentraci enzymu3. Při nízkých iontových silách4. Při vysokých hodnotách pH5. V přítomnosti některých organických látek (DMSO, etanol, etylenglykol, dimetlyformamid)
Hvězdičková aktivita restrikčních endonukleáz j jev, který byl zaznamenán u řady enzymů této skupiny. Projevuje se zejména za extrémních podmínek výrazně odchylných od podmínek optimálních u normálních nepoškozených molekul enzymů, anebo u molekul pozměněných (po projití záruční doby, anebo v důsledku nevhodného skladování).
Hvězdičková aktivita se projevuje zejména za těchto okolností:1. Při vysoké koncentraci glycerolu2. Při vysoké koncentraci enzymu3. Při nízkých iontových silách4. Při vysokých hodnotách pH5. V přítomnosti některých organických látek (DMSO, etanol, etylenglykol, dimetlyformamid)
!Pozor!
Příklad: Eco RI*Příklad: Eco RI*
Restrikční endonukleázy (restriktázy)Endonukleáza je enzym štěpící nukleovou kyselinu uvnitř řetězce dsDNA. Restrikční endonukleáza neštěpí DNA kdekoliv, ale rozpoznává určitou sekvenci bazí. Tak např. známý enzym Eco RI štěpí sekvenci G+AATTC v místě křížku. Z měna jediné báze vede ke zrušení cílového místa, DNA zde nebude štěpena. Napíšeme cílovou sekvenci pro Eco RI ve dvouřetězcové formě: G+AATTC CTTAA+G Vidíme, že sekvence je středově symetrická (tzv. palindrom: zleva čteme GAATTC, zprava GAATTC). Tato symetrie umožňuje rozštěpení druhého řetězce DNA ve vzdálenosti pouhých čtyř bazí od protilehlého zlomu. Tak dojde k úplnému přestřižení dvoušroubovice DNA. Cílové místo pro restriktázu rozpoznávající šestici nukleotidů se nachází podle počtu pravděpodobnosti průměrně jednou ve 4096 bazích - (1/4)6 = 1/4096. Ve skutečnosti mohou být dvě cílová místa vzdálena 10 bp (párů bazí) i 10 000 bp. Rozložení cílových míst pro soubor restrikčních enzymů znázorňují restrikční mapy. Je zřejmé, že dvě molekuly DNA s totožnou sekvencí bazí budou mít i totožnou restrikční mapu. Naprostá shoda v restrikční mapě však neznamená zcela shodnou sekvenci obou DNA. K záměně bazí mohlo dojít v oblasti, kde není žádné cílové místo. Na základě restrikčních map lze učinit závěry o homologii srovnávaných sekvencí DNA. Čím více restrikčních enzymů k mapování použijeme, tím bude mapa podrobnější a tím přesnější bude i naše stanovení homologie srovnávaných sekvencí. V současné době je k dispozici asi 400 různých restrikčních enzymů rozpoznávajících přes 100 různých cílových míst. Některé restriktázy rozpoznávají totéž cílové místo – těm říkáme izoschizomery. Mohou se lišit v hodnotách optimálních reakčních podmínek (pH, teplota, koncentrace Mg apod.) i ve stabilitě své aktivity. Restrikční enzymy jsou produkovány bakteriemi, kterým slouží k ochraně před bakteriofágy. Rozštípou kteroukoli cizorodou DNA, tedy i DNA fága. Svou vlastní DNA si bakterie chrání metylací některých bazí v cílové sekvenci. U eukaryot nebyly typické restrikční enzymy nalezeny. Název restriktáz je odvozen z rodového a druhového jména bakterie, u které byl objeven. Tak např. Eco RI byl nalezen u Escherichia coli, Bgl I a Bgl II u Bacillus globigii apod. Tyto restrikční enzymy rozpoznávají šestici bazí, v anglické literatuře se jim říká „six cutters“. Druhou velkou skupinu tvoří „four cutters“, jsou to restriktázy rozpoznávající cílovou sekvenci dlouhou čtyři báze.
Restrikční endonukleázy (restriktázy)Endonukleáza je enzym štěpící nukleovou kyselinu uvnitř řetězce dsDNA. Restrikční endonukleáza neštěpí DNA kdekoliv, ale rozpoznává určitou sekvenci bazí. Tak např. známý enzym Eco RI štěpí sekvenci G+AATTC v místě křížku. Z měna jediné báze vede ke zrušení cílového místa, DNA zde nebude štěpena. Napíšeme cílovou sekvenci pro Eco RI ve dvouřetězcové formě: G+AATTC CTTAA+G Vidíme, že sekvence je středově symetrická (tzv. palindrom: zleva čteme GAATTC, zprava GAATTC). Tato symetrie umožňuje rozštěpení druhého řetězce DNA ve vzdálenosti pouhých čtyř bazí od protilehlého zlomu. Tak dojde k úplnému přestřižení dvoušroubovice DNA. Cílové místo pro restriktázu rozpoznávající šestici nukleotidů se nachází podle počtu pravděpodobnosti průměrně jednou ve 4096 bazích - (1/4)6 = 1/4096. Ve skutečnosti mohou být dvě cílová místa vzdálena 10 bp (párů bazí) i 10 000 bp. Rozložení cílových míst pro soubor restrikčních enzymů znázorňují restrikční mapy. Je zřejmé, že dvě molekuly DNA s totožnou sekvencí bazí budou mít i totožnou restrikční mapu. Naprostá shoda v restrikční mapě však neznamená zcela shodnou sekvenci obou DNA. K záměně bazí mohlo dojít v oblasti, kde není žádné cílové místo. Na základě restrikčních map lze učinit závěry o homologii srovnávaných sekvencí DNA. Čím více restrikčních enzymů k mapování použijeme, tím bude mapa podrobnější a tím přesnější bude i naše stanovení homologie srovnávaných sekvencí. V současné době je k dispozici asi 400 různých restrikčních enzymů rozpoznávajících přes 100 různých cílových míst. Některé restriktázy rozpoznávají totéž cílové místo – těm říkáme izoschizomery. Mohou se lišit v hodnotách optimálních reakčních podmínek (pH, teplota, koncentrace Mg apod.) i ve stabilitě své aktivity. Restrikční enzymy jsou produkovány bakteriemi, kterým slouží k ochraně před bakteriofágy. Rozštípou kteroukoli cizorodou DNA, tedy i DNA fága. Svou vlastní DNA si bakterie chrání metylací některých bazí v cílové sekvenci. U eukaryot nebyly typické restrikční enzymy nalezeny. Název restriktáz je odvozen z rodového a druhového jména bakterie, u které byl objeven. Tak např. Eco RI byl nalezen u Escherichia coli, Bgl I a Bgl II u Bacillus globigii apod. Tyto restrikční enzymy rozpoznávají šestici bazí, v anglické literatuře se jim říká „six cutters“. Druhou velkou skupinu tvoří „four cutters“, jsou to restriktázy rozpoznávající cílovou sekvenci dlouhou čtyři báze.
A jak restriktázy využívá rostlinolékařská diagnostika???
Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), polymorfizmus délky restrikčních fragmentů,kombinace se Southern blotem
A jak restriktázy využívá rostlinolékařská diagnostika???
Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), polymorfizmus délky restrikčních fragmentů,kombinace se Southern blotem
RFLP: pro a protiRFLP: pro a proti
• kodominantní markery• dobrá reprodukovatelnost• nutno předem charakterizovat všechny markery, t.j.
zpravidla je klonovat• jen málo genů vykazuje RFLP polymorfismus• drahé a rel. pomalé
• kodominantní markery• dobrá reprodukovatelnost• nutno předem charakterizovat všechny markery, t.j.
zpravidla je klonovat• jen málo genů vykazuje RFLP polymorfismus• drahé a rel. pomalé
Gelová elektroforéza definovaně štěpenégenomické DNA, pak navazuje Southern Blot Gelová elektroforéza definovaně štěpenégenomické DNA, pak navazuje Southern Blot
Další vybrané manipulace a úpravy vzniklých fragmentů DNA
Další vybrané manipulace a úpravy vzniklých fragmentů DNA
Klenowův fragment DNA polymerázy I
T4 DNA polymeráza
T7 DNA polymeráza
Terminální (deoxy)nukleotidyltransferáza
Alkalická fosfatáza
Polynukleotid kináza
DNázy
Klenowův fragment DNA polymerázy I
T4 DNA polymeráza
T7 DNA polymeráza
Terminální (deoxy)nukleotidyltransferáza
Alkalická fosfatáza
Polynukleotid kináza
DNázy
DNA polymeráza I z E. coliAktivity:5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza 5' -> 3' exonukleázu
Aktivity:5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza 5' -> 3' exonukleázu
Klenowův fragment DNA polymerázy IKlenowův fragment DNA polymerázy I
1. Doplňování 5´P přesahujících konců
značení 3-OH konce
5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza nemá 5' -> 3' exonukleázu, takženemůže označit oblasti utajenýchpřerušení
5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza nemá 5' -> 3' exonukleázu, takženemůže označit oblasti utajenýchpřerušení
Ale když nedáme do směsi prekurzory (dNTP), tak pouze odstraní 3-OH přesahující konec.
T4 DNA polymerázaT4 DNA polymeráza
T7 DNA polymeráza
- 5' -> 3' DNA polymeráza - 3' -> 5' exonukleáza (200x větší aktivita než Klenow)- nemá 5' -> 3' exonukleázu
- 5' -> 3' DNA polymeráza - 3' -> 5' exonukleáza- nemá 5' -> 3' exonukleázu- velká procesivita – po odstranění 3' -> 5' exonukleázy
se využívá pro sekvenování
Vybrané termostabilní DNA dependentní DNA polymerasy
Termostabilní polymerasy se využívají zejména v souvislosti s PCR, proto se v odstavci nevýhody a výhody použití vždy zvažuje právě uplatnění v rámci této metody.
Taq polymerasa byla původně izolována z termofilní eubakterie Thermus aquaticus. Dnes se získává jako rekombinantní enzym z E. coli. Je to vysoce procesivní polymerasa (průměrně zařadí 50 nukleotidů než se odpojí od templátového řetězce), má 5´ 3´ exonukleasovou aktivitu, nemá 3´ 5´ exonukleasovou aktivitu. Inkorporuje dUTP a dUTP, modifikované např. digoxigeninem, biotinem či fluoresceinem. Má i slabou terminální deoxynukleotidyltransferasovou aktivitu.
Výhody a nevýhody použití: Vysoké výtěžky do 2 Kpb, prosadí se v kompetici s dalšími polymerasami, má značnou frekvenci chyb (10-5/bp), která se ještě zvyšuje při vyšší koncentraci dNTP, Mg++ a v přítomnosti Mn++, produkuje A přesahy (vhodné pro TA klonování, nevhodné pro spojování natupo), nemůže pokračovat v polymeraci, když zařadí některé nekomplementární nukleotidy, používá se pro standardní PCR, značení a v kombinaci s dalšími polymerasami pro PCR dlouhých úseků až do 35 Kbp.
Pwo polymerasa původně z termofilní bakterie Pyrococcus woesei, nyní rekombinantní enzym z E. coli, nemá 5´ 3´ exonukleasovou aktivitu, má 3´ 5´ exonukleasovou aktivitu, nemá Tdt aktivitu. Zařazuje i modifikované dUTP, procesivitu má nižší než Taq (20-30 bp), délku produktů do 3 Kbp a nízkou frekvenci chyb (10-6/bp).
Výhody a nevýhody použití: Vysoká přesnost, snížená procesivita, vysoká stabilita, netvoří A-přesahy, používá se v kombinaci s ostatními polymerasami pro PCR dlouhých úseků.
Tth polymerasa z eubakterie Thermus thermophilus sp. je vysoce procesivní, nemá
3´ 5´ exonukleasovou aktivitu, má výraznou reverzní transkriptasovou aktivitu, mnohem větší než Taq a DNA polymerasa I, zařazuje i modifikované dUTP, má slabou 5´ 3´ exonukleasovou aktivitu a Tdt aktivitu, produkuje polynukleotidy do 3 Kb na DNA-templátě a do 1 Kbp na RNA-templátě.
Výhody a nevýhody použití: Vhodná pro RT PCR, produkuje A-přesahy.
„Hot Start“ Taq polymerasa je modifikovaná rekombinantní Taq polymerasa, která je neaktivní do 75°C, je aktivovatelná při 95°C, je vhodná pro techniky horkého startu. Jinak vlastnosti obdobné Taq polymerase.
Terminální nukleotidyltransferázaTerminální nukleotidyltransferáza
Alkalická fosfatázaAlkalická fosfatáza
• Bacterial alkaline phosphatase (BAP) • Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) • Shrimp alkaline phosphatase
Polynukleotid kinázaPolynukleotid kináza
Praktické využití:
•fosforylace linkerů a adapterů + PCR•radioaktivní značení oligonukleotidů
LigázyLigázy
T4 DNA ligáza využívá ATP
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif
