VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, v.v.i.

Metodika molekulární detekce virů peckovin

pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR

Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu

Jana Jarošová, Jaroslav Polák & Jiban Kumar

Praha, 2008

2

Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a

multiplex-RT-PCR

Ing. Jana Jarošová

Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc.

Ing. Jiban Kumar, PhD. *

Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i.

odbor rostlinolékařství, oddělení virologie

Drnovská 507, 161 06 Praha-Ruzyně

*korespondujicí autor: e-mail: jiban@vurv.cz

Tato práce byla financována z projektu QG0123.

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008

ISBN: 978-80-87011-86-7

3

Anotace (česky)

Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR

Předkládaná metodika detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR zahrnuje

takové metodické přístupy, které umožňují diagnostikovat tři nejběžnější viry peckovin (virus

šarky švestky - PPV, virus zakrslosti slivoně - PDV, virus nekrotické kroužkovitosti slivoně -

PNRSV) v jedné reakci, čímž snižují ekonomické i časové nároky potřebné pro detekci.

Podstatou zkoušky je zjistit ve vzorku RNA přítomnost nukleotidových sekvencí specifických

pro PPV, PDV a PNRSV. Metodika je využitelná pro potřeby orgánů státní správy při

provádění monitoringu viróz na peckovinách i pro zprostředkované využití soukromými

pěstiteli. Metodika zahrnuje přesný postup od odběru vzorku až po vyhodnocení výsledků.

Anotace (anglicky)

Methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex

RT-PCR

The methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT-

PCR includes approaches, which enable to detect the most common stone fruit viruses (Plum

pox virus - PPV, Prune dwarf virus - PDV, and Prunus necrotic ringspot virus - PNRSV) in

one reaction and thus reduces time and money requirements. The essence of the test is to

detect presence of RNA specific for each virus in the sample. The methodology is usable for

state administration bodies when monitoring stone fruit viruses’ occurrence as well as

mediated for purposes of private growers. The methodology includes exact procedure

description, from collecting samples to results evaluation.

Oponenti:

Ing. Gabriela Červená, Ph.D.

Státní rostlinolékařská správa

Šlechtitelů 23/773, 779 00 Olomouc

Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CsC.

ČZU, FAPPZ, Katedra ochrany rostlin

Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol

Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu, MZe ČR pod č. j.:47968/08-18020 ze dne 30.12.2008.

4

Obsah Cíl ............................................................................................................................................................ 5

Úvod ........................................................................................................................................................ 5

Rozšíření virů peckovin v ČR ................................................................................................................. 6

Principy ochrany...................................................................................................................................... 7

Biologie a škodlivost virů peckovin ........................................................................................................ 7

Biologie vektorů PPV ............................................................................................................................ 11

Zjišťování výskytu ................................................................................................................................ 13

Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV .......................................................... 14

Odběr vzorku ..................................................................................................................................... 15

Izolace RNA ...................................................................................................................................... 15

One-step-RT-PCR ............................................................................................................................. 17

Two-step-RT-PCR............................................................................................................................. 19

Vizualizace PCR produktů ................................................................................................................ 20

Srovnání „novosti postupů“ ................................................................................................................... 21

Popis uplatnění metodiky ...................................................................................................................... 21

Seznam použité související literatury .................................................................................................... 21

Seznam publikací, které předcházely metodice ..................................................................................... 24

5

Cíl

Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě

současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti

slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV).

Úvod

Pěstování peckovin je důležitá součást zemědělství mírného a subtropického pásma,

z jak ekonomického, tak i kulturního hlediska. Peckoviny jsou důležitou skupina ovoce, z nějž

nejvýznamnějšími druhy jsou švestky (Prunus domestica), broskvoně (Prunus persica),

meruňky (Prunus armeniaca), třešně (Prunus avium) a višně (Prunus cerasus). Světová

produkce peckovin dosahuje přibližně 30 miliónů tun ročně, přičemž přes deset miliónů tun je

vyprodukováno v Evropě a 30 000 tun v České republice (FAOSTAT databáze). Existuje

mnoho virových původců chorob infikujících peckoviny. Nejzávažnější virovou chorobou je

bezesporu šarka švestky, způsobená virem šarky švestky-Plum pox virus (PPV). Způsobuje

významné ztráty na výnosech, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95%, a je široce

rozšířena ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky - Turecko, Egypt,

Sýrie, Indie (Simon et al., 1997), pravděpodobně i Čína, v Severní i Jižní Americe - Chile,

Argentina, USA a Kanada (Malinowski et al., 2006). PPV je přenášen velkým počtem mšic

necirkulativním, nepersistentním způsobem. PPV virulentní mšice může tudíž strom nakazit

jediným akvizičním sáním na zdroji infekce. Mezi nejzávažnější Ilarviry napadající peckoviny

patří virus zakrslosti slivoně - Prune dwarf virus a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně -

Prunus necrotic ringspot virus. Tyto viry, samotné nebo v kombinaci, mohou snížit výnos,

dozrávání plodů a růst stromů. Krom vegetativního přenosu jsou přenášeny i pylem a

semenem, což napomáhá jejich rozšíření (Saade et al., 2000). Všechny tyto viry mohou být

přítomny v pletivech stromů samostatně nebo v kombinacích. Vyšší rostliny jsou běžně

napadány několika viry současně, a mnoho chorob je způsobeno interakcí dvou nebo více

nezávislých virů (Pruss et al., 1997).

Ochrana peckovin proti virovým chorobám spočívá v získávání a produkci zdravého

množitelského materiálu, čehož se v Evropě dosahuje certifikačními programy, které

jednotlivé státy samostatně vypracovávají podle certifikačního schématu EPPO. Stromy jsou

pěstovány z otestovaného viruprostého množitelského materiálu v izolaci od potencionálních

zdrojů choroby a před předáním pěstitelům testovány. Nejčastěji používanou metodou je

6

imunologická metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), nicméně její výsledky

by měly být brány s jistou dávkou obezřetnosti, neboť distribuce viru v rostlině není jednotná

a předvídatelná (Ogawa et al., 1995). ELISA také není schopna detekovat virus přítomný ve

velmi nízkém titru, což je u směsných infekcí možné (Sánchez-Navarro et al., 2005).

Alternativně se dají použít klasické biologické testy na indikátorových rostlinách, jako

broskvoně cv. GF 305 nebo višeň plstnatá (Prunus tomentosa) (Ogawa et al., 1995). Tyto

testy jsou ovšem časově velmi náročné (od měsíců po 2-3 roky), drahé a ve většině případů

musí být výsledky potvrzeny jinou detekční metodou (Sánchez-Navarro et al., 2005). Krom

ELISY se v mnoha zemích používá molekulárních metod jako RT-PCR (Ogawa et al., 2005).

Molekulární metody nabízí praktickou alternativu metodám předchozím, díky své vysoké

specifičnosti a detekčním limitům. Multiplex polymerázová řetězová reakce (PCR) je

variantou PCR, v níž dvě a více cílových míst je současně amplifikováno v jedné reakci. Od

svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et al, 1998) byla tato metoda úspěšně

uplatněna v mnoha oblastech molekulární biologie (Henegariu et al., 1997). Metody, které

umožní simultánní detekci více virů jsou pro rutinní testování žádoucí, neboť vyžadují méně

času, práce a nákladů. V tomto smyslu multiplex RT-PCR je schopna spolehlivě detekovat

viry a viroidy v rutinní diagnostice (Sánchez-Navarro et al., 2005).

Rozšíření virů peckovin v ČR

V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na

všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Je široce rozšířen ve stromech švestky a

myrobalánu i v některých výsadbách meruňky a broskvoně. Onemocnění peckovin šarkou se

v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde

ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních

Čechách a na jižní Moravě. K přírodním hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly

infikovány přenosem mšicemi ze švestek, slivoní a myrobalámu a staly se sekundárním

zdrojem infekce (Polák, 2006). Virus zakrslosti slivoně je v současnosti rozšířen převážně na

trnkách, třešni a myrobalánu. Na třešni a myrobalánu je také rozšířen virus nekrotické

kroužkovitosti slivoně (Polák, 2007). Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně (ACLSV) a

viru mozaiky jabloně, které na švestce a slivoních mohou vyvolávat příznaky podobné šarce,

tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus

7

svinutky třešně (Cherry leaf roll virus - CLRV), avšak i jeho výskyt je sporadický. Rozšíření

virů v ČR je uvedeno v tabulce č. 1.

Tab.č.1. Rozšíření virů na peckovinách v ČR, uvedeno v procentech infikovaných rostlin

(Polák, 2007).

Virus→ PPV PDV PNRSV ACLSV ApMV CLRV

Švestka 74% 2% 27% 1% 1% -

Myrobalán 26% 11% 18% 1,8% 0,6% -

Trnka 5% 27% 4% 0% 0% -

Třešně a

višně

0% 25% 22% - - 1,8%

Principy ochrany

Základem ochrany proti virům peckovin je zdravý výsadbový materiál. Vysazení zdravého,

viruprostého školkařského materiálu nám však ještě nemusí zaručit, že během několika málo

let nedojde k infikování mladých stromů virem šarky švestky, který je snadno přenosný

mšicemi. Virem infikované stromy nelze léčit, neexistují žádné chemické ani biologické

prostředky, kterými by bylo možno stromy ošetřit a uzdravit nebo je před virovou infekcí

chránit tak, jako tomu je v případě bakteriálních a houbových chorob. Jedinou možností

účinné ochrany proti rostlinným virům je pěstování odolných – rezistentních, nebo dokonce

imunních odrůd peckovin. Problém viru šarky švestky můžeme proto vyřešit pěstováním

odrůd slivoní, švestky, meruňky a broskvoně rezistentních k viru šarky švestky (Polák, 2006).

Proti ostatním virům nejsou zatím známy zdroje rezistence ani naprosto rezistentní odrůdy.

Biologie a škodlivost virů peckovin

Všechny výše zmíněné viry jsou jednovlákné RNA viry. Existuje šest skupin viru šarky

švestky: PPV-D (Dideron), PPV-M (Marcus), PPV-EA (El Amar), PPV-C (Cherry), PPV-Rec

(Recombinant) a nedávno identifikovaný PPV-W (W3174) (James a Varga, 2004). PPV-D a

PPV-M jsou dvě hlavní skupiny viru, obě široce rozšířené v Evropě, a vykazují závažné

rozdílnosti v patogenitě a některé ve svých epidemiologických vlastnostech. Liší se hlavně

v intenzitě choroby mezi jednotlivými druhy Prunus spp. a schopnosti infikovat broskvoň (P.

persica) přenosem mšicemi (Quijot et al., 1995). Skupina kmenů PPV-M a konkrétně

originální kmen PPV-M izolovaný ve Francii vykazuje nejvyšší patogenitu a nejsilnější

8

příznaky na listech i plodech peckovin. Ve střední Evropě v Polsku (Malinowski, 2003),

České republice (Polák a Pívalová, 2005) i v Rakousku (Laimer et al., 2003) převládá

rozšíření slaběji patogenního kmenu PPV-D, více než 90% infikovaných stromů je infikováno

PPV-D. Mezi přírodními hostiteli se jiný kmen než PPV-D téměř nevyskytuje. Přesto existují

sady meruněk a broskvoní infikovaných PPV-M. Ojedinělě byl zjištěn i rekombinantní kmen

PPV-Rec. Jiná situace je v dalších evropských zemích a v jihovýchodní Evropě, v Bulharsku

a Řecku, kde převládají kmeny ze skupiny PPV-M. Např. Kamenova et al. (2003) zjistili

v Bulharsku na meruňkách a broskvoních pouze PPV-M, na švestkách dosahuje podíl PPV-M

88%.

Virus zakrslosti slivoně byl pojmenován svými objeviteli v roce 1936. Jméno zůstalo, ačkoli

výskyt PDV na slivoni je mnohem méně běžný než na jiných druzích rodu Prunus. Nejčastěji

se vyskytuje na višni (P. avium) (Németh, 1986). Příznaky se obvykle několik let po infekci

vůbec neprojeví, občas může být v prvním roce infekce zaznamenáno žloutnutí listů. Projev

příznaků je nejpravděpodobnější asi dva týdny poté, co se noční teploty pohybují okolo 10-

15°C a denní vyšplhají nad 30°C. Napadené listy jsou zkroucené, žlutozelené, zelené podél

hlavních žil. Může docházet k opadávání listů. U napadených stromů se může vyvinout

„vrbovitý vzhled“ s růstem dlouhých holých větví. Na třešních (P. cerasus) napadených PDV

mají listy normální zabarvení a vigor, ale jsou užší a delší než je obvyklé. Symptomy mohou

být omezeny jen na část stromu. Výnos u višní může být snížen až o 50% (Pscheidt, 2008).

PNRSV je lehce přenosné očkováním a roubováním. Šíří se také přirozeně v sadech

infikovaných semenem a pylem, tudíž, přirozené šíření je až do věku stromů, kdy začnou

kvést, značně omezené. Virus se šíří rychleji na višních (P. avium) než na třešních (P.

cerasus). Díky šíření pylem může vysoké procento semen obsahovat PNRSV (Pscheidt,

2008). Některé izoláty nejsou symptomatické, zatímco jiné vyvolávají tvorbu

charakteristických chlorotických kroužků a dírek v mladých listech. U třešní byly popsány

dva izoláty podle toho, zda tvoří jemné kadeřavění listů (M) nebo mozaiku (R) (Aparicio et

al., 1999). Mezi klasické příznaky patří také deformace listů a zakrslost. Postiženy mohou být

celé rostliny nebo jen část. Na rozdíl od PDV, příznaky jsou více viditelné při vysokých

teplotách (Németh, 1986). Výnos stromů napadených běžným izolátem klesá o cca 5%

(Pscheidt, 2008). Stubbs a Smith (1971) a Scott et al. (2001) zaznamenali synergickou reakci

Prune dwarf virus a Prunus necrotic ringspot virus způsobující zakrslost broskvoně. Častým

příznakem této směsné infekce je tvorba rozet.

9

Obrázek č. 1. Plody meruňky (P. armeniaca) se symptomy PPV. Zdravý plod je vpravo dole.

(foto INRA Bordeaux, France). Plod meruňky (P. armeniaca) s charakteristickými

kroužkovými mozaikami na pecce (foto J. Kumar, VÚRV v.v.i.).

Obrázek č. 2. Kroužky a difúzní skvrny na listech meruňky (P. armeniaca)cv. Carola,

infikované PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.)

Obrázek č. 3. Symptomy na listech slivoně (P. domestica) způsobené PPV. (foto J.Kumar,

VÚRV v.v.i.).

10

Obrázek č. 4. Povrchové propadliny a vnitřní nekrózy způsobené PPV na plodech švestky

domácí (P. domestica). (foto INRA Bordeaux, France).

Obrázek č. 5. Symptom na listech náchylné broskvoně (P. persica). (foto J. Polák, VÚRV

v.v.i.).

Obrázek č. 6. Plod broskvoně cv. Catherina s typickými kroužky a difuzními skvrnami

vyvolanými PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.).

Obrázek č. 7. Příznaky PNRSV na listech broskvoně (P. persica). (foto E.V.Podleckis, West

Virginia University)

11

Obrázek č. 8. Listy třešně s příznaky chlorotické skvrnitosti a kroužkovitosti v nichž byla

prokázána přítomnost PNRSV (P. cerasus) (foto a. Oregon State University; b. J. Polák,

VÚRV v.v.i.)

Obrázek č. 9. Příznaky PDV na listech a) višně (P. avium) (foto Oregon State University) a

b) třešně (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.).

Biologie vektorů PPV

V přírodě je šarka šířena mšicemi. Virus šarky švestky je přenášen mšicemi nepersistentním

způsobem na stiletech mšic. Mšice je schopna virus získat nasátím již při zkusmém sání

během několika minut. Po nabývacím sání je schopna jej přenést na zdravou rostlinu během

několika minut inokulačního sání. Použití insekticidů je prospěšné pro hubení mšic, ale

nezabrání přenosu viru v případě, že mšice již má virus na stiletech a přilétá z neošetřených

stromů. V tom případě může virus přenést dříve, než se projeví působení insekticidu. PPV

přenáší řada druhů mšic, proto jmenujeme jen ty nejvýznamnější a nejrozšířenější vektory:

mšice broskvoňová (Myzus persicae) - obr.14, mšice chmelová (Phorodon humuli) - obr.13, a

12

mšice slívová (Brachycaudus helichrysi) - obr.11. Zdroji infekce pro přenos šarky mšicemi

jsou nemocné stromy peckovin v sadech a zahradách. Infikované stromy švestky, meruňky,

broskvoně, ale především i planě a přirozeně rostoucí stromy myrobalánu, švestky, a v

oblastech se silným výskytem šarky i keře trnky, jsou zde sekundárním zdrojem infekce.

Významnými rezervoáry viru jsou stará stromořadí švestky, keře a stromy myrobalánu

rostoucí podél venkovských silnic a cest (Polák, 2002).

Obrázek č. 10. Mšice švestková – Hyalopterus pruni. (foto W.Cranshaw, Colorado State

University)

Obrázek č. 11. Mšice slívová – Brachycaudus helichrysi. (foto H.J.Buhr, Germany)

Obrázek č. 12. Mšice bodláková – Brachycaudus cardui. (foto INRA Bordeaux, France)

13

Obrázek č. 13. Mšice chmelová – Phorodon humuli (foto G. Eickelmann, Geisenfeld,

Germany)

Obrázek č. 14. Mšice broskvoňová - Myzus Persicae (foto University of Minnesota)

Zjišťování výskytu

Jediná možná spolehlivá metoda zjišťování výskytu je testování rostlin. Mnohé infikované

rostliny nevykazují, alespoň ze začátku, příznaky choroby, stejné příznaky mohou být

vyvolány různými viry, a je tudíž u mnoha případů nemožné chorobu diagnostikovat čistě

symptomaticky. Symptomatika tedy slouží pouze jako pomocné kritérium hodnocení infekce

(Pscheidt, 2008). Virus nemusí být ve stromech rovnoměrně rozšířen, je distribuován

nerovnoměrně, a jeho koncentraci ovlivňují klimatické podmínky a roční období. Pro

diagnostiku za pomoci testu ELISA jsou nejvhodnější listy a květy. V podmínkách ČR se

provádí stanovení PPV v květech během měsíce dubna a května, a v listech koncem května a

v červnu, později obsah viru v listech klesá. V diagnostice méně příznivých obdobích, jako je

zima, kdy je nutno odebírat vzorky zelené kůry, by tedy neměly být výsledky dosažené

metodou ELISA brány jako spolehlivé (Spiegel and Martin, 1993). Polymerázová řetězová

reakce (PCR) je vysoce citlivá spolehlivá metoda, která našla uplatnění při mnoha

„problematických detekcích“, obzvláště v diagnostice kmenů virů a stanovení přítomnosti

14

virů v odrůdách se zvýšenou rezistencí. Multiplex RT-PCR je schopna detekovat více virů

současně a tudíž je výhodná z hlediska časového i ekonomického.

Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV

Předkládaná multiplex RT-PCR byla otestována na vzorcích odebraných ze švestky domácí

(Prunus domestica L.), třešně ptačí (P. avium (L.) L.), třešně višně (P. cerasus L.), višně

plstnaté (P. tomentosa Thunb.), meruňky obecné (P. armeniaca L.), broskvoně obecné (P.

persica (L.) Batsch), a trnky obecné (P. spinosa L.) a na její citlivost nebyl zaznamenám vliv

druhu rostliny. Dále byla otestována a potvrzena schopnost detekovat jednotlivé kmeny viru

šarky švestky nacházející se na území ČR, a to PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. U PDV a PNRSV

jsme testovali dostupné izoláty z ČR a Rumunska. Diagnostická citlivost a specifičnost byla

testována celkem na 80 vzorcích a porovnána s metodou simplex RT-PCR schopnou

detekovat v jedné reakci pouze jeden virus (viz tabulka č. 2). Mezi oběma metodami nebyly

shledány žádné rozdíly.

Tabulka č. 2: Porovnání diagnostické citlivosti a specifičnosti metody simplex one-step-RT-PCR a multiplex

one-step-RT-PCR.

Izolát Hostitel Původ Počet vzorků Simplex

one-step-RT-PCR

Multiplex

one-step-RT-PCR

PPV PDV PNRSV PPV

PDV PNRSV

Peach Broskvoň CZ 5 + + + + + +

Cherry Třešeň CZ 12 + + + +

Sour

cherry

Višeň CZ 14 + +

Blackthorn Trnka CZ 3 + +

Plum1 Slivoň CZ 5 + + + +

Plum2 Slivoň Rumunsko 8 + + + +

Plum3 Slivoň CZ 5 + + + +

Nanking

Cherry

Višeň

plstnatá

Itálie 2 + +

Plum4(a)

Slivoň(a)

CZ 5 + +

Plum5(b)

Slivoň(b)

CZ 20 + +

Apple(c)

Jabloň(c)

CZ 1 - - - - - -

(a)PNRSV isolates,

(b)PPV isolates,

(c)ApMV isolates., CZ-Česká republika

15

Odběr vzorku

Správný odběr vzorku je nesmírně důležitý pro úspěšnou detekci. Ideální čas k odběrům je

pozdní jaro, kdy je obvykle koncentrace viru ve stromech vysoká. Odebíráme nejlépe

symptomatické středně staré listy, pokud možno rovnoměrně ze čtyř míst po obvodu koruny a

z jednoho místa středu koruny stromu. Odebereme 1-2 g vzorku k homogenizaci. Listy

dopravíme v chladu do laboratoře, kde je buď ihned zpracujeme, nebo uchováváme při -80°C.

Je také možno odebírat kůru nebo okvětní plátky, přičemž platí stejná pravidla.

Izolace RNA

Dalším důležitým krokem pro úspěšnost reakce je izolace kvalitní RNA v dostačující kvantitě

a kvalitě. Pletiva dřevitých rostlin, obzvláště venku rostoucích, obsahují vyšší množství

fenolických složek a polysacharidů, které mají inhibující vlastnosti (Nassuth et al., 2000).

Tyto látky tvoří chemické vazby s nukleovými kyselinami i proteiny při homogenizaci vzorku

(Newbury & Possingham, 1977). Přítomnost inhibitorů poté ovlivňuje aktivitu reversní

transkriptázy anebo polymerázy a tím i spolehlivost celé reakce. Výsledek může být tedy

negativní, ačkoli je virus v pletivu přítomen (Nassuth et al., 2000). Doporučujeme tedy

modifikovaný postup izolace přizpůsobený pro pletiva stromů jako je popsána v Singh et al.

(2002), pokud upřednostňujete izolaci fenol-chloroformem; nebo v případě používaní

„kolonkové“ metody izolace, modifikaci podle Mekuria et al. (2003). Kvalitu izolované RNA

je vhodné zkontrolovat spektrofotometricky a na agarózovém gelu. Při spektrofotometrickém

měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou, obvykle 1:9 (RNA:H2O). Měří se při

vlnových délkách 260, 230 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané

poměry 260/280 a 260/230 jsou 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší než 1.75

svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. Absorbance při 230 nm značí nečistoty, jako jsou

karbohydráty, fenolické sloučeniny, aromatické složky. Při výpočtu koncentrace optická

hustota 1 odpovídá přibližně 40 ng/µl pro RNA. Vypočtená koncentrace by se „měla“

pohybovat mezi 200 - 1000 ng/µl. Tyto hodnoty slouží pouze k orientačnímu odhadu čistoty

a koncentrace RNA, hodnoty, které nám umožní utvrdit se v konečném výsledku RT-PCR

(např. v případě izolace RNA o koncentraci 700 ng/µl, poměrům 260/280 a 260/230 rovným 2

a negativního výsledku RT-PCR, kdy byl pozitivní výsledek u pozitivní kontroly, máme

jistotu, že v daném vzorku virus opravdu není).

Integritu izolované RNA je dále dobré zkontrolovat na denaturujícím agarózovém gelu.

Většinu izolované RNA tvoří RNA rostlinná a opět z rostlinné RNA převládá ribozomální

RNA. Ta se na gelu rozdělí na dva silné „bandy“ - 18s a 28s ribozomální RNA, přičemž

16

intenzita bandu 28s by měla být u intaktní neporušené RNA přibližně dvojnásobná intenzitě

bandu 18s. Pokud nesouhlasí poměr 2:1 nebo jsou na gelu viditelné jen „šmouhy“, celistvost

RNA byla porušena.

Protokol I. Izolace RNA modifikovanou „kolonkovou metodou“ firmy Qiagen - RNeasy

Plant Mini Kit

A) Homogenizace vzorku za použití tekutého dusíku

1. Pro izolaci RNA potřebujeme 0,2 g rostlinného pletiva. Výhodnější je ovšem

homogenizovat více a z homogenátu 0,2 g navážit. Vzorky homogenizujeme

v tekutém dusíku, u vzorků uchovávaných na -80°C dbáme na to, aby nedošlo k jejich

rozmražení, ideálně odebíráme z mrazicího boxu po každém vzorku zvlášť. Vzorek

pečlivě homogenizujeme v předmražené třecí misce.

2. Homogenát vpravte do min. 3 ml sterilní zkumavky (pokud jsou uchovávány na -80°C

v 2 ml mikrozkumavkách, doporučujeme celou zkumavku před začátkem izolace

ponořit do tekutého dusíku a poté obsah jednoduše přesypat do větší zkumavky). 3 ml

zkumavky je také možno předmrazit krátkým ponořením do tekutého dusíku. Je velmi

důležité nepřesáhnout danou váhu, neboť u kolonkových metod izolace RNA dochází

v tomto případě ke sníženému výtěžku i kvalitě RNA. Jakmile máme vzorky

navážené, je opět nutno zabránit jejich rozmražení před samotnou izolací - vhodné je

uchování v tekutém dusíku nebo v mrazicím boxu.

3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a

sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem).

4. Krátce vortexujte.

B) Homogenizace vzorku bez tekutého dusíku

Bez tekutého dusíku lze homogenizovat pouze listy čerstvé. Jeho druhou nevýhodou je, že je

před homogenizací nutno odvážit 0,2 g, a tedy ztrácíme možnost homogenizovat větší

množství materiálu a zvýšit tím pravděpodobnost výskytu viru právě v daném odebraném

materiálu.

1. Připravte si modifikovaný RLT pufr z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit

(Qiagen) - k pufru přidejte PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite

(1% - hmotnost/objem). Na jeden vzorek bude zapotřebí 2 ml takto připraveného

extrakčního pufru.

2. 0,2 g rostlinného pletiva vložte do homogenizačního igelitového pytlíku (stejný jako

pro přípravu vzorků na ELISA test).

17

3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit

(Qiagen) s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1%

- hmotnost/objem)

4. Pečlivě homogenizujte.

Izolace RNA

5. 500 µl homogenátu odeberte do 2 ml mikrozkumavky, přidejte 60 µl 20% sarcosylu

(N-lauroyl-sarcosine, Sigma).

6. Inkubujte při 70°C po dobu 10 minut.

7. Obsah přeneste do QIAshredder mini kolonky (fialová) a centrifugujte 5 min při

rychlosti 14 000 rpm.

8. Do nové 2 ml mikrozkumavky odeberte supernatant (cca 350 µl) a přidejte 315 µl

95% etanolu.

9. Promíchejte a celkový obsah napipetujte do QIA spin kolonky (růžová) a centrifugujte

15 s při 8000 x g (10,000 rpm).

10. Supernatant odstraňte.

11. Přidejte 700 µl RW1 promývacího pufru. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000

rpm).

12. Supernatant odstraňte.

13. Přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 15

s při 8000 x g (10,000 rpm).

14. Supernatant odstraňte.

15. Ještě jednou přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem.

Centrifugujte 2 min při 8000 x g (10,000 rpm).

16. Supernatant odstraňte.

17. Vložte kolonku do nové zachycovací 2 ml mikrozkumavky a na sucho centrifugujte po

dobu 1 min na nejvyšší rychlost centrifugy.

18. Kolonku přendejte do 1,5 mikrozkumavky; přímo na membránu napipetujte 40 µl

RNase free vody a stočte na 10,000 rpm po dobu 1 min. Tím se uvolní RNA.

19. Kolonku odstraňte, RNA uchovávejte v -20°C nebo -80°C.

One-step-RT-PCR

Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější používat one-step-RT-PCR, neboť redukcí

kroků je sníženo riziko chyby a kontaminace. Při použití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR je

protokol následující:

18

1) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mM MgCl2), 1 µl dNTPs (konečná koncentrace

200 µM každý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 3) o

koncentraci 10 µM, doplnit RNase a DNase free H2O do 23 µl a přidat 2 µl RNA.

2) Podmínky reakce jsou:

I) 50°C po dobu 30 min (reverzní transkripce);

II) 95°C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy);

III) 35 cyklů ve třech krocích: 94°C po 20 s (denaturace), 51°C po 30 s (dosedání) a

72°C po dobu 1 min (polymerizace);

IV) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a

V) 10°C uchovávání.

Obrázek č. 15. Schéma zpracování vzorků metodou One Step RT-PCR.

19

Two-step-RT-PCR

Při two-step-RT-PCR v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cDNA a

v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je

následující:

1) Pro reverzní transkripci použijeme

I) 10 µl H2O, 0.6 µl reverzních primerů (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µM (PPV-

RR, PNcpinR, PDVdpR) a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70°C

dosednout primery.

II) Okamžitě zchladíme a

III) podle návodu výrobce používané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro

ukázku protokol za použití AMV reverzní transkriptázy (Promega). V mastermixu

smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dNTPs mix

(konečná koncentrace 200 µM každého nukleotidu), 40 jednotek (40mM)

RNasin® Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42°C), 2.5μl

AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové množství i

s již předtím namíchanou směsí „RNA-primer-voda“ bylo 25 µl, tedy v tomto

mastermixu do 12.4 µl.

IV) Rozpipetujeme do směsi „RNA-primer-voda“ - při pipetování „jednou špičkou“

pozor na možnost kontaminace!

2) Při PCR použijeme v mastermixu

I) 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µM (při konečném obsahu jedné reakce

25 µl) a 2 µl cDNA.

II) PCR podmínky se mohou lišit podle používané polymerázy, proto zde jen pro

ilustraci uvedeme protokol za použití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq™

reakčním pufrem, který v sobě již obsahuje barvivo DNA (Promega). Mastermix

se v tomto případě skládá z

(1) 5 µl pufru (1.5 mM MgCl2), 2 µl dNTPs (200 µM každého nukleotidu), 0.6 µl

každého primeru o koncentraci 10 µM, 0.2 µl (2,5 U) GO Taq polymerázy

(Promega, Medison, USA) a doplníme RNase-free H2O do celkového množství

23 µl.

(2) Rozpipetujeme do jednotlivé mikrozkumavky velikosti 0,5 ml nebo 0,2 ml (dle

typu termocycleru) a přidáme 2 µl cDNA.

III) Podmínky reakce jsou 95°C po dobu 2 min (iniciální denaturace);

20

IV) 35 cyklů po třech krocích - 95°C po dobu 20s (denaturace), 51°C po dobu 30s

(dosedání primeru neboli aneling), 72°C po dobu 1 min (polymerizace);

V) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a

VI) 10°C uchovávání.

Vizualizace PCR produktů

Vizualizace PCR produktů probíhá za pomoci eletroforetického rozdělení fragmentů v

agarózovém gelu (je doporučeno použití 1,5 - 2,5 % gelu pro lepší oddělení jednotlivých

produktů) s předchozím označením DNA za použití etidium bromidu (0,5 µg/ml) nebo Syber

Greenu (0,1 µl Syber Green/ 10 ml gel). Agarózový gel se připravuje v TAE (40 mM

Trisacetát, 1 mM EDTA, pH 8) nebo TBE pufru (89 mM Tris base, 89 mM kyseliny

trihydrogenborité, 1 mM EDTA, pH 8). Etidium bromid nebo Syber Green se dá používat

buď přímo do gelu nebo namíchat do PCR produktu. Z hlediska bezpečnosti práce však

doporučujeme používat Sybr Green, u kterého nebyl prokázán negativní dopad na lidský

organismus. 5 μl produktu obarveného barvivem (6x loading dye), je nanášeno na gel a

podstoupeno 3-9 V/cm po dobu 60 - 90 min dle velikosti gelu. V případě použití zeleného

pufru dodávaného k enzymu Go Taq (Promega) - viz. two step RT-PCR - již není zapotřebí

produkty barvit a můžeme přímo z cykleru nanášet na gel. Produkt primerů PPV-RR a F3 je

dlouhý 345 bp; PDVdpR a PDVdpuF 220 bp a PNcpR a PNcpinF tvoří 425 bp dlouhý

produkt (viz. Obrázek č. 16).

Tabulka č. 3 Seznam primerů

Primer Sekvence 5’-3’ Tm Target By

PPV-RR CTCTTCTTGTGTTCCGACGTTTC 59°C PPV Varga & James,

2005

F3 GGAATGTGGGTGATGATGG 57°C PPV Varga & James,

2006

PDVdpR CCT TTA ATG AGT CCG T 56°C PDV

PDVdpuF CCG AGT GGA TGC TTC ACG 58°C PDV

PNcpR CTTTCCATTCGGAGAAATTCG 54°C PNRSV

PNcpinF GAGTATTGACTTCACGACCAC 57°C PNRSV

21

Obrázek č. 16. Multiplex RT-PCR. Vzorky 1 - 7, postupně:1) PPV, PDV a PNRSV směsná

infekce; 2) PPV a PNRSV směsná infekce; 3) PDN a PNRSV směsná infekce; 4) PPV a PDV

směsná infekce; 5) PNRSV infekce; 6) PDV infekce; 7) PPV infekce; M) 100bp DNA ladder

marker (Fermentas).

Srovnání „novosti postupů“

V rutinní diagnostice se běžně určuje jeden cílový organismus v jedné reakci. Metoda,

umožňující detekce tří organismů současně je ekonomicky i časově výhodná.

Popis uplatnění metodiky

Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě

současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti

slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV).

Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu k zjednodušení rutinních detekcí virů

na peckovinách. Zprostředkovaně může sloužit i pro soukromé pěstitele peckovin.

Seznam použité související literatury

Al Rwahnih M., Turturo C., Minafra A., Saldarelli P., Myrta A., Pallás V., Savino V., 2004.

Molecular variability of Apple chlorotic leaf spot virus in different hosts and geographical

regions. J. Plant Pathol. 86 (2): 117-122.

Aparicio F., Myrta A., Di Terlizzi B., Pallás V., 1999. Molecular Variability Among Isolates

of Prunus Necrotic Ringspot Virus from Different Prunus spp. Virology 89(11): 991-999.

22

Candresse T., Lanneau M., Revers F., Macquaire G., German S., Grasseau N., Dunez J.,

Malinowski T., 1995. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis

of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus. Acta Hortic. 386: 136-147.

Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Nguyen P.N., Caskey C.T., 1988. Deletion

screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.

Nucleic Acids Res. 16: 11141-11156.

Desvignes, J.C., Boye R., 1989. Different diseases caused by chlorotic leaf spot virus on the

fruit trees. Acta Hortic. 235: 31-38.

Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H., 1997. Multiplex PCR:

Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: 504-511.

James D., Varga A., 2004: Preliminary molecular characterisation of plum pox potyvirus

isolate W3174: evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657: 177-182.

Kamenova V., Milusheva S., Borisova A., Stoev A., Myrta A., 2003: Plum pox virus strains

in Bulgaria. Options Mediterranéennes, Serie B, 45: 65-67.

Laimer M., Mendonca D., Arthofer W., Hanzer V., Myrta A., Boscia D., 2003: Occurrence of

different Plum pox virus strains in several stone fruit specias in Austria. Options

Mediterranéennes, Serie B., 45: 79-83.

Liberti D., Marais A., Svanella-Dumas L., Dulucq M. J., Alioto D., Ragozzino A., Rodoni B.,

Candresse T., 2005. Characterization of Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus, a Novel

Trichovirus Isolated from Stone Fruit Trees. 10.1094/PHYTO-95-0420. Phytopathology –

Virology. The American Phytopathological Society.

Malinowski T., 2003: Plum pox disease in Poland: the past and current situation. Options

Medirranéennes, Serie B., 45: 99-101.

Malinowski T., Cambra M., Capote N., Zawadzka B., Gorris M.T., Scorza R., Ravelonandro

M., 2006. Field trials of plum clones transformed with the Plum pox virus coat protein (PPV-

CP) gene. Plant Dis. 90:1012-1018.

Mekuria G., Ramesh S.A., Alberts E., Bertozzi T., Wirthensohn M., Collins G., Sedgley M.,

2003. Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ring spot virus

and prune dwarf virus in almond (Prunus dulcis). J. Virol. Methods 114: 65–69.

Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A., 2000. Improved RNA

extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus

several viruses in plant extracts. J. Virol. Methods 90: 37–49.

23

Nemeth M., 1986. Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Martinus

Nijhoff Publishers, The Netherlands and Akademini Kiado, Hungary, 840p.

Newbury H.J., Possingham J.V., 1977. Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic

Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiol. 60: 543-

547.

Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., 1995. Plum Pox Virus. From the Compendium of Stone

Fruit Diseases. APS press, 98 pp, USA.

Polák J., 2002. Virus šarky švestky – nejškodlivější virus peckovin v České republice – II.

Díl. Dostupné na http://www.zahradaweb.cz/projekt/clanek.asp?pid=2&cid=5192.

Polák J., 2006. Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and

ornamental species of Prunus. OEPP/EPPO bulletin 36: 225–226.

Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and

sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1–4.

Polák J., Pívalová J., 2005: Sporadic distribution of Plum pox virus M strain in natural

sources in the Czech Republic. Hort. Sci. (Prague), 32: 85-88.

Polák J., Zieglerová J., Bouma J., 1997. Diagnostika a rozšíření viru chlorotické skvrnitosti

jabloně na jádrovinách v České republice. Hort. Sci. Prague 24: 89-94.

Pruss G., Ge X., Shi X.M., Carrington J.C., Vance V.B., 1997. Plant Viral Synergism: The

Potyviral Genome Encodes a Broad-Range Pathogenicity Enhancer That Transactivates

Replication of Heterologous Viruses. The Plant Cell .9: 859-868.

Pscheidt J.W., 2008. An online guide to Plant Disease Control. Oregon State University.

Dostupné na http://plant-disease.ippc.orst.edu/disease.cfm?RecordID=293

Quiot J.B., Labonne G., Boeglin M., Adamolle C., Renaud L.Y., Candresse T., 1995.

Behavior of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees: First results.

Acta Hortic. 386:290-297.

Saade M., Aparicio F., Sanchez-Navarro J.A., Herranz M.C., Myrta A., di Terlizzi B., Pallas

V., 2000. Simultaneous detection of the three ilarviruses affecting stone fruit trees by

nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse-transcripton polymerase chain

reaction. Phytopathology - Virology p. 1330-1336.

Sanchez-Navarro J.A., Aparicio F., Herranz M.C., Minafra A., Myrta A., Pallas V., 2005.

Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR.

Eur. J. Plant Pathol. 111: 77–84.

24

Scott S.W., Zimmerman M.T., Yilmaz S., Zehr E.I., Bachman E., 2001. The interaction

between Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in peach stunt disease. Acta

Hortc. 550: 229-236.

Simon L., Saenz P., Garcia J.A., 1997. Filamentous viruses of woody plants. Chapter 7 Plum

pox virus. pp. 75-86. Edited by P. Monnette. Trivandrum, India: Research Singspost.

Singh R.P., Nie X., Singh M., Coffin R., Duplessis P., 2002. Sodium sulphite inhibition of

potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J.

Virol. Methods 99: 123–131.

Spiegel S., Scott S.W., Bowman-Vance V., Tam Y., Galiakparov N.N., Rosner A., 1996.

Improved detection of prunus necrotic ringspot virus by the polymerase chain reaction. Eur. J.

Plant Pathol. 102: 681-685.

Spiegel S., Thompson D., Varga A., James D., 2005. An Apple chlorotic leaf spot virus

isolate from Ornamental Dwarf Flowering Almond (Prunus glandulosa ‘Sinensis’): Detection

and Characterization. HortScience 40(5): 1401-1404.

Stubs L.L., Smith P.R., 1971. The association of Prunus ringspot, prune dwarf, and dark green

sunken mottle viruses in the rosetting and decline disease of peach. Austral. J. Agricul. Res.

22: 771–785.

Varga A., James D., 2005. Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time

multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis: a rapid method for strain

typing. J. Virol. Methods 123: 213–220.

Varga A., James D., 2006. Use of reverse transcription loop-mediated isothermal

amplification for the detection of Plum pox virus. J. Virol. Methods 138: 184–190.

Yoshikawa N., 2007. Apple chlorotic leaf spot virus. Dostupné na

http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=386

Seznam publikací, které předcházely metodice

Jarošová J. 2008. Interaction of Plum pox virus with Ilarviruses and Trichoviruses in stone

fruit. MSc Thesis. Czech University of Life Sciences. 82pp.

Polák J., Pívalová J., Kumar Kundu J., Jokeš M., Scorza R., Ravelonandro M. 2008.

Behaviour of transgenic Plum pox virus-resistant Prunus domestica L. clone C5 grown in the

open filed under a high and permanent infection pressure of the PPV-Rec strain. Journal of

Plant Pathology 90 (1, Supplement): S1.33-S1.36.

25

Polák J., Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Pívalová J., Scorza R., 2008. Interactions of

Plum pox virus strain Rec with Apple chlorotic leafspot virus and Prune dwarf virus in field-

grown transgenic plum Prunus domestica L., clone C5 , Plant Protect. Sci. 44(1): 1-5.

Kumar Kundu J., Briard P., Hilly M.J., Ravelonandro M., Scorza R. 2008. Role of the 25-26

nt siRNA in the resistance of transgenic Prunus domestica graft inoculated with plum pox

virus. Virus Genes 36(1):251-220.

Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Briard P., Monsion M., Scorza R., 2007. The effect of co-

existing prunus viruses on transgenic Plum pox virus resistant plums. Acta Horticulturae 738:

653-656.

Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and

sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1–4.

Polák J., Pívalová J., Jokeš M., Svoboda J., Scorza R., Ravelonandro M., 2005. Preliminary

results of interactions of Plum pox (PPV), prune dwarf (PDV), and apple chlorotic leafspot

(ACLSV) viruses with transgenic plants of plum, Prunus domestica, clone C5 grown in an

open field. Phytopathol. Pol. 36: 115-122.

Kumar Kundu J. 2003. A rapid and effective RNA release procedure for virus detection in

woody plants by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta virologica 47: 147-

151.

(foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.)

Název: Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-

PCR

Autoři: Jarošová J., Polák J. & Kumar J.

Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i.

Drnovská 507, 16106 Praha 6–Ruzyně

Tisk: CD

Počet stran: 26

Vydání: první

Rok vydání: 2008

ISBN: 978-80-87011-86-7

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008