Metodika přípravy medií obecně1/ Příprava zásobních roztoků
• RR (1mg - 1mol - 1 ml)
makroelementy (10x) - kromě Camikroelementy (100x), příp. 2x ředitFeEDTAvitaminy (100-1000x) (2-3 měs 2-4 °C, déle při -20°C)
Komerčně dostupné
koncentraceVáhové jednotky• 10-6 = 1mg.l-1 (ppm)
Molární koncentrace
1M = MW v g v 1litru roztoku (1mM = v mg/l, 1 M = v g/l)
Převod mM na mg:MW 2,4-D = 221,0
1mM 2,4-D ……221mg/l
1M 2,4-D …….0,221 mg/l
mg/l na mMkoncentrace v mg/l
MW
1 M = 1 mol .l-1
Rozpouštění RR
• 2,4-D, IAA - 96%ETOH nebo 1N KOH • CK - 1N KOH nebo HCl• TDZ - DMSO (dimetylsulfoxid)
• 2/ odměření jednotlivých zásobních roztoků podle receptury (navážení komerční
směsi) • 3/ přidání sacharozy• 4/ rozmíchání• 5/ doplnění vody do 3/5 celk. objemu• 6/ změření a upravení pH na mag. míchačce
(1N HCl a 1N KOH) • 7/ přidat rozehřátý agar (rezerva objemu) • 8/ doplnit horkou vodou do celk. objemu• 9/ rozlít do kultivačních nádob• 10/ zakrýt pečlivě víčkem, případně popsat• 11/ sterilizovat v autoklávu
Modifikace - termolabilní substance (nebo Gelrit)
• 1-6 stejné, s vyjímkou termolabilních látek• sterilizujeme celé medium v autoklávu (objemová
rezerva) v cejchované nádobě; kult. nádoby zvlášť• necháme vychladnout ve flowboxu cca 50°C• mezitím zfiltrujeme termolabilní látky přes filtr
0,2m• přidáme do chladnoucího media (40-50°C) • dobře rozmícháme a doplníme sterilní dest. vodou• rozlijeme do předem vysterilizovaných nádob
Termolabilní substance*• Fruktóza, maltóza• Ca-pantothenát• gibereliny, IAA, ABA• riboflavin, k.listová• močovina• asparagin, glutamin• adenin sulfát• enzymy• antibiotika
pro přesné pokusy
všechny vitamíny, aminokyseliny i RR
Dotazy?
? Pokračovat v teorii ?
Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk
stacionární (můstky, buničitá vata, čedičová vata, polyuretanová pěna, membrány apod.)
provzdušňovaná
• - třepačky
• - klinostaty
• - míchaná
• - probublávaná
Kultivační nádoby
• Magenta (Sigma)
VitroVent
Inkubovaná třepačka
• Amplituda• otáčky (rpm)
Kultivační láhev s míchadlem
• Pro suspenzní kultury• 100-250 rpm• 1-12 litrů (Techne,
Sigma)
Roller
• Pomalé šetrné otáčení• 5-60 revolution per
hour (do 1 rpm)• jen pro buňky,
ulpívající na stěnách nádoby
Kromě chemických podmínek – média
Důležité i plynné prostředí (etylén, CO2 , H2O)
Fyzikální podmínky
• teplota
• světlo
Způsoby regenerace in vitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze
Přímá organogeneze - využití:
• rychlé namnožení cenných genotypů (podstatné zvýšení množitelského koeficientu, množení těžko množitelných kultur, cenných jedinců, vzácných druhů)
příklady
• Brambory klasicky 1: 5 -10• mikropropagace 1: 500000
• rododendrony apod.
• Vzdálená křížení, nedávající plodné potomstvo
• šlechtitelsky cenné mutace
Způsoby regenerace in vitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze
Nepřímá organogeneze - využití:
• selekce (selekční tlak, využití somaklonální variability, mutageneze, transgenoze)
4/ Způsoby hodnocení a dokumentace kultur
• Počet kontaminovaných/ rostoucích/nerostoucích kultur
• Měření přírůstku prýtů, kořenů, kalusu
• vážení - nárůst hmotnosti
• počítání (regenerovaných prýtů, buněk)
V různém časovém odstupu
