1 / 71

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

2. Isozymy

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

2 / 71

Enzymy

► Studujeme variabilitu proteinů, resp. jedné jejich podskupiny - enzymů

► Vizualizujeme projevy katalytické aktivity pomocí tzv. histochemického barvení = nedetekujeme přímo molekuly studovaných proteinů

► Známo přes 2000 enzymů

► Pro analýzu používáno řádově několik desítek» v naší laboratoři v současnosti 21

3 / 71

Enzymy

► Klasifikace enzymů – Enzyme Commision number (EC):1. oxidoreduktasy (přenos elektronů, typicky dehydrogenasy)

2. transferasy (přenos určité skupiny – fosfát, hydroxyl, amin,…)

3. lyasy (štěpení vazeb C-C, C-N, C-O)

4. hydrolasy (podskupina předešlé, hydrolytické štěpení)

5. isomerasy (změna geometrické struktury molekuly)

6. ligasy (spojení dvou molekul)

► Podskupiny podle substrátu, přenášené skupiny, apod., enzym má 4-místné číslo:» ADH – alcohol dehydrogenase, EC 1.1.1.1

» EST – esterase, EC 3.1.1.-

» http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

4 / 71

Isozymy / allozymy

► Isozymy (isoenzymy) - všechny enzymy (= všechny proužky na gelu), které vizualizujeme pomocí jedné barvící reakce

» stejná metabolická funkce, ale může jít o různé geny

• např. jaderný a chloroplastový

• dva enzymy s podobnou funkcí, které jsou schopny metabolizovat předložený substrát

► Allozymy – isozymy, které jsou produkty jednoho genu (lokusu); jednotlivé allozymy přestavují jednotlivé alely

5 / 71

Isozymy / allozymy

Isozymy

Allozymy lokus 3

Allozymy lokus 2

Allozymy lokus 16 alel

DIA, Centaurea

6 / 71

Co vlastně detekujeme ?

► Rozdíl v mobilitě molekuly při elektroforéze:» velikost (v rámci allozymů ale ± stejná)» tvar molekuly (sekundární, terciární a kvartérní struktura)» elektrický náboj

► Předpokládáme, že rozdílná mobilita odráží rozdíly v primární struktuře = pořadí aminokyselin = rozdíly v kódující sekvenci DNA

► Vzhledem k degeneraci gen. kódu se ne všechny bodové mutace projeví změnou struktury proteinu» odhady řádově 20-60%

► Předpoklad selekční neutrality (asi neplatí 100%)

Isozymy / allozymy

7 / 71

Izolace

► Potřeba zachovat enzymatickou aktivitu» ve všech fázích citlivé na teplotu

► Izolace z živé tkáně (~ desítky mg = „střední“ list)

► Homogenizace v izolačním pufru» stabilizace pH

» stabilizace proteinů (antioxidanty apod.)

» příp. odstranění nízkomolekulárních inhibitorů

► Centrifugace

► Uchovávání v -80°C

8 / 71

Izolace

6PGDH, Spergularia

pufr 1 pufr 2 pufr 3

► Vliv izolačního pufru

9 / 71

Elektroforéza

► Škrobový gel (horizontální)► Polyakrylamidový gel (vertikální)

► Alkaické pH → záporný náboj většiny aminokyselin → pohyb k anodě (+)

► Velmi citlivá metoda – změna náboje o jednotku

► Modifikace: gradient pH → isoelectrical focusing (immobilised pH gradient)

10 / 71

Detekce enzymů

► Gel po elektroforéze bezbarvý

► Obsahuje všechny proteiny přítomné v izolátu

► Enzymy detekujeme pomocí tzv. histochemického barvení, tj. detekujeme specifickou katalytickou aktivitu

► Gel vložíme do roztoku se substrátem specifickým pro daný enzym / skupinu enzymů

11 / 71

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

12 / 71

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

► Spřažené reakcesubstrát i produkt bezbarvé, ale přeměna je spojena s dalšími reakcemi (oxidace / redukce), jejichž projev lze detekovat

13 / 71

Spřažené reakce

Detekce enzymů

substrát

produkt

rozpustná sůl

14 / 71

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

► Spřažené reakcesubstrát i produkt bezbarvé, ale přeměna je spojena s dalšími reakcemi (oxidace / redukce), jejichž projev lze detekovat

► Enzymová kaskádapřímo nedetekovatelná reakce; přidáme do roztoku další enzym, který dále metabolizuje produkt 1. reakce a návaznou reakce jsme schopni obarvit

15 / 71

Interpretace gelů

► Sada proužků na gelu = zymogram = isozyme pattern

► Porovnání patterns mezi dvěmi vzorky» hodnotíme shodu (např. při identifikaci klonů)

EST, Carex nigra

16 / 71

Interpretace gelů

► Většinou snaha o alelickou interpretaci

Předpoklady:

► rozdíly v mobilitě odrážejí rozdíly v primární struktuře /v sekvenci DNA

► homologie stejně migrujících proužků

► kodominance

Dále nutno znát:

► ploidie (= počet alel)

► kvartérní struktura – z kolika podjednotek se skládá funkční molekula enzymu

17 / 71

Interpretace gelů

Monomerní enzymy

► každý proužek = alela

► teoreticky stejná intenzita proužků – u polyploidů lze dávkování alel odhadnout z intenzity» … ale může to být dost nepřesné

diploid tetraploid

ABAA

BBBB

BCCC

ABCC

BC

LAP, Centaurea DIA, Centaurea

BBBCBCCC

CCCCABBC

ABBCBBBC

ABBB

18 / 71

Interpretace gelů

Dimerní enzymy

► u heterozygotů se 2 alelami 3 proužky

AB

A

BB

A

AA BBA B AB

BB AA AB AA AB AB

1

2

1

► s více alelami složitější pattern

► odchylky od očekávané intenzity mohou prozradit dávkování alel

6-PGDH, Centaurea

AABC

4

21

1

4

4

ABCD

1

6

9

AAAB

19 / 71

Interpretace gelů

Tetramerní enzymy

► u heterozygotů se 2 alelami 5 proužků

1

6

1

4

4

DIA-3, Carex nigra

20 / 71

Interpretace gelů

Problémy při hodnocení gelů

Rozdíly v intenzitě► intenzitu proužků mezi jedinci nelze srovnávat► v rámci jedince může signalizovat poměr alel (u polyploidů)

Nulové alely► alely bez detekovatelného projevu, jedinec chybně skórován

jako homozygot► u monomerů odhalitelné jen kontrolním křížením► většinou nemohou existovat v homozygotním stavu

21 / 71

Interpretace gelů

Problémy při hodnocení gelů

Sekundární proužky► různá mobilita při stejné primární struktuře

» post-translační úpravy

» degradace během zpracování vzorku

Interlokusové (intergenické) proužky► u enzymů z více podjednotek, heterodimery tvořeny produkty

různých lokusů

22 / 71

Interpretace gelů

Problémy

6PGDH, Centaurea

lokus 2

lokus 1

BB BB BB AB BC BB BB BB BB BB

AA AA AC AC AC AC AA AB AA AA

sekundární proužek

interlokusový proužek

(skoro) nulová alela 6pdgh-1 c

sekundární proužek

6PGDH, dimerní enzym, diploidi

23 / 71

Optimalizace

► 1. Výběr izolačního pufru» Několik vzorků v různých pufrech, co nejvíce enzymů

» Sledujeme, jak dobře se gely barví a čitelnost proužků

► 2. Výběr enzymových systémů» Izolace ve vybraném pufru

» Vzorky z různých populací

» Vybíráme barvitelné enzymy s vhodnou mírou variability

» Alternativní barvení, modifikace koncentrací,…

► 3. Vlastní analýza» všechny vzorky

» obvykle více enzymů (4-8) → multilokusový genotyp

24 / 71

Porovnání s jinými metodami

Výhody

► cena

► kodominantní charakter

► univerzálnost

► reprodukovatelnost

► menší mutační rychlost (např. proti mikrosatelitům)

► (typ práce: malé riziko kontaminací, velké objemy)

Nevýhody

► živý materiál

► větší množství materiálu

► někdy omezená variabilita

► kódující oblast – ne vždy selekčně neutrální

► jedovatost

► (typ práce:citlivost na teplotu, pH, koncentrace - „chemická práce“)

25 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra

► 7 populací po 10 jedincích pro kultivační pokusy

► identifikace klonů → vyloučení pseudoreplikací

► 5 enzymových systémů (6PGDH, AAT, DIA, SOD, EST),6 alelicky hodnotitelných lokusů + celkový pattern u EST

► skórovány jak alely, tak celkové genotypy

26 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1

BOR 5 ABOR 6 ABOR 7 ABOR 8 ABOR 52 ABOR 55 ABOR 3 CBOR 9 CBOR 53 CBOR 54 H

BAL 43 ABAL 45 ABAL 56 BBAL 50 BBAL 49 B

27 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1 sod-1

BOR 7 A ABOR 5 A BBOR 8 A BBOR 55 A BBOR 6 A CBOR 52 A FBOR 3 C ABOR 9 C BBOR 53 C DBOR 54 H H

BAL 43 A BBAL 45 A BBAL 46 B BBAL 50 B BBAL 49 B B

28 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1 sod-1 aat-2

BOR 7 A A CBOR 5 A B ABOR 8 A B ABOR 55 A B ABOR 6 A C ABOR 52 A F CBOR 3 C A ABOR 9 C B ABOR 53 C D ABOR 54 H H A

BAL 43 A B ABAL 45 A B BBAL 46 B B ABAL 50 B B ABAL 49 B B A

29 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1 sod-1 aat-2 dia-1

BOR 7 A A C CBOR 5 A B A ABOR 8 A B A ABOR 55 A B A CBOR 6 A C A ABOR 52 A F C ABOR 3 C A A ABOR 9 C B A ABOR 53 C D A ABOR 54 H H A A

BAL 43 A B A ABAL 45 A B B CBAL 46 B B A EBAL 50 B B A EBAL 49 B B A C

30 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1 sod-1 aat-2 dia-1 dia-3

BOR 7 A A C C ABOR 5 A B A A BBOR 8 A B A A BBOR 55 A B A C BBOR 6 A C A A BBOR 52 A F C A ABOR 3 C A A A ABOR 9 C B A A BBOR 53 C D A A ABOR 54 H H A A A

BAL 43 A B A A ABAL 45 A B B C ABAL 46 B B A E CBAL 50 B B A E CBAL 49 B B A C C

31 / 71

Identifikace klonů

Košnar Jan et al., Carex nigra6pgdh-1 sod-1 aat-2 dia-1 dia-3 est-3

BOR 7 A A C C A BBOR 5 A B A A B ABOR 8 A B A A B ABOR 55 A B A C B ABOR 6 A C A A B ABOR 52 A F C A A ABOR 3 C A A A A ABOR 9 C B A A B EBOR 53 C D A A A BBOR 54 H H A A A A

BAL 43 A B A A A ABAL 45 A B B C A ABAL 46 B B A E C BBAL 50 B B A E C BBAL 49 B B A C C B

32 / 71

Identifikace klonů

Kyncl et al. 2006, Plant Ecology 186: 97-108

► demografie Spartocytisus supranubius na Tenerife

► vývoj populací, ohrožení králíky, …

► isozymy použity ke studiu klonální struktury populace

bíle: unikátní genotypy; šrafovaně: klony

33 / 71

Hybridizační pokusy

Hardy et al. 2001, Heredity 87: 136-145

► křížení diploidních a tetraploidních chrp z komplexu C. jacea – C. nigra

► rodičovští jedinci vybráni tak, aby se lišili

► ověření původu potomsta (autogamie vs. hybridizace vs. pylová kontaminace)

34 / 71

Reprodukční systém

Friedman & Barrett 2009, New Phytol. 181:489-497► 7 druhů ostřic (jednodomé, ale protogynie)► studován význam samoopylení (v rámci

lodyhy, v rámci trsu - geitonogamie)

► isozymy – dva variabilní lokusy, vyhodnocenív programu MLTR (odhad míry samoopylení)

► …a umělé opylování různým pylem apod.

► samoopylení je překvapivě časté, protogynie nestačí (opylení z jiné lodyhy v trsu, částečně překrývá zralost tyčinek a prašníků)

► možná pojistka proti nedostatku pylu

35 / 71

Reprodukční systém

Mandák et al. 2009, Biol. J. Linn Soc. 98: 596-607► Carduus acanthoides► jednoletý ruderál:

» teor. výhodná autogamie

» izolované populace

» nízká vnitro- a vyšší mezi-populační variabilita

► 6 enzymových systémů» počet alel, polymorfních lokusů, gen. distance

» F-statistika, mezipopulační diferenciace (GST)

» software TFPGA a FSTAT

► vyšlo to naopak → nízký inbreeding, self-incompatibility, snadné šíření semen,…

36 / 71

Mezidruhové rozdíly

Kaplan & Štěpánek 2003, Plant Syst. Evol. 239: 95-112

► Potamogeton pusillus agg.

► 9 enzymů, počítána genet. distance

► genetická podobnost jedinců a populací (cluster analysis), odpovídá morfologii» dobré druhy

► nízká variabilita v populacích» vegetativní rozmn.» autogamie

37 / 71

Mezidruhové rozdíly

Pedersen & Ehlers 2000, Plant Syst. Evol. 223: 173-183► autogamický Epipactis renzii v Dánsku► 9 isozymových systémů

» rozdělení alel do populací, F-statistiky» + data o rozšíření taxonů, repro. systém

► stejné alely jako místní E. helleborine (zatímco jiné druhy kruštíků odlišné)

► některé unikátní alely přítomny u obouv jedné směsné populaci

► velký inbreeding (autogamie) u E. renzii, u E. hell. jen v některých populacích

► recentní vznik z E. helleborine, opakovaně?► přechod k autogamii asi dán selekcí na

extrémním stanovišti (písečné duny)Epipactis renziihttp://www.guenther-blaich.de/

38 / 71

Hybridizace

Kaplan & Wolff 2004, Preslia 76: 141-161

► původ křížence Potamogeton ×schreberi

► morfologie, anatomie, isozymy (6 lokusů)» isozymy u rdestů v rámci druhu relativně málo variabilní, druhy

dobře odlišené

► zkoumán hybrid a 5 potenciálních rodičovských druhů

► kříženec P. natans × P. nodosus

► v daném říčním systému vznikl asi 1×, dále již vegetativní rozmnožování

39 / 71

Hybridizace

Mir et al. 2009, Plant Biol. 11: 213-226

► hybridizace Quercus ilex a Q. suber

► isozymy (3 enz., 18 alel) + cpDNA» frekvence alel

» hybrid index, F-statistiky, GST, linkage disequilibrium

► prokázána obousměrná hybridizace

► velký podíl morfologicky „čistých“jedinců, kteří jsou geneticky hybridi

► regionální rozdíly

40 / 71

Původ polyploidie

Hardy et al. 2000, New Phytol. 146: 281-290Hardy et al. 2001, Heredity 87: 136-145

► původ tetraploidní Centaurea jacea► hybridizace ABCD × CCCC, analýza potomstva, zastoupení

alel v potomstvu (2 test)

► v potomstvu všechny kombinace alel → náhodné párování chromosomů = tetrasomická dědičnost, autopolyploidie» u allopolyploidů (disomická dědičnost) by měly chybět

kombinace alel, které pochází od stejného předka

ad ac bc ad ab bd ad ad cd bc cd bc ab cd bc bc cd bd

41 / 71

Původ polyploidie

Mandáková & Münzbergová 2008, Plant Syst. Evol. 274: 155-170

► Srovnání diploidní a hexaploidní Aster amellus

► Morfologie, rozšíření, isozymy» frekvence alel (alelické, 0/1) » matice genetických vzdáleností →

cluster analysis, PCoA

► Hexaploidi jsou autopolyploidi» podobné alely (specifická a. vzácné)» homozygoti + různé typy vícealelických

heterozygotů, různé dávkování alel» není fixovaná heterozygozyta

► … ale jsou už izolovaní déle

42 / 71

Populační genetika

Šingliarová et al. 2008, Plant Syst. Evol. 275: 181-191

► Disjunktní areál Pilosella alpicola subsp. ullepitschii» velká a ± souvislá populace v Záp. Karpatech» izolované lokality v Rumunsku

► Odhad genetické diverzity - isozymy» různé míry genetické diverzity, počet

genotypů (klonů),…

» izolace populací (FST, GST), inbreeding

» odhad toku genů mezi populacemi

► rumunské populace navzájem izolované a geneticky zřetelně ochuzené

► málo specifických alel pro části areálu

► zřejmě dálkový přenos (pastva, turisti,…?) než rozpad areáluH. a. subsp. alpicola

43 / 71

Populační (invazní) genetika

Schachner et al. 2008, Am. J. Bot. 95: 1584-1595

► populační genetika Bromus tectorum» téměř striktně autogamický

» v Evropě malá variabilita v rámci regionu, rozdíly (specifické genotypy) mezi regiony

» téměř homozygotní linie

► v sekundárním areálu naopak:» větší diverzita i uvnitř populací = na

lokalitu postupně zavlečeno více genotypů

» mnohonásobné zavlečení

» vzácně hybridizace mezi liniemi → heterozygoti → potenciálně invazní genotypy

44 / 71

Populační (ochranářská) genetika

Gibson et al. 2008, Am. J. Bot. 95: 588-596

► porovnání Alnus serrulata (souvislý areál) a A. maritima (fragmentovaný areál)

► F-statistiky, diferenciace mezi popu-lacemi, odhad gene flow,…

► A. maritima má výrazně větší mezi-populační variabilitu» vznik asi fragmentací areálu

► pro praktickou ochranu třeba mítmateriál z více populací (aby se zachytila celková diverzita druhu)

45 / 71

Geografická variabilita

Liepelt et al. 2009, Review Paleobot. Palynol. 153: 139-149

► variabilita a šíření Abies alba (mtDNA, cpDNA, isozymy, palynologie)» podobnost populací (software BAPS), počet genotypů

► identifikace nových refugií, které nebyly vidět v mtDNA► postupné genetické ochuzování směrem k severu

46 / 71

Vyhodnocování allozymových dat

► Kodominantní data» Pro každý lokus a jedince přítomnost alel

» U polyploidů i počet kopií alel (AAAB vs. AABB vs. ABBB)

» Multilokusové genotypy

» Rovnocennost alel (změna z A na B je stejně pravděpodobná jako z A na C, vzdálenost alel na gelu se neuvažuje)

► Dominantní data» Pouze přítomnost / nepřítomnost alely

» Matice 0 / 1 přes všechny lokusy

» Ztráta informace, ale někdy nelze kodominantní data spolehlivě přečíst (zejména polyploidi)

47 / 71

Diverzita alel / lokusů► Počet alel (A)

» pro každý lokus, průměr přes všechny lokusy

► Allelic richnes» průměrný počet alel korigovaný na počet vzorků / populací (bootstrap

apod.)

► Podíl polymorfních lokusů (P)» málokdy, většinou pracujeme jen s polymorfními lokusy

► Shanonův index» diverzitní index, podobně jako v ekologii

pi = frekvence alely i; pro 1 lokus

» průměr přes všechny lokusy

► Clonal diversity» počet genotypů / počet jedinců v populaci

ii

i ppSH ln*

48 / 71

Heterozygosita v populaci

Pozorovaná heterozygozita► pro jeden lokus

i, j = alely, N = počet jedinců

► pro více lokusů

j,iNN

Hij

o

N

i

m

jij o H

NmH

1 1

1 N počet jedincům počet lokusůHij heterozygotnost jedince i

(0 nebo 1) pro lokus j

49 / 71

Očekávaná heterozygozita = gene diversity► předpoklad: populace v Hardy-Weinbergově rovnováze► pro jeden lokus

resp.

► pro více lokusů;

Heterozygosita v populaci

k

iie pH

1

21

k

iie p

NN

H1

2112

2

pravděpodobnost, že jedinec je pro danou alelu homozygot = frekvence homozygotů pro alelu

korekce na malé vzorky (N < 50)

m

l

k

iie p

mH

1 1

211

p frekvence alelyi,k i-tá alela z k alel v

lokusul,m lokus l z celkem m

lokusůN počet jedinců

50 / 71

► obvykle 3 úrovně variability» celková populace (celý druh)

» rozdíly mezi subpopulacemi (= dílčími populacemi)

» individuální variabilita uvnitř subpopulací

» lze zavést i další (region sdružující část subpopulací)

► většinou se uvažují pouze diploidi» pro vyšší ploidie nejsou výpočty obvykle k dispozici

» obecně nemá smysl srovnávat variabilitu (počet alel, polymorfní lokusy, heterozygosita,…) mezi ploidiemi

Fixační indexy

51 / 71

Fixační indexy

► základní model – populace v Hardy-Weinbergově rovnováze» při nekonečné populaci, náhodném páření, absenci selekce,… … frekvence

genotypů přímo závisí na frekvencích alel

» pro diploidy, dvě alely A, a, které mají frekvence p, q

frekv. (AA) = p2 frekv. (Aa) = 2pq frekv. (aa) = q2

p + q = 1 p2 + 2pq + q2 = 1

» … a to při libovolné frekvenci alel

♂ pq♀

p

q

p2pq

p q q2

52 / 71

Fixační indexy (F-statistika)

► inbreeding

► diferenciace do subpopulací

► celkový

S

ISIS

HHH

F

T

STST

HHH

F

T

ITIT

HHH

F

HI pozorovaná heterozygozita uvnitř subpopulace

HS očekávaná heterozygozita uvnitř subpopulace (z frekvencí alel v subspopulaci)

HT očekávaná heterozygozita v celkové populaci (z průměrných frekvencí alel přes všechny subpopulace)

► při HW rovnováze všechny koeficienty = 0, lze statisticky testovat

(1 - FIT) = (1 – FIS) * (1 - FST)

► měří rozdíl heterozygotnosti oproti HW rovnováze

53 / 71

FIS měří úbytek heterozygotů uvnitř subpopulace vlivem inbreedingu

případně přebytek vlivem selekce apod.

► rozsah hodnot <-1; 1>

-1 pouze heterozygoti

0 HW rovnováha

+1 pouze homozygoti

► pro jednotlivé subpopulace; vážený průměr přes subspopulace

Fixační indexy

S

ISIS

HHH

F

e

oeIS

HHH

F

54 / 71

FST měří vliv diferenciace na subpopulace, porovnává variabilitu (heterozygotnost) uvnitř subpopulací s celkovou variabilitou

GST coefficient of gene differentiation, odhad FST, v nejjednodušším případě a pro 1 lokus (gST):

► rozsah hodnot <0; 1>, stupeň diferenciace:

< 0.05 malá 0.15-0.25 velká

0.05-0.15 střední > 0.25 velmi velká

Fixační indexy

T

STST

HHH

G HSprůměrná očekávaná

heterozygozita (He) uvnitř subpopulací

HT , kde je průměr přes všechny

subpopulace

21 ip ip

55 / 71

Fixační indexy

► FST / GST je mírou diferenciace subpopulací:

žádná diferenciace velká diferenciace

► závisí na (vnitropopulační) variabilitě lokusu» nebere v úvahu identitu alel, není to distance

» pozor na velmi variabilní lokusy

T

STST

HHH

G

SST HG 1

HS = 0, GST = 1 HS ~1, GST ~ 0

56 / 71

► hodnoty FST závisí v reálných populacích také na migraci mezi subpopulacemi, rychlosti mutací,…» obvykle složitější vzorce než základní, beroucí v úvahu

efektivní velikost populace a migraci• island model• stepping stone model• isolation by distance

» specializované programy pro výpočet

Fixační indexy

57 / 71

Linkage disequilibrium

► nenáhodná segregace alel 2 různých lokusů

► některé kombinace častější / méně časté než při náhodném párování» výskyt na stejném chromosomu, obvykle blízko sebe (mezi

lokusy ± nedochází k rekombinaci)

» selekce ve prospěch určitých kombinací

» allopolyploidie

58 / 71

Linkage disequilibrium

► Pro 2 lokusy s 2 alelami:

lokus 2lokus 1 A2 B2alela frekv. q1 q2

A1 p1 x11 x12

p1q1 p1q2

B1 p2 x21 x22

p2q1 p2q2

D = x11x22 – x12x21

59 / 71

Distance

► Standard genetic distance (Nei)» identita

» distance

n

iiy

n

iix

n

iiyix

pp

ppI

1

2

1

2

1x,y populacepi frekvence alely i z n alel

pravděpodobnost, že 2 náhodně vybrané alely z populací x,y budou stejné

pravděpodobnost, že 2 náhodně vybrané alely z populace x, resp. y budou stejné

)ln(ID 12

12 2

x

ixx

NpNkorekce na malý počet vzorků,

analogicky pro populaci yunbiased distance

60 / 71

Distance

► Roger’s distance

m

j

n

iiyixR pp

md

1 1

2)(211

x,y populacepi frekvence alely i z n alel v lokusu jm počet lokusů

61 / 71

Distance► výsledkem je matice vzdáleností

» analýza hlavních koordinát, PCoA (principal coordinate analysis) = MDS (metric multidimensional scaling)

» shluková analýza (cluster analysis)• zejména metoda UPGMA

» neighbour-joining

► další metody vzácněji» maximum parsimony (multilocus genotypes); Tyler 2004, Melica» STRUCTURE; Chen et al. 2009, Ammopiptanthus mongolicus

62 / 71

PCoA

► ordinační metoda

► zobrazení objektů v ordinačním prostoru:» prvních několik os vysvětluje

nejvíce variability» euklidovské vzdálenosti

mezi objekty aproximací vzdáleností v původní matici

» podobná PCA, ale jakékoliv distance

(pro euklidovská distance řešení identické s PCA)

Mandáková & Münzbergová 2008Aster amellus, diploidi a hexaploidi

63 / 71

Shluková analýza

► obvykle algoritmus UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)» spojení dvou nejpodobnějších objektů v matici

» výpočet nové matice s n-1 objekty, skupina jako 1 objekt, počítána průměrná distance k jeho členům

» spojení dvou nejpodobnějších objektů

» nová matice

» …

» dendrogram

Kaplan & Štěpánek 2003Potamogeton pusillus

64 / 71

Neighbour-joining

► fenetická metoda (znaky mají stejnou váhu), podobně jako UPGMA

► nejčastější metoda na genetické distance (vč. dominantních dat)

► na rozdíl od shlukovacích metod nespojuje nejpodobnější objekty, ale hledá nejkratší strom

65 / 71

Neighbour-joining

1. matice distancí

2. hvězdicovitý stromA

B

C

D

E

66 / 71

Neighbour-joining

1. matice distancí

2. hvězdicovitý strom

3. pro každou dvojici bodů výpočet délky stromu za předpokladu, že tyto dva body budou vybrány jako nejbližší

» vložení dvou hypotetických uzlů• pro testovanou dvojici• pro zbytek

A

B

C

D

EA

B

C

D

E

atd.

67 / 71

Neighbour-joining

1. matice distancí

2. hvězdicovitý strom

3. pro každou dvojici bodů výpočet délky stromu za předpokladu, že tyto dva body budou vybrány jako nejbližší

4. vybrána ta dvojice, pro kterou vyjde nejnižší hodnota celkové délky

» nemusí to být nejbližší body

5. výpočet délky větví k vybraným bodům a nové výchozí délky stromu

D

A

B

C

E

68 / 71

Neighbour-joining

6. testování zbylých bodůC

A

B

D

EA

B

C

ED

A

B

C

D

E

69 / 71

Neighbour-joining

6. testování dvojic zbylých bodů

7. připojení nejbližšího bodu k již existující dvojici

8. výpočet délek větví a celkové délky stromu

… a tak pořád dokola

CA

B

D

E

… testování kvality stromu, obvykle metoda bootstrap:» náhodné nahrazení znaků» výpočet nového stromu» to celé min. 1000×» % nových stromů, kde shluk z původního stromu je přítomen

70 / 71

Neighbour-joining

► výsledkem nezakořeněný strom» délky větví odrážejí původní distance

» lze zakořenit, pokud je v analýze nějaký outgroup

Chen et al. 2009

Ammopiptanthus mongolicus

71 / 71

Software

POPGENEhttp://www.ualberta.ca/~fyeh/popgene.html

Arlequinhttp://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/

FSTAThttp://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm

GENEPOPhttp://genepop.curtin.edu.au/

TFPGA (Tools For Population Genetic Analyses)http://www.marksgeneticsoftware.net/tfpga.htm

MLTR (rozmnožovací systémy, ML analýza potomstva,…)http://genetics.forestry.ubc.ca/ritland/programs.html