Metody molekulární biologie

MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D.

Brno 2003

Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno

Genomika – studium genomu

1. Strukturální - identifikace genů - umístění genu na chromozomu (fyzické mapování) - stanovení nukleotidové sekvence genu

2. Komparativní - mezidruhové srovnávání, evoluční studie

3. Funkční (RNA genomika) - genová exprese (jak geny fungují)

4. Farmakogenomika - využití genetiky při vývoji vakcín

Proteomika – studium proteinů

Teorie• objev nových genů a proteinů• zkoumání mechanismu regulace eukaryontních genů• studium funkce proteinů• poznání evoluční historie eukar. genu (fylogenetické mapy)

Praxe• diagnostika původců infekčních onemocnění• diagnostika genetických chorob (mutace v DNA), léčba• farmaceutický průmysl – léky (př. inzulín pro diabetiky)• potravinářství (identifikace přídavků do potravin)• genové inženýrství (geneticky modifikované organismy)• soudní lékařství - kriminalistika (identifikace osob) - testování paternity a maternity• testování identity jedinců vzácných zvířat• ověřování rodokmenů zvířat

Využití metod molekulární biologie 

Metody molekulární biologieIzolace DNA

Materiál• tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny)• tkáně (vlasy, orgány) • organismy (bakterie, viry, kvasinky, paraziti, rostliny, hmyz)

• čerstvý/zmrazený/parafinovaný materiál

Postup• komerční kity (enzym - proteáza, pufry, kolonky), izolace 20 min•  fenol chloroformová extrakce  

1. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Fáze PCR• denaturace DNA• annealing – nasednutí primerů na komplementární úsek DNA• extension – napojování nukleotidů

Do reakce se dává• testovaná DNA • synteticky připravené primery (krátké úseky DNA)• nukleotidy ve formě trifosfátů (ATP, TTP, CTP, GTP)• enzym Taq polymeráza (z bakterie Thermus aquaticus)• pufr obsahující Mg2+ ionty

Metody molekulární biologie - klonování

Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého úseku DNA v přístroji „termocycler“ (K.Mullis, 1983)

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

1 cyklus PCR

Při 30 cyklech - amplifikace více než 109 kopií úseku DNA

denaturace annealing extension

94 – 95oC 50 - 60oC 72oC

Typy PCR

• Jednoduchá PCR

• Nested, semi-nested PCR

• Koamplifikační, multiplexová (comultiplex, multiplex PCR)

• Reversní transkripční PCR (RT-PCR)

• Semikvantitativní, kvantitativní PCR

- Komparativní (Q-PCR)

- Kompetitivní (QC-PCR)

- PCR v reálném čase (Real-time Q-PCR)

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Metody molekulární biologie - klonování2. Namnožení úseku DNA v bakteriích

Postup- rozštěpení vektoru restrikční endonukleázou- začlenění fragmentu DNA do vektoru DNA-ligázou (enzym) - začlenění plazmidu s fragmentem DNA do bakterie- po namnožení bakterie, lýza bakterii a uvolnění plazmidů- vyštěpení fragmentu DNA z plazmidů restrikční endonukleázou

Plazmidový klonovací vektor - malá kruhová molekula DNA (plazmid bakterie E.coli)- musí obsahovat replikační počátek- musí mít místo pro restrikční endonukleázu- musí mít gen pro rozlišitelnou vlastnost (rezistence k antibiotikům)

Genomová knihovna (chromozomální DNA)

Lidská DNA Fragmenty genomové DNA

Rekombinantní DNA

Genomová knihovna

Rozštěpení DNA restrikční endonukleázou

Inzerce DNA-fragmentů

do plasmidů

Vnesení plasmidů

do bakterií

cDNA knihovna (komplementární DNA)

- lýza buněk tkáně a izolace mRNA- pomoci enzymu reverzní transkriptáza přepis do sekvence DNA (cDNA= complementary, komplementární DNA)- naklonování molekul cDNA do plazmidových vektorů

Výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů !!!

Metody molekulární biologie

Gelová elektroforéza

Postup• příprava gelu – agarózový, polyakrylamidový gel •  obarvení vzorku – ethidium bromid, bromfenolova modř • nanesení vzorku na gel - nastavení napětí a doby elektroforézy •   zviditelnění fragmentů DNA - UV transluminátor

Princip Oddělení fragmentů DNA podle velikosti

Příklad výsledku gelové elektroforézy

1-7: pozitivní výsledek - amniové tekutiny gravidních žen (362 bp sekvence) 8: negativní kontrola9: pozitivní kontrola (362 bp sekvence T. gondii) 10: 50 bp velikostní standart (ladder)

Metody molekulární biologie

PCR/RFLP restriction fragment length polymorphism

Fáze • amplifikace specifického úseku DNA pomoci PCR• štěpení enzymem „restrikční endonukleáza“ při 37oC 1h• analýza štěpných fragmetů DNA na agarózovém gelu

HaeIII5´

3´

místo štěpení

RFLP

Restrikční mapy - fyzická mapa štěpných míst v DNA- studium polymorfismu mezi druhy, v rámci druhu mezi kmeny, skupinami (fingerprinting)- př. alfa-globinový gen (studium příbuznosti Ho a ostatních primátů)

Přehodnocování systematickéhozařazení jednotlivých organismů

Metody molekulární biologieSouthern blotting

Princip: přenos DNA (jednořetězcové) z gelu na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu na přístroji „vacuum blotter“

Postup: • štěpení DNA restrikční endonukleázou• elektroforéza• depurinace DNA v HCl, denaturace DNA v NaOH• Southern blotting (blotování) - pod vakuem 90 min. (3 vrstvy filtračního papíru, nylonová membrána, gumový rám, gel s DNA) - kapilární

Metody molekulární biologieHybridizace

Princip: Hybridizace = renaturace (proces obnovení vodíkových můstků mezi komplementárními bázemi), pomoci DNA sond se vyhledávají specifické nukleotidové sekvence.

DNA sonda: krátká jednořetězcová DNA (10-1000 nukleotidů), značena - radioaktivně (izotop 32P) - neradioaktivně (chemiluminiscence)

Postup: • uzavření membrány do plastikového sáčku spolu se značenou sondou• hybridizace (navázání sondy na komplementární úseky DNA)• vymytí membrány (odstranění nenavázané sondy)• detekce - autoradigrafie - detekční látky (hydrogen peroxid a luminol) – fotograf.film

Metody molekulární biologieElektroforéza, Southern blotting a hybridizace

Elektroforéza Souhthern blotting

Hybridizace sonda

nitrocelul. papír s DNA

autoradiograf

neznačená rozštěpená DNA

agarózový gel

alkalický roztok

nitrocel. papír

mycí houba

Metody molekulární biologieStanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)

• Enzymová metoda• Použití přístroje „sekvenátor“

Kompletní genom (údaje ke konci roku 2003)Eukaryota: 20 (Avena sativa, Glycine max, Hordeum vulgare, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Anopheles gambiae, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi, Guillardia theta, Sacharomyces cerevisiae, Plasmodium falciparum, Schizosacharomyces pombe)

Prokaryota: 17 (archebakterie), 128 (bakterie)

Viry: 1656

Genová banka NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Metody molekulární biologieStanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)

Genové inženýrství

Využití: 1. Výroba buněčných proteinů ve velkém množství (insulin,

růstový hormon, plášťové proteiny virů pro očkování….)2. Syntéza velkého množství RNA (studium proteosyntézy)3. Genová terapie4. Výzkum nových genů

Transgenní organismy – ve svém genomu obsahují nové geny, nebo geny pozměněné metodami rekombinantní DNA

Klonování zvířat – 1996 (ovce), 1998 (skot, myš, koza), 2000 (prase, muflon), 2001 (kočka, divoký tur gaur), 2002 (králík), 2003 (mula, divoký tur banteng) (zdroj časopis 21. století/ 8. číslo, www.osel.cz)