Jan.Machacek@vscht.cz

Ústav skla a keramiky VŠCHT Praha

+42- 0- 22044- 4151

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Optická (světelná) Mikroskopie pro TM I

Osnova přednášky

Typy klasických biologických a polarizačních mikroskopů

Přehled součástí polarizačního mikroskopu

Osvětlení, filtry

Clony, kondenzor

Objektivy, okuláry

Kompenzátory

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Technické vybavení - typy optických mikroskopů

biologické mikroskopy polarizační mikroskop

stereomikroskop

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

/Nikon/

Technické vybavení - polarizační mikroskopy na ÚSK

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

NIKON Eclipse

E400POL Jenapol Amplival

- další mikroskopy: Meopta 565, aj.

Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

- stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okulár

/microscopy primer/

Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

- stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okuláry

/microscopy primer/

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Dolní osvětlení - (diaskopické) - procházející světlo

- průhledné preparáty, výbrusy

/microscopy primer/

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Horní osvětlení - (episkopické) - odražené světlo

- neprůhledné preparáty, nábrusy, reliéf

- polopropustné zrcadlo

- objektiv je zároveň kondenzorem

/microscopy primer/

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Boční osvětlení - episkopické - odražené světlo

- zvýraznění morfologie povrchu

- lampa - (pro stereomikroskopy)

- vláknová optika - přenos světla svazkem vláken ale i kapalinou flexibilní osvětlení, vysoká intenzita

- LED kroužky na objektivy pokrytí 360°

/Olympus/

/Olympus/ /Edmund Optics/

Technické vybavení - zdroje světla

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Žárovky - s wolframovým vláknem - halogenové

- přibližuje se bodovému zdroji světla

- nízké stejnosměrné napětí (~ 20 V), velký proud, výkon kolem 100 W

- jednoduchá regulace intenzity potenciometrem - spojité barevné spektrum - barva světla se mění s teplotou vlákna - limitovaná životnost vlákna (1000 h)

/microscopy primer/

/microscopy primer/

Technické vybavení - zdroje světla

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

LED diody -

- bodový zdroj intenzivního bílého světla

- nízké stejnosměrné napětí

- zanedbatelné teplo

- regulace intenzity

- vysoká životnost (10000 h)

- sestavení plošných zdrojů

- více principů vzniku - 1) RGB míchání 2) fosforescence →

/Edmund Optics/

/wiki/

Technické vybavení - zdroje světla

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Výbojky - rtuťová, xenonová

- pro luminiscenční mikroskopy

- UV oblast, ale i blízké IČ

- monochromatické světlo (s filtry)

- nízká životnost (200 h)

/microscopy primer/

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Kolektorová čočka

- spojka, z bodového zdroje vytváří rovnoběžné paprsky světla

Polní (světelná) clona

- zužuje svazek světla, eliminace odlesků

- neslouží k regulaci intenzity světla

- obraz se ostře promítá do roviny předmětu

- okraj clony by se měl krýt s okrajem zorného pole

Filtry

- matový filtr - rozptyluje světlo - lepší homogenita

- neutrální filtr - snižuje intenzitu světla, spektrum nemění

- absorpční filtry - korekce barevného spektra např. modrý filtr pro žluté světlo žárovky → bílé světlo

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

- interferenční filtry - tenká vrstva, propustí úzký interval spektra

Polarizátor - polarizační filtr

- extrémně pleochroické látky, orientované polymerní molekuly

- poměrně nízká propustnost, cca 38%

- výklopný, otočný

- většinou předozadní rovina kmitu

Aperturní clona

- reguluje vstupní průměr kondenzoru (vrcholový úhel kužele paprsků vystupujících z kondenzoru)

- otevřená - vysoká rozlišovací schopnost, malý kontrast, malá hloubka o.

- zavřená - ohybové jevy na rozhraních, vysoký kontrast

- neslouží k regulaci osvětlení

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Kondenzor

- soustřeďuje světelné paprsky do preparátu

- numerická apertura (NA = 𝑛 sin 𝜃 ) větší či stejná jako u objektivu

- vlákno osvětlení se má ostře zobrazovat v rovině aperturní clony

- kondenzory pro fázový kontrast a temné pole

/microscopy primer/

Technické vybavení - osvětlení

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Köhlerův princip osvětlení

- nejčastější způsob osvětlení

- roviny, kde dochází k ostrému zobrazení předmětu a vlákna

- roviny zobrazení vlákna lze pozorovat po vyjmutí okuláru nebo zasunutím Bertrandovy čočky

/microscopy primer/

Technické vybavení - stolek, stativ

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Otočný stolek

- dělení na 360°, nonium 0,1°,

- aretace šroubem, někdy centrovatelný

- křížový vodič se stupnicí

- přítlačné pružiny

- motorizovaný z-posuv, automatické ostření

Zaostřování

- šroub na hrubé a jemné ostření, mikrometrická stupnice

- zaostřuje se zásadně zdola - tubus se postupně zvedá

Držák objektivů

- sáňkový, revolverový - 5 objektivů

- centrovatelný, centrace se provádí iterativně

Technické vybavení - stolek, stativ

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Zaostřování - test zručnosti - měření tloušťky vzorku, indexu lomu

Technické vybavení - objektivy

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Objektivy

- nejdůležitější součást mikroskopu - určuje kvalitu obrazu - rozdělení suché × imerzní (I) - konstrukce →

charakteristiky:

- výrobce - Nikon, Olympus, aj. - korekce objektivu - Plan, Apo, aj. - zvětšení 𝑍0 (4x – 100x)

tj. ohnisk. vzdálenost (1,5 – > 20 mm) - numerická apertura - NA = 𝑛 ⋅ sin 𝛼, 𝛼 je polovina

vstupního úhlu - délka tubusu v mm, ∝ pro nekonečnou optiku

- tloušťka krycího skla, 0 pro preparáty bez skla - polarizační objektiv - (Pol, P) - menší počet čoček, nesmí být napětí - ovlivňuje dvojlom

/microscopy primer/

Technické vybavení - objektivy

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

- rozlišení objektivu: 𝑑 =𝜆

NA, 𝜆 je vlnová délka světla

Korigované optické vady:

- Aplanát – korigovaná sférická vada a koma

- Anastigmát – korigován astigmatismus

- Ortoskopický objektiv – korigováno zkreslení

- Achromát – sférická vada a longitudinální chromatická vada pro 2λ (žlutá a zelená oblast)

- Planachromát – navíc zklenutí zorného pole (vhodný pro mikrofotografii)

- Apochromát – longitudinální chromatická vada pro 3λ

- Planapochromát – má navíc odstraněno zklenutí

Technické vybavení - objektivy

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Imerzní objektivy:

- zvýšení numerické apertury (>1)

- eliminace totálního odrazu, vyšší rozlišení - více detailů

- imerze - vysoký index lomu - bromnaftalen (1,658), methylenjodid (1,740)

/microscopy primer/

Technické vybavení - okulár

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

/microscopy primer/

Okulár

- zvětšuje obraz vytvořený objektivem včetně vad

- zvětšení 10x - 20x

- nejčastěji Huygensův okulár (dvě spojky, obr. rovina mezi)

- kompenzační okuláry - vyrovnávají vady objektivů

- nitkový kříž, příp. stupnice

- kamerový adaptér C-mount

Technické vybavení - kompenzátory

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

- slídová destička - původně planparalelní lupínek muskovitu, kolmý k ostré středné, nyní křemen, fázové zpoždění je 1/4𝜆 (~150 nm)

- sádrovcová destička - nyní křemen, fázové zpoždění je 1𝜆,

červenofialová barva I. řádu (~560 nm)

- křemenný klín - klín vybroušený z křišťálu rovnoběžně s optickou osou plynulá změna fázového zpoždění, I. - III. řád

- Berekův kompenzátor - destička kalcitu, řez kolmo k ose c, nulový dvojlom, otáčením dojde ke změně fázového zpoždění, 4 řády

- Sénarmontův kompenzátor - polarizátor s 1/4𝜆 destičkou

otočenou o 45°

- Bertrandova čočka - spojná čočka - umožňuje pozorování: konoskopické obrázky, vlákno osvětlení, zadní ohnisková rovina objektivu, aperturní clona

- Analyzátor - otočný polarizátor se stupnicí

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

Prevence

- chránit před kontaminací prachem, otisky prstů, zbytky vzorků

- chránit před mechanickým (hrubé zacházení), chemickým (leptání) a tepelným poškozením (degradace filtrů)

Údržba

- servis, mazání a čištění mechanických dílů

- čištění optických dílů

Literatura: M. Zölffel, The clean microscope, Zeiss.

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

čistý mikroskop (vlevo), špína v místě polní clony (vpravo nahoře), prach na čipu kamery (vpravo dole)

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

1. roztok detergentu,

2. líh, ether, n-hexan, aj. (pozor na leptání tmelů!)

2. špejle

3. balónek

4. vata, mikrovlákna

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

příprava vatových tamponů

Údržba mikroskopu

4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I

správné čištění čoček