Odběr vzorků

Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách

Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity

Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra

Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus

Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace

Podle nároků na výživu dělíme bakterie :

Autotrofní - zdrojem jsou anorganické látky (zdroj uhlíku CO2, zdroj dusíku N2, NH4+, NO3- )

Heterotrofní - zdrojem jsou organické látky, a to :

a) prototrofní (jednoduché org.látky - ethanol, sacharidy a p.)

b) auxotrofní (vyžadují složité org.látky - např. vitaminy,

nukleotidy a p.)

Velká většina mikroorganismů je chemoorganotrofní

chemoorganotrofie- Zdrojem energie je oxidace redukované

organické látky. Tato látka je současně zdrojem uhlíku.

Zdroj uhlíku a energie. A) komplexní

B) definovaný

Metody stanovení mikroorganismů

Kultivační: kvalitativní, kvantitativní (tuhé půdy, MPA)

Mikroskopické

Rychlé metody: biofyzikální

biochemické

imunochemické

molekulárně biologické

kvantitativní

Tuhé půdy : universální

selektivní diagnostické

MPA : most probably number

kvalitativní

Selektivní pomnožení

Potvrzující testy:

biochemické

sérologické

Rychlé metody stanovení

Mikroskopické metody

přímé

epifluorescenční

po filtraci

Biochemické a biofyzikální

Imunochemické

Molekulární genetiky

Kultivační metody

• Umožňují udržení mikroorganismů (MO) v živém stavu, jejich růst a množení na živné půdě

• Pro detekci patogenů v potravinách využívány již déle než sto let

• Dodnes představují základ téměř všech metod pro zjišťování patogenů v potravinách

Obecná ustanovení

• Každé vyšetřeni, fyzikální, chemické či mikrobiologické, začíná odběrem vzorků.

• Na odběr vzorků bezprostředně navazuje jeho přeprava, uchovávání a zpracování v laboratoři.

• Vždy je třeba mít na paměti, že způsob odběru a přípravy vzorků může významně ovlivnit výsledky provedeného vyšetřeni.

Legislativa • ČSN ISO 7218 – Všeobecné pokyny pro

mikrobiologické zkoušení

• ČSN 56 0100 – Mikrobiologické zkoušení poživatin, předmětů běžného užívání a prostředí potravinářských provozoven

• ČSN 56 0080 – Způsob odběru vzorků pro mikrobiologické zkoušení

• Vyhláška MZČR 252/2004 Sb. (voda)

• ČSN ISO 5667 - Jakost vod

• Nařízení komise (ES) č. 1441/2007 (č.2073/2005)

Typy rozborů

Provozní

Jakostní a hygienické

Cílené

Odběr vzorků

• Při preventivní soustavné a namátkové kontrole

hygienické a jakostní nezávadnosti, plnohodnotnosti, trvanlivosti a uchovatelnosti surovin, polotovarů a hotových výrobků

• Posuzování správnosti technologických postupů

• Posuzování úrovně hygieny a sanitace

• Stížnosti na jakost a uchovatelnost

• Vzniku onemocnění z poživatin a PBU

Postup mikrobiální analýzy

• Odběr vzorků

• Transport

• Příprava ke zkoušení

• - dokumentace

• - dekontaminace obalů

• - otevírání

• - navážky

• - ředění

Vzorek • jednotka výrobku, suroviny nebo jiného

zkoušeneho materiálu:

• originalni spotřebitelske baleni,

• určitý počet kusů u kusovych výrobků

• určitá hmotnost (objem) u nekusových výrobků a surovin.

Pro mikrobiologické vyšetřeni se nejčastěji odebirají vzorky výchozich surovin, pomocných látek, fázové vzorky v průběhu výroby, dále stěry z provozní zařízení, hotové výrobky či skladované potraviny

Vzorkovaná jednotka

• 1 velkoobchodni originalni baleni (karton, bedna, balík, pytel, paleta atd.),

• 1 upravený celek, jde-li o kusové produkty,

• celá zásilka, jde-li o sypané či jiné volně ložené produkty (odebírá se 5 vzorků z různých částí zásilky),

• 1 nádrž, tank, konev či jiná nádoba, jde-li o produkty tekuté

Odběr vzorků

• Senzorické hodnocení (vzhled, vůně)

• Rozdělení do tří kategorií

• Nejdříve odběr vzorků pro mikrobiologické zkoušení!!!!!!

• Odběr jednotlivých vzorků směsné či průměrné

• Pozor na množství vzorku!!!!!!

Odběr vzorků

Odběr vzorků provádí tzv. oprávněná osoba,

která je:

• seznámena se zásadami správného vzorkování

• nese zodpovědnost za správnost provedení odběru

Odběr vzorků

• Kdo? – oprávněná osoba • Jak hodnotit? Senzorika bez ?????? • 1) výrobky, které nemají zjevnou mikrobiální

kontaminaci • 2) výrobky podezřelé vykazují známky způsobené

možnou mikrobiální kontaminací- voda, plyn

• 3) výrobky zkažené, se zjevnými známkami mikrobiálního kažení- osliznutí, hnití, plesnivění, kysání, kvašení, změna barvy apod.

(Tato skupina vzorků se běžně pro kontrolní účely mikrobiologicky nevyšetřuje).

Vzorkování v rámci výkonu státního zdravotního dozoru

Náhodný výběr jednoho vzorku ze vzorkovaného celku (určitý pokrm) Cílený odběr se provádí v případech EPI souvislosti Odděleně se vzorkují: součástí pokrmu suroviny rozpracované pokrmy a polotovary

Vzorkování v rámci výkonu státního zdravotního dozoru

Vzorek je: • Podávaná porce • Kusový výrobek (při odběru vzorků na průkaz bakteriálních toxinů se odebere větší množství vzorku) U vícesložkových pokrmů lze odebrat všechny součásti v poměru, v jakém jsou zastoupeny nebo odděleně jako několik vzorků

Odběr vzorků

• Při úřední kontrole – tj. hodnocení, zda daná šarže (dávka) odpovídá stanoveným mikrobiologickým požadavkům, se odebírá zpravidla 5 vzorků.

• U vybraných skupin výrobků může byt tento počet ještě vyšší (upravuje platná evropská legislativa týkající se mikrobiologických kritérií pro potraviny).

Odběr nekusových vzorků

Pokud není odebíráno celé spotřebitelské balení, musí být ke vzorkování použito výhradně:

• sterilní náčiní z korozivzdorné oceli (sondy, nebozezy, naběračky, lžíce, nože, pinzety, atd.)

• skla (pipety), které se předem balí do

• hliníkové fólie a sterilizují v horkovzdušném

sterilizátoru či autoklávu.

• kovové nástroje lze při odběru průběžně sterilizovat 70% etanolem a opálením v plameni.

Odběr nekusových vzorků

Vzorky se odebírají do sterilních, dostatečně

velkých nádob či obalů

• prachovnic se zabroušenou zátkou

• zavařovacích sklenic s uzávěrem „twist off“

• fólií (alobal)

• polyetylénových sáčků

• sterilního nepropustného papíru.

Hmotnost odebíraných vzorků

Odebraný počet vzorků musí vystihovat celou

vyšetřovanou partii tak, aby bylo možno posoudit povahu, stupeň a rozsah mikrobiálního znečištění.

Při odběru vzorků pro mikrobiologické vyšetření se neodebírají vzorky průměrné (tj.směsné).

Hmotnost odebraného vzorku

musí být dostatečná pro provedení všech předepsaných vyšetření Odebíráme-li vzorek výrobku ve spotřebitelském balení, potom: a) odebereme 1 spotřebitelské balení, pokud jeho hmotnost (objem) dosahuje požadované hmotnosti;

b) pokud hmotnost (objem) spotřebitelského balení výrazně převyšuje potřebné množství, stačí odebrat jako vzorek poměrnou část spotřebitelského balení, nesmí tím však být ohroženo dosažení účelu vyšetření; c) pokud hmotnost (objem) spotřebitelského balení je nižší než požadované množství, odebereme potřebný počet spotřebitelských balení

Potřebná množství vzorků pro mikrobiologické vyšetření.

Druh vzorku Množství tekuté 300 ml koncentráty 150 g kašovité 250 g vejce 3 ks pevné 300 g drůbež 1 ks sušené 150 g pitná voda 500 ml

Odběr vzorků závisí na balení a konsistenci vzorku

• nejméně 1 kus u výrobků ve spotřebitelském balení nejméně však podle charakteru vzorku 150-250 g (ml);

• až 500 g(ml) u tekutých, kašovitých, sypkých a malých kusových výrobků

• 500-1000g(ml) výrobků ve velkých kusech nebo velkých baleních jednotkách.

Způsob odběru • tekuté a kašovité promíchat, u vyšších objemů

odběr ze tří vrstev

• sypké promíchat, velké objemy z různých míst

• střední a velké kusové výrobky:

– odkrojení

– odřezání z hloubky

– použití vzorkovače

ASEPTICKÁ PRÁCE!!!!!!!!

Označování vzorků

• O odběru musí být vyhotoven protokol o odběru vzorků.

• Současně se vyplní žádanka o laboratorní vyšetření, ve které je nutno specifikovat, jaká konkrétní vyšetření mají být u vzorku provedena.

Protokol o odběru vzorků • Číslo protokolu o odběru vzorků

• Účel mikrobiologického rozboru • Místo, datum, hodina odběru • Přesný název vzorkovaných výrobků (druh, typ obalu,

hmotnost) • Název výrobce, datum (hodina) výroby • Název dodavatele, datum dodávky • Posouzení vnějšího vzhledu, obalů, závady • Způsob, počet, hmotnost odebraných vzorků • Adresa institucí, kterým budou sděleny výsledky • Způsob úchovy vzorků do doby mikrobiologického

rozboru • Jména a příjmení, funkce a podpisy osob, které odběr

prováděly a které byly odběru přítomny

Přeprava vzorků Zvláštní pozornost musí být věnována zachování doporučených teplot úchovy v

průběhu přepravy jednotlivých druhů vzorků:

• stabilní výrobky - okolní teplota

• čerstvé a chlazené výrobky - rozmezí teplot 0-4oC

• zmrazené a hlubokozmrazené výrobky - teploty pod -18 oC

• pasterované a podobné výrobky - rozmezí teplot 0-4 oC

• zkažené jednotky stabilních výrobků - rozmezí teplot 0-4 oC

• rychle se kazící potraviny - např. vnitřnosti, čerstvé ryby musí být při přepravě uchovávány při teplotě v rozmezí 0-2 oC

Transport

• mrazené výrobky v isotermických obalech

• Konzervy - nemrazit obsah - pokojová teplota

• ostatní vzorky při 5oC

• maximální doba přepravy 6 hodin

Příjem a uchovávání vzorků v laboratoři

Při příjmu vzorků v laboratoři se:

• posoudí jejich stav

• zkontroluje se, zda souhlasí údaje uvedené v průvodní dokumentaci

• provede se záznam o příjmu vzorků do laboratorního deníku.

Obecně musí být o vzorcích přijatých do laboratoře vedena dokumentace tak, aby byl monitorován jejich postup od okamžiku přijetí až do doby zpracování protokolu o výsledku zkoušení.

Typy vzorkování

Základem vzorkování je vytvoření vzorkovacího plánu, podle kterého bude sledovaný soubor potravinářských výrobků sledován.

Komplexní plán musí obsahovat následující prvky:

a) Jaký mikrob nebo skupina mikrobů bude sledovaná;

b) Počet testovaných vzorků (n);

c) Testovací metoda (metody);

d) Mikrobiální limit (y); m & M

- přijatelný (< m) - mezní hodnota (>m a > _ M)

- nepřijatelná hodnota (>M)

e) Počet vzorků spadajících do shora uvedených kategorií

Pro vzorkování užívané v mikrobiologii se užívá dvouparametrický a tříparametrický plán.

Podle těchto schemat se ze zkoumaného souboru odebírá dané množství vzorků.

Zápis do laboratorního deníku musí obsahovat

• pořadové číslo záznamu

• datum a hodinu příjmu vzorků

• druh, množství a charakteristiku vzorků

• údaje o vzorkování (datum, způsob vzorkování, konzervace, atd.)

• jméno a adresu majitele vzorků

• datum a hodinu zahájení rozboru

• požadovaný rozsah vyšetření vzorků

• způsob přípravy vzorků k rozboru (hmotnost

• navážek a stupeň ředění, zjištěné mikrobiologické ukazatele)

• jméno osoby, která vyšetření provedla

• případně další nezbytné údaje.

Příprava vzorku k rozboru

• - dokumentace

• - dekontaminace

• - příprava navážek

• - zřeďování vzorků

Dokumentace

Protokol o odběru

Laboratorní deník:

• - datum a hodina příjmu

• - datum event. hodina zahájení rozboru

• - testované ukazatele

• - počet vzorků

• - způsob přípravy vzorku (množství, ředění)

Protokol o odběru

• číslo

• místo

• datum

• hodina

• způsob

• údaje o výrobku

• konrétní osoba

• podpisy

Protokol o rozboru

• - senzorické hodnocení

• - živné půdy

• - způsob očkování

• - teplota a doba inkubace

• - vyhodnocení výsledků

• - závěr

Dekontaminace obalů

• Hermetické obaly (sklo, kov, plast)

• -odstranění

• -omytí detergentem

• -oplach čistou vodou

• -osušení

• Nehermetické obaly

• - otření sterilním tamponem s ethanolem

Kontrola hermetičnosti

• plechovka se ponoří do vody cca 85oC na 5-7 min

• plechovka se ponoří do převařené, schlazené vody (var. 15 min) v exikátoru

• skleněné obaly: filtrační papír kolem uzávěru

Zmrazené výrobky

• 18 hodin při teplotě 2-5oC

• 15 minut při teplotě 35oC

Zpracování vzorku

• Do 3 hodin

• Do 24 hodin

• Do 48 hodin

• Skladování!!!!

Zřeďování vzorků

• fysiologický roztok s peptonem (0,85%NaCl + 0,1%peptonu, pH 7)

• Pozor Chladový šok

• Teplota zřeďovacího = teplota navážky

• tuky 37oC psychrofilní, 40-45oC ostatní

• Hypertonické roztoky – bez NaCl

• Halofilni, osmofilní – zvýšený obsah NaCl

Zřeďování vzorků

• Výchozí ředění

• Tekuté, tuhé-nerozpustné 1:9

• Tuhé rozpustné 1:10

• Botnající 1:9, sterilní olej a poté ředící roztok

• Ojedinělé mikroorganismy

- bez ředění

Tekuté, filtrovatelné – membránová filtrace

DOBA MANIPULACE SE VZORKEM: 30 minut!!!!!

Deskové metody

a) Zalévání do pevných půd

2 misky, 1 ml vzorku, vytemperovaná půda, 4-5mm vrstva rozmíchat!!!!!!

b) Roztěr na povrch půd

2 misky, předsoušení půd, 0,1-0,2 ml vzorku

Membránová filtrace

• Vzorky s malým množstvím resuspendovaných částic se filtrují nejdříve přes filtr o průměru porů 4µm

• Podle zjišťované skupiny mikroorganismů přes filtr : bakterie 0,3 µm