Proteomika II

PROTEINJ. J. Berzelius 1838

Proteios

PROTEOMIKAMarc Wilkins 1994

PROTEOMKompletní sada bílkovin p ítomných v daném okamžiku v bu ce,

nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemnéinterakce, lokalizaci a metabolický obrat.

PROTEOMIKA• kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin

organely, bun né linie, tkán nebo organismu• kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomu za r zných

podmínek

Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiemkompletní bílkovinné sít bu ky, spíše než studiem

jednotlivých protein .

Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zárovepochopit jejich funkci a strukturu a vytvo it 3D mapu bu ky

(ur it lokalizaci jednotlivých bílkovin).

Cíle proteomiky

• nelze ur it funkci proteinu na základ sekvence DNA nebo mRNA

• nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu

• 200 typ posttransla ních modifikací

• existuje alternativní translace

• !!!! špatná korelace hladin mRNA a skute ných hladin bílkovin !!!

PRO PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU ?

PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁ EJÍ FENOTYP !

Pro proteomika když máme genomiku?

Jeden gen, mnoho bílkovin

Schéma sou asné proteomiky

Základní schéma analýzy užívané vproteomice

Sm sprotein

Jednotlivéproteiny

Peptidy

Hmotnostníspektra peptid

Identifikaceprotein

1. Separace2D-PAGE

2. IzolaceŠt pení trypsinem

3. Hmotnostní analýzaHmotnostní spekroskopie

5. Porovnání sdatabází

4. Sekven ní analýzaFragmentace peptid

Sekvence peptid

Metody využívané sou asnouMetody využívané sou asnou proteomikouproteomikoupro studium proteinpro studium protein

1. Dvoudimenzionální elektroforéza

Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva dopravaa pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol .

2D gelová elekroforézaProteiny jsou rozd leny podle náboje (izoelektrický bod) v prvním rozm ru

a velikosti (migrace) ve druhém rozm ru

1. Rozd lení podle izoelektrického bodu (pI) v pH gradientu

i pH nižším než pI se protein pohybuje k negativn nabitému konci

i pH vyšším než pI se protein pohybuje k pozitivn nabitému konci

Protein se zastaví p i pH stejném jako jeho pI

2. Rozd lení podle velikosti v polyakrylamidovém gelu (PAGE)

Denaturace pomocí sodium dodecyl sulfátu (SDS-PAGE); SDS se naváže naprotein, má negativní náboj

Aplikace elektrického pole v 90°

Polyakrylamid tvo í síto; migrace protein dle velikosti

3. Zviditeln ní

Silver nebo Coomassie barvení

2D gelová elektroforézaRozd lí sou asn stovky i tisíce protein

Proteiny jsou rozprost eny na ploše

2. Rentgenová krystalografie

Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnové délce.Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istého

proteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví se jakour itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazci obsahuje

informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.

Rentgenová krystalografie(X-ray crystallography)

• je metoda založena na vychýlenírentgenových paprsk po dopadu nakrystal proteinu

• používá se na ur ení trojrozm rnéstruktury protein

Rentgenová krystalografie

3. NMR - spektroskopie

Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence.Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat

a ur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly.V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymucelulázy . Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídající

rozmíst ní skvrn je v ásti (B).

1 5 5 0 1 5 5 5 1 5 6 0 1 5 6 5 1 5 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 5 5 7 .7

1 5 5 8 .6

1 5 5 9 .61 5 6 0 .6

1 5 6 3 .8

1 5 6 2 .6

1 5 6 1 .6

Inte

nsity

[%]

M a s s /C h a rg e

4. Hmotnostní spektroskopie

Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda prour ování hmotnosti molekul a jejich ástí.

Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm simolekul a iont separuje nabité ástice podle jejich efektivníhmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje jestanovit.

Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejnéhmotnosti v celkovém množství iont ve sm si.

Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristickýpro danou látku a dává cenné informace o její struktu e a na jehozáklad lze v tšinou strukturu látky odvodit nebo potvrdit.

Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovatlátky v množství kolem 10 9 g.

Hmotnostní spektroskopie (MS)Analýza hmotnosti iont Identifikace neznámé slou eniny

Izolované proteiny jsou trypsinem št peny na peptidy

Peptidy jsou analyzovány pomocí MALDI-TOF hmotnostníhospektroskopu (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-

flight)Princip metody: peptidy jsou umíst ny na matrix; vytvo í krystaly; jsouionizovány pomocí laseru; nár st nap tí matrix zp sobí vyražení iontu protidetektoru; m í se as, než ion dorazí k detektoru (je závislý na hmotnosti

iontu- ím v tší hmotnost tím delší as letu)

Hmotnostní spektra neznámých peptid jsou dále analyzovány pomocí metodyzvané peptide mass fingerprinting (PMF)

Princip metody: zjišt ná hmotnostní spektra jsou in silico porovnány sgenomem; po íta ový program p enese informace z genomu do protein ,teoreticky je našt pí na peptidy a vypo ítá jejich hmotnostní spektra; pakporovná hmotnostní spektra neznámých peptid se spektry všech peptid ,

které kóduje genom

Hmotnostní spektroskopie protein (MALDI-TOF)

Aplikace proteomiky v medicín(proteomika nemocí)

Vývoj nových lék

Biomarkery nemocí

Exprese protein u nemocíÚloha protein vevzniku nemocí

Detekce protein vznikajících b hemnemoci je využita k diagnóze

Alzheimerova choroba (amyloid )Srde ní onemocn ní (interleukin-6 a 8, sérový

amyloid A, fibrinogen, troponiny)Renální bun ní karcinom

(karbonanhydrasa IX)

Informace o proteinech zp sobující onemocn ní jevyužita pro vývoj nových lék

1. Známá 3D struktura proteinu-po íta ová simulace-hledáníléku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa)

2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývojindividuálních lék

Úloha protein ve vzniku nemocí

Alzheimerova choroba (AD)Neurodegenerativní onemocn ní charakterizované ztrátou

neuron a synapsíNeuropatologické znaky jsou amyloid ß v senilních placích a neufibrilární

vlákna intracelulárn

Oxida ní stres

Nerovnováha mezi tvorbou volných radikál a antioxida ním systémem

sledky:

Oxidace protein , lipid , DNA a cukr

Oxidace protein

Št pení peptidovéhoet zce

(Karbonyly protein )

Oxidace Ak zbytk

(Nitrotyrosin)

Navázání produktperoxidace lipid i

glykoxidace

Schéma pokusu

Výsledek

Potvrzení úlohy oxida ního stresu u Alzheimerovy chorobyPosttransla ní modifikace protein v mozku navozená oxida ním poškozením

ispívá k rozvoji ADIdentifikace poškozených protein , které jsou potenciální cíle pro lé bu

Úloha protein ve vzniku nemocí

Biomarkery nemocí

Plasmatické biomarkery u AD

Diagnóza AD

Klinické projevy+post mortem (histologie)

Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina-CSF sešpatn získává)

Periferní krev

Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den

Plasma by mohla být zdroj biomarker

Identifikace diagnostických biomarker v periferní krvi

za pomocí proteomiky:

Vzorky krve pacient s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí

2D gelové elektroforézy

Byly identifikovány body, které se lišily u pacient a kontrol

Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

Výsledek15 bod signifikantn odlišných u nemocných a kontrol

Analýza pomocí MS: nap . α2 makroglobulin, komplement faktor H

Vývoj nových lék

Informace o proteomu vedou k identifikaci protein zp sobující onemocn ní

1. Po íta ový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových lék

Nap . protein zp sobující onemocn ní-3D struktura-po íta vyvine látku, kteráho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym)

2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-po íta vyvine individuální lék,

který je efektivn jší

Virtual ligandscreening

HIV 1-proteasa

Št pí HIV protein na menší funk ní proteiny;virus nep ežije bez tohoto enzymu

(nejvýznamn jší cíl lé by HIV)

Transverzální ezst edním mozkem,

kde je dob e viditelnásubstantia nigra

Substantia nigra

Zúžená substantia nigra,jak ji m žeme vid t uParkinsonovy choroby

B

Alpha-synuclein je 14 kDa protein, který je ve velké mí e exprimován v r znýchástech mozku, a který se ú astní patofyziologie n kterých neurodegenerativních

onemocn ní. P i t chto onemocn ních postupn zanikají n které populace nervovýchbun k, což je spojeno s velmi vážnými psychickými a neurologickými p íznaky.Projevují se ztrátou pam ti a rozumových schopností, poruchami chování, astoi halucinacemi, bludy a celkovým úpadkem osobnosti. Neurologické projevy se týkajíp edevším správné koordinace a ízení pohybu a e i.

V nativní form je alpha –synuclein nestrukturovaný(angl. unfolded) a svou fibrilárnístrukturu získává teprve ažagregací.

E

Amfipatická oblast Centrální doména Kyselá oblast

E

Amfipatická oblast Centrální doména Kyselá oblast

Faktory, kterFaktory, kteréé urychlujurychlujíí agregaciagregaci alphaalpha--synucleinusynucleinu::

P ítomnost mutací - A30P, A53T a E46K mutované proteinyvytvá í fibrilární struktury rychleji než wt protein.

Zkrácené „verze protein “ (angl. truncation) - zkrácený alpha-synuclein, který obsahuje pouze 120 resp. 108 aminokyselin je

mnohem více náchyln jší k tvorb filament in vitro než celý (angl.full-length) protein.

Koncentrace proteinu.

Interakce s ionty, p ípadn s jinými látkami.

P ídavek malého množství agregátu alpha-synucleinu k nativníform tohoto proteinu.

Normální protein(Monomer)

Abnormální protein(Agregát)

Protofibrily

Póry

Amyloidní fibrily

Jak?

Neurodegenerace a onemocn ní

A B

AgregaceAgregace alphaalpha--synucleinusynucleinu

Avidin je glykoprotein tetramerní strukturyo molekulové hmotnosti 66 kDa a nachází se vevaje ném bílku pták , plaz a obojživelník .Jeho neglykosylovaný homologstreptavidin, který je produkován bakteriíStreptomyces avidinii, má velice podobnoumolekulární hmotnost a stejn jako avidin tvo ítetramer. Narozdíl od avidinu není bazický aneobsahuje žádnou sirnou aminokyselinu(kdežto u avidinu se nachází jedna disulfidickávazba a dva methioniny). Jejich kvarternístrukturu tvo í ty i identické podjednotky, znichž každá má velmi vysokou afinituk vitamínu biotinu.

Oba dva tyto proteiny nalezly široké uplatn ní v afinitních separacích,diagnostických stanoveních a v celé ad dalších aplikací, které jsou založené na(strept)avidin-biotin technologii

((StreptStrept))avidinavidinSonda Vazebnýligand

CílovýligandBiotin APLIKACEAPLIKACE

((StreptStrept))avidinavidinSondaSonda Vazebnýligand

CílovýligandBiotin APLIKACEAPLIKACE

Protein MutS je termostabilní molekula jejíž velikost sepohybuje kolem 90 kDa. Je sou ástí tzv. MMR systému(systém oprav chybného párování bází) a hraje velmivýznamnou úlohu v repara ním systému DNA uprokaryotických i eukaryotických bun k, kde rozpoznávánespárované nebo nesprávn párované báze v dvoušrouboviciDNA.

Homology proteinu MutS m žeme nalézt tém vevšech organismech. Eukaryotické genomy obsahujín kolikanásobné mutS homologní (msh) geny as výjimkou mitochondriálního proteinu MSH1, tvo ívšechny ostatní eukaryotické proteiny MutSheterodimery.

SystSystéém opravy chybnm opravy chybnéého pho páárovrováánníí bbáázzíí uusavcsavc je vje v mnoha ohledech stejný jako umnoha ohledech stejný jako u

bakteribakteriíí..

Proteomika studuje proteiny, hlavn jejich strukturu, funkcia interakce

Genom byl již zmapován, nyní je na ad proteom (milionyprotein )

Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezizákladní pat í 2D gelová elektroforéza a hmotnostní

spektroskopie

Proteiny ur ují fungování organismu a jejich patologiespouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro

zjiš ování p in chorob, diagnózu a lé bu

Souhrn

Proteinové databáze

• www.expasy.ch