Role metabolomiky Role metabolomiky v systémové biologiiv systémové biologii

Studium procesů probíhajících v Studium procesů probíhajících v živých organismechživých organismech

DNA

mRNA

PROTEIN

METABOLIT

transkripcetranslace

biochemické

procesy

Genom / Genomika

Transkriptom / Transkriptomika

Proteom / Proteomika

Metabolom / Metabolomika

„OMICKÉ“ POLE

Systémová biologieSystémová biologie

Důležité pojmyDůležité pojmy

METABOLISMUS – látková přeměna soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k

přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech

Primární• anabolismus – reakce spojené s biosyntézou• katabolismus – reakce spojené s degradací

Sekundární

Důležité pojmyDůležité pojmy

METABOLOMIKA vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu

• kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu.

Rychlé zastavení metabolismu

příprava vzorku nesmí vyloučit žádné metabolity

vysoká účinnost a senzitivita analytických technik

Důležité pojmyDůležité pojmy

METABOLOM kompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém

systému v daném čase (Fiehn, 2002)

METABOLIT nízkomolekulární organická sloučenina ( 1000 Da), produkt látkové přeměny

Chemická třídaChemická třída Typické příkladyTypické příklady

Aminokyseliny, aminy…Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartátL-glutamát, L-aspartát

Karboxylové kyselinyKarboxylové kyseliny Kys. PyrohroznováKys. Pyrohroznová

AlkoholyAlkoholy GlycerolGlycerol

AldehydyAldehydy Acetaldehyd, formaldehydAcetaldehyd, formaldehyd

Fosfátové estery, nukleotidyFosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADPD-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP

SacharidySacharidy D-glukosa, D-fruktosaD-glukosa, D-fruktosa

Lipidy, steroidy a mastné kyselinyLipidy, steroidy a mastné kyseliny CholesterolCholesterol

Vitamíny a koenzymyVitamíny a koenzymy NADNAD++, NADH, NADH

Anorganické iontyAnorganické ionty Fosfáty, nitrátyFosfáty, nitráty

Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky

FINGERPRINTING• komplexní analýza intracelulárních metabolitů bez nutnosti

kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje

FOOTPRINTING• komplexní analýza extracelulárních metabolitů bez nutnosti

kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje

PROFILOVÁNÍ METABOLITŮ (metabolite profiling)

• analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin

• často semikvantitativní analýza

CÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ (metabolite target analysis)

• kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí

• používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce

Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky

Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky

METABONOMIKA (metabonomics) • komplexní metabolické studie zejména v toxikologii • ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn

endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení)

• bez potřeby specifické identifikace

Proč se zabývat Proč se zabývat metabolomikou?metabolomikou?

Počet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů.

Metabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky.

Změny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí.

Kvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics).

Metabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty.

Metabolom

(Escherichia coli K12)

(4392 genů)

(4464 proteinů)

(796 metabolitů)

Genom

Proteom

V n ě j š í v l i v y

Nevýhoda oproti jiným omickým Nevýhoda oproti jiným omickým přístupůmpřístupům

Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!!

RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips

2D-PAGE MALDI-TOF,2D-LC, LC-MSR

oste

che

mic

ká k

ompl

exno

st

anal

yzov

anýc

h sl

ouče

nin

Metabolom

Genom

Proteom

NMR, MSGC-MS, LC-MS, CE-MS

Aplikace výzkumu metabolomuAplikace výzkumu metabolomu

Sledování fyziologického stavu buňky adaptace na prostředí, odhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv přítomnost metabolických biomarkerů stanovení diagnózy a odhad stupně nemocí průběh terapie zvýšení výtěžků fermentace, …

Charakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,…

Ohodnocení kvality úrody některých rostlin

Příprava vzorkuPříprava vzorku

Významně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků

Závislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů

Zhášení buněčného

metabolismu• rychlá změna teploty

• rychlá změna pH

Extrakce metabolitů

z buňky

Separace metabolitů z biomasy

VZOREK• analýza• uskladnění

VZOREK• analýza• uskladnění

Zakoncentrování vzorku

• vakuové odpařování•lyofilizace

Obrázek: Hlavní kroky přípravy vzorku.

Příprava vzorkuPříprava vzorku

Extrakce metabolitů z biologického vzorku• Biologické vzorky obsahují tři hlavní třídy metabolitů:

• metabolity rozpustné ve vodě• metabolity nerozpustné ve vodě• těkavé metabolity všechny tři třídy metabolitů mohou být nalezeny intra- i

extracelulárně

1) Extracelulární metabolity • zisk z extracelulárních médií

Zachycení na koloně Odpaření rozpouštědla – rozpuštění ve vhodném rozpouštědle Pokud vzorky těkavé – přímá analýza GC

Příprava vzorkuPříprava vzorku

2) Intracelulární metabolity• 2 cesty narušení buněčných stěn:

Nemechanické• Enzymatické – enzymy• Fyzikální – osmotický, teplotní šok• Chemické – chemická činidla:

Kyselá extrakce – HClO4, HCl, CCl3COOH,… Bazická extrakce – NaOH, KOH Organickými rozpouštědly – CH3OH, C2H5OH, C2H3N,

CHCl3

Mechanické• Ultrasonikace• Superkritická fluidní extrakce (SFE)• French Press

Soli, proteiny, lipidy ve vzorku zhoršují kvantifikaci analytu užití solid-phase extrakce (SPE)

využívá pevnou fázi a kapalnou k izolaci jednoho nebo jednoho typu analytu z roztoku

využívá stejné typy stacionárních fází jako se využívá v kapalinové chromatografii

limitací je selektivita SPE – ideální pro cílené analýzy jednoho typu, ale nevhodná pro široké profilování metabolitů metabolitů

Příprava vzorkuPříprava vzorku

Analytické metodyAnalytické metodyBuňka

Buněčný extrakt

Frakce metabolitů

Derivatizace

MSG

C

NMR

CE

LC

ESI-MS

Profilování metabolitů, metabolomika

Biologické tekutiny

NMR, FT-IR, Raman

Fingerprintingmetabonomics

GC

HPLC

Derivatizace

Čištěná frakce metabolitů

MS MS RI UV

Cílená analýza metabolitů

Metody metabolomikyMetody metabolomiky

Nukleární magnetická Nukleární magnetická rezonance (NMR)rezonance (NMR)

SpektrometrieSpektrometrie

PodstataPodstata založena na sledování odezvy jader s založena na sledování odezvy jader s

nenulovým magnetickým momentem nenulovým magnetickým momentem umístěných v silném magnetickém poli a umístěných v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněnímelektromagnetickým vlněním..

PodstataPodstata Je detekována absorpce radiofrekvenčního Je detekována absorpce radiofrekvenčního

záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR jsou schopny absorbovat pouze látky s jsou schopny absorbovat pouze látky s nenulovým spinovým kvantovým číslem nenulovým spinovým kvantovým číslem ll::- atomy s lichým hmotovým číslem: - atomy s lichým hmotovým číslem:

l = n½ l = n½ (( 1 1 H , H , 1313C , C , 1515N N 3131P)P)

PodstataPodstata

E

E

spinyjaderné

Blokové schémaBlokové schéma

+ Fe Ff - +

E

Blokové schémaBlokové schéma

Bruker 400 MHzBruker 400 MHz

Bruker 400 MHzBruker 400 MHz

NMR SpektrumNMR Spektrum

NMR SpektrumNMR Spektrum

Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie

PodstataPodstata analytická metoda sloužící k analytická metoda sloužící k

převedení molekul na iontypřevedení molekul na ionty

rozlišení těchto iontů podle poměru rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)hmotnosti a náboje (m/z)

záznam relativních intenzit záznam relativních intenzit jednotlivých iontůjednotlivých iontů

Blokové schémaBlokové schéma

+ Fe Ff - +

E

Ionizační technikyIonizační techniky

Ionizační technikyIonizační techniky Tvrdé ionizační technikyTvrdé ionizační techniky

• EIEI

Jemné ionizační technikyJemné ionizační techniky• ESIESI• MALDIMALDI

Electron impact (EI)Electron impact (EI)M + e- → M+. + 2 e-

Mr

Electrospray (ESI)Electrospray (ESI)

Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)Desorption Ionisation (MALDI)

Hmotnostní analyzátoryHmotnostní analyzátory

Magnetický analyzátorMagnetický analyzátor

KvadrupolKvadrupol

KvadrupolKvadrupol

Iontová past (Ion Trap)Iontová past (Ion Trap)

Ion TrapIon Trap

Analyzátor doby letu (TOF)Analyzátor doby letu (TOF)

DetektoryDetektory

Elektronový násobičElektronový násobič

FotonásobičFotonásobič

MS spektrumMS spektrum

MSMSnn

MSMSnn

ChromatografieChromatografie

Cvet – separace chlorofylů na CaCOCvet – separace chlorofylů na CaCO3 3 19011901

termín „Chromatografie“ 1906termín „Chromatografie“ 1906

ChromatografieChromatografie

ChromatografieChromatografie

Kapalinová chromatografieKapalinová chromatografieLCLC

Mobilní fázeMobilní fáze -- kapalinakapalina

Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalinafáze, kapalina

Schéma chromatografuSchéma chromatografu

Zařízení pro HPLCZařízení pro HPLC

UV – VIS detektorUV – VIS detektors proměnlivou vlnovou délkous proměnlivou vlnovou délkou

„„Electrospray“Electrospray“

Reverzně fázová Reverzně fázová chromatografiechromatografie

Stacionární fázeStacionární fáze – nepolární – nepolární CC88,, CC1818

Mobilní fázeMobilní fáze – polární – vodné roztoky – polární – vodné roztoky pH pH potlačit potlačit

disociacidisociaci

EluceEluce – snižováním polarity mobilní fáze – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH, ACN, MetOH,

ChromatogramChromatogram

Vm

Vr’

Vr

Analýza kvalitativníAnalýza kvalitativní Srovnání retenčních časů píků u Srovnání retenčních časů píků u

vzorku a standardůvzorku a standardů

„„spiking“ – přidání standardu do spiking“ – přidání standardu do vzoru vzoru nárůst výšky píků nárůst výšky píků

MSMS

Analýza kvantitativníAnalýza kvantitativní

Plocha (výška) píkuPlocha (výška) píku

Metoda externího Metoda externího standardustandardu

Metoda standardního Metoda standardního přídavkupřídavku

LC analýzaLC analýza

Plynová chromatografiePlynová chromatografie

Mobilní fázeMobilní fáze -- plynplyn

Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalina fáze, kapalina

Schéma plynového Schéma plynového chromatografuchromatografu

Plynový chromatografPlynový chromatograf

Nosné plynyNosné plyny

Plyn Výhody Nevýhody

N2 levný, bezpečná práce

nízká tepelná vodivost

H2 vysoká tepelná vodivost

explosivní

He inertní drahý

Ar inertní drahý

Příprava vzorků pro GCPříprava vzorků pro GC

Plyny, kapalinyPlyny, kapaliny -- přímo přímo

Pevné látkyPevné látky -- po po derivatizaciderivatizaci

KolonyKolony Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen,

10 - 100 metrů - délka 10 - 100 metrů - délka

Kapilární kolonaKapilární kolona

EluceEluce

EluceEluce

Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID

DestruktivníDestruktivní Princip – ionty vznikající Princip – ionty vznikající

spalováním vzorku vyvolávají spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudunárůst proudu

Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID

Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD

NedestruktivníNedestruktivní Princip – interakce Princip – interakce -- částic se částic se

vzorkem vyvolává pokles prouduvzorkem vyvolává pokles proudu

Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD

- - 63Ni

GC MSGC MSpřímé spojenípřímé spojení

GC analysaGC analysa

Elektromigrační metody Elektromigrační metody

PodstataPodstata

„„Pohyb elektricky nabitých Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“částic v elektrickém poli“

PodstataPodstata

+ Fe Ff - +

E

Elektromigrační metodyElektromigrační metody ElektroforézaElektroforéza

Izoelektrická fokusaceIzoelektrická fokusace

Dvojrozměrná elektroforézaDvojrozměrná elektroforézapI

Mr

Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza

1981 - Jorgenson Lukacsová1981 - Jorgenson Lukacsová

2003 - Projekt lidského genomu2003 - Projekt lidského genomu

PAGE - sekvenace DNAPAGE - sekvenace DNA

37303730xlxl DNA Analyzer DNA AnalyzerApplied BiosystemsApplied Biosystems

Proč CE a biochemie ?Proč CE a biochemie ?

Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita

nabité i neutrální látkynabité i neutrální látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkychirální i achirální látkychirální i achirální látkybakterie i virybakterie i viry

Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace

Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace

CZE, MEKC, CIEF, CITPNACE, MEEKC, CGE, ChCE

CEC

Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separacíVysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorkuMalá spotřeba vzorku Rychlost analýzyRychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé Malá spotřeba chemikálií a malé

množství odpadůmnožství odpadů

Elektroosmotický tokElektroosmotický tok

Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku

CathodeAnode EOF

Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku

Módy CEMódy CE

Kapilární zónová elektroforéza Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapilářeve volné kapiláře

Princip MEKCPrincip MEKC

Micela

a – střed – rozpustná v oboub – silně hydrofilní – nerozpustná v micelec – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi

Micelární elektrokinetická Micelární elektrokinetická chromatografiechromatografie

Chiralita –chirální separace ?Chiralita –chirální separace ?

ThalidomidThalidomid

ThalidomidThalidomid

Chirální separaceChirální separace

Kapilární gelová elektroforézaKapilární gelová elektroforéza

Polymerní matrice pro CGEPolymerní matrice pro CGE

Kapilární izoelektrická Kapilární izoelektrická fokusacefokusace

Instrumentace CEInstrumentace CE

Schéma zařízení pro CZESchéma zařízení pro CZE

Napájecí zdrojNapájecí zdroj

stabilizovaný stabilizovaný ± 30 ± 30 kVkV 300 μA300 μA

konstantní napětí nebokonstantní napětí nebo proudproud

obojí polaritaobojí polarita ochrana obsluhyochrana obsluhy

KapiláraKapilára

křemenná křemenná - - 25 -100 25 -100 μm i.dμm i.d - 3- 350 μm o.d.50 μm o.d.

délka délka až 100 cm až 100 cm délkadélka

polyimidové vnější polyimidové vnější pokrytípokrytí

DávkováníDávkování

HydrodynamickéHydrodynamické

ElektrokinetickéElektrokinetické

DetekceDetekce

Spektrofotometrická detekceSpektrofotometrická detekce

Fluorescenční detekceFluorescenční detekce

CZE-MSCZE-MS

Schéma CZE-ESI-MSSchéma CZE-ESI-MS

µµCE CE

Bioanalyser Agilent 2100

Charakterizace CECharakterizace CE

Výhody :Výhody : Široká řada aplikací Minimální organické odpady nízká cena Minimální požadavky na množství vzorku (méně než pg nebo nl) Vysoká účinnost separace Rychlost analýzy Automatizace

Nevýhoda :Nevýhoda : Nízká koncentrační citlivost (CE s UV detekcí)

Dávkování malých objemů analytů do kapiláry Krátká absorpční dráha paprsku

Charakterizace CECharakterizace CE

Řešení nízké koncentrační citlivosti:Řešení nízké koncentrační citlivosti: Použití detektoru s vyšší citlivostí. Bublinkové kapiláry, Z - kapiláry, … On-line prekoncentrační techniky

field enhanced sample stacking sweeping dynamic pH junction transient isotachophoresis

Princip on-line prekoncentračních technik:Princip on-line prekoncentračních technik: prekoncentrace analytů v kapiláře do úzkých zón před vlastní separací možno nadávkovat větší objem vzorku zvýšení koncentrační citlivosti CE-analýz.

Field enhanced stacking Field enhanced stacking (zakoncentrování vzorku zesílením pole)(zakoncentrování vzorku zesílením pole)

Obrázek: Field enhanced stacking, EOF potlačen.

VLEVO: zóna vzorku – zóna s nízkou elektrickou vodivostí – zóna s vysokým elektrickým polem.

VPRAVO: zóna základního elektrolytu – zóna s vysokou elektrickou vodivostí – zóna s nízkým elektrickým polem.

Obrázek: Field enhanced stacking, rychlost EOF je vyšší než rychlost elektroforetického pohybu.

ExperimentExperiment

Analytická metoda:KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA, on-line prekoncentrace – field enhanced stacking

Metabolity: adeninové nukleotidy: ATP, ADP, AMPadeninové koenzymy: NAD+, NADH, NADP+, NADPH

Živý systém: bakterie Paracoccus denitrificans

ExperimentExperiment 1) Optimalizace metody na standardech.1) Optimalizace metody na standardech.

Optimální podmínky separace:

KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.

BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.

VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.

SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).

TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.

DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Separace standardů za optimálních podmínek.

CE-analýza

ExperimentExperiment

2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.Kultivace přes 2 inokula, sklízení, dávkování po 500 l, centrifugace.

Extrakce 50 % ACN, centrifugace, zisk supernatantu.

Odpaření rozpouštědla na vakuovém koncentátoru

Filtrace získaného extraktu přes 5 kDa filtr.

+ H2O

[1] W. Lu, E. Kimball, J. D. Rabinowitz, J. Am. Soc. Mass. Spectrom 17 (2006) 37; [2] E. Kimball, J. D. Rabinowitz, Anal. Biochem. 358 (2006) 273; [3] J. D. Rabinowitz, E. Kimball, Anal. Chem. 79 (2007) 6167.

ExperimentExperiment

3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie 3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.CE-analýza

Optimální podmínky separace:

KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.

BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.

VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.

SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).

TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.

DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Analýza bezbuněčného extraktu.

ExperimentExperiment 4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů

bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.

[Baker, S., C., Ferguson, S., J., Ludwig, B., Page, M., D., Richter, O-M., H., Spanning, R., J., J., van. Microbiology and Molecular biology reviews. 1998, 62, 1046-1078.]

ExperimentExperiment

4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Čas (s)

Ploc

ha p

íků

(mA

U)

NAD AMP NADP ADP ATP