Role metabolomiky Role metabolomiky v systémové biologiiv systémové biologii
Studium procesů probíhajících v Studium procesů probíhajících v živých organismechživých organismech
DNA
mRNA
PROTEIN
METABOLIT
transkripcetranslace
biochemické
procesy
Genom / Genomika
Transkriptom / Transkriptomika
Proteom / Proteomika
Metabolom / Metabolomika
„OMICKÉ“ POLE
Systémová biologieSystémová biologie
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLISMUS – látková přeměna soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k
přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech
Primární• anabolismus – reakce spojené s biosyntézou• katabolismus – reakce spojené s degradací
Sekundární
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLOMIKA vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu
• kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu.
Rychlé zastavení metabolismu
příprava vzorku nesmí vyloučit žádné metabolity
vysoká účinnost a senzitivita analytických technik
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLOM kompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém
systému v daném čase (Fiehn, 2002)
METABOLIT nízkomolekulární organická sloučenina ( 1000 Da), produkt látkové přeměny
Chemická třídaChemická třída Typické příkladyTypické příklady
Aminokyseliny, aminy…Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartátL-glutamát, L-aspartát
Karboxylové kyselinyKarboxylové kyseliny Kys. PyrohroznováKys. Pyrohroznová
AlkoholyAlkoholy GlycerolGlycerol
AldehydyAldehydy Acetaldehyd, formaldehydAcetaldehyd, formaldehyd
Fosfátové estery, nukleotidyFosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADPD-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP
SacharidySacharidy D-glukosa, D-fruktosaD-glukosa, D-fruktosa
Lipidy, steroidy a mastné kyselinyLipidy, steroidy a mastné kyseliny CholesterolCholesterol
Vitamíny a koenzymyVitamíny a koenzymy NADNAD++, NADH, NADH
Anorganické iontyAnorganické ionty Fosfáty, nitrátyFosfáty, nitráty
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
FINGERPRINTING• komplexní analýza intracelulárních metabolitů bez nutnosti
kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje
FOOTPRINTING• komplexní analýza extracelulárních metabolitů bez nutnosti
kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje
PROFILOVÁNÍ METABOLITŮ (metabolite profiling)
• analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin
• často semikvantitativní analýza
CÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ (metabolite target analysis)
• kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí
• používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
METABONOMIKA (metabonomics) • komplexní metabolické studie zejména v toxikologii • ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn
endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení)
• bez potřeby specifické identifikace
Proč se zabývat Proč se zabývat metabolomikou?metabolomikou?
Počet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů.
Metabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky.
Změny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí.
Kvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics).
Metabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty.
Metabolom
(Escherichia coli K12)
(4392 genů)
(4464 proteinů)
(796 metabolitů)
Genom
Proteom
V n ě j š í v l i v y
Nevýhoda oproti jiným omickým Nevýhoda oproti jiným omickým přístupůmpřístupům
Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!!
RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips
2D-PAGE MALDI-TOF,2D-LC, LC-MSR
oste
che
mic
ká k
ompl
exno
st
anal
yzov
anýc
h sl
ouče
nin
Metabolom
Genom
Proteom
NMR, MSGC-MS, LC-MS, CE-MS
Aplikace výzkumu metabolomuAplikace výzkumu metabolomu
Sledování fyziologického stavu buňky adaptace na prostředí, odhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv přítomnost metabolických biomarkerů stanovení diagnózy a odhad stupně nemocí průběh terapie zvýšení výtěžků fermentace, …
Charakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,…
Ohodnocení kvality úrody některých rostlin
Příprava vzorkuPříprava vzorku
Významně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků
Závislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů
Zhášení buněčného
metabolismu• rychlá změna teploty
• rychlá změna pH
Extrakce metabolitů
z buňky
Separace metabolitů z biomasy
VZOREK• analýza• uskladnění
VZOREK• analýza• uskladnění
Zakoncentrování vzorku
• vakuové odpařování•lyofilizace
Obrázek: Hlavní kroky přípravy vzorku.
Příprava vzorkuPříprava vzorku
Extrakce metabolitů z biologického vzorku• Biologické vzorky obsahují tři hlavní třídy metabolitů:
• metabolity rozpustné ve vodě• metabolity nerozpustné ve vodě• těkavé metabolity všechny tři třídy metabolitů mohou být nalezeny intra- i
extracelulárně
1) Extracelulární metabolity • zisk z extracelulárních médií
Zachycení na koloně Odpaření rozpouštědla – rozpuštění ve vhodném rozpouštědle Pokud vzorky těkavé – přímá analýza GC
Příprava vzorkuPříprava vzorku
2) Intracelulární metabolity• 2 cesty narušení buněčných stěn:
Nemechanické• Enzymatické – enzymy• Fyzikální – osmotický, teplotní šok• Chemické – chemická činidla:
Kyselá extrakce – HClO4, HCl, CCl3COOH,… Bazická extrakce – NaOH, KOH Organickými rozpouštědly – CH3OH, C2H5OH, C2H3N,
CHCl3
Mechanické• Ultrasonikace• Superkritická fluidní extrakce (SFE)• French Press
Soli, proteiny, lipidy ve vzorku zhoršují kvantifikaci analytu užití solid-phase extrakce (SPE)
využívá pevnou fázi a kapalnou k izolaci jednoho nebo jednoho typu analytu z roztoku
využívá stejné typy stacionárních fází jako se využívá v kapalinové chromatografii
limitací je selektivita SPE – ideální pro cílené analýzy jednoho typu, ale nevhodná pro široké profilování metabolitů metabolitů
Příprava vzorkuPříprava vzorku
Analytické metodyAnalytické metodyBuňka
Buněčný extrakt
Frakce metabolitů
Derivatizace
MSG
C
NMR
CE
LC
ESI-MS
Profilování metabolitů, metabolomika
Biologické tekutiny
NMR, FT-IR, Raman
Fingerprintingmetabonomics
GC
HPLC
Derivatizace
Čištěná frakce metabolitů
MS MS RI UV
Cílená analýza metabolitů
Metody metabolomikyMetody metabolomiky
Nukleární magnetická Nukleární magnetická rezonance (NMR)rezonance (NMR)
SpektrometrieSpektrometrie
PodstataPodstata založena na sledování odezvy jader s založena na sledování odezvy jader s
nenulovým magnetickým momentem nenulovým magnetickým momentem umístěných v silném magnetickém poli a umístěných v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněnímelektromagnetickým vlněním..
PodstataPodstata Je detekována absorpce radiofrekvenčního Je detekována absorpce radiofrekvenčního
záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR jsou schopny absorbovat pouze látky s jsou schopny absorbovat pouze látky s nenulovým spinovým kvantovým číslem nenulovým spinovým kvantovým číslem ll::- atomy s lichým hmotovým číslem: - atomy s lichým hmotovým číslem:
l = n½ l = n½ (( 1 1 H , H , 1313C , C , 1515N N 3131P)P)
PodstataPodstata
E
E
spinyjaderné
Blokové schémaBlokové schéma
+ Fe Ff - +
E
Blokové schémaBlokové schéma
Bruker 400 MHzBruker 400 MHz
Bruker 400 MHzBruker 400 MHz
NMR SpektrumNMR Spektrum
NMR SpektrumNMR Spektrum
Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
PodstataPodstata analytická metoda sloužící k analytická metoda sloužící k
převedení molekul na iontypřevedení molekul na ionty
rozlišení těchto iontů podle poměru rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)hmotnosti a náboje (m/z)
záznam relativních intenzit záznam relativních intenzit jednotlivých iontůjednotlivých iontů
Blokové schémaBlokové schéma
+ Fe Ff - +
E
Ionizační technikyIonizační techniky
Ionizační technikyIonizační techniky Tvrdé ionizační technikyTvrdé ionizační techniky
• EIEI
Jemné ionizační technikyJemné ionizační techniky• ESIESI• MALDIMALDI
Electron impact (EI)Electron impact (EI)M + e- → M+. + 2 e-
Mr
Electrospray (ESI)Electrospray (ESI)
Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)Desorption Ionisation (MALDI)
Hmotnostní analyzátoryHmotnostní analyzátory
Magnetický analyzátorMagnetický analyzátor
KvadrupolKvadrupol
KvadrupolKvadrupol
Iontová past (Ion Trap)Iontová past (Ion Trap)
Ion TrapIon Trap
Analyzátor doby letu (TOF)Analyzátor doby letu (TOF)
DetektoryDetektory
Elektronový násobičElektronový násobič
FotonásobičFotonásobič
MS spektrumMS spektrum
MSMSnn
MSMSnn
ChromatografieChromatografie
Cvet – separace chlorofylů na CaCOCvet – separace chlorofylů na CaCO3 3 19011901
termín „Chromatografie“ 1906termín „Chromatografie“ 1906
ChromatografieChromatografie
ChromatografieChromatografie
Kapalinová chromatografieKapalinová chromatografieLCLC
Mobilní fázeMobilní fáze -- kapalinakapalina
Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalinafáze, kapalina
Schéma chromatografuSchéma chromatografu
Zařízení pro HPLCZařízení pro HPLC
UV – VIS detektorUV – VIS detektors proměnlivou vlnovou délkous proměnlivou vlnovou délkou
„„Electrospray“Electrospray“
Reverzně fázová Reverzně fázová chromatografiechromatografie
Stacionární fázeStacionární fáze – nepolární – nepolární CC88,, CC1818
Mobilní fázeMobilní fáze – polární – vodné roztoky – polární – vodné roztoky pH pH potlačit potlačit
disociacidisociaci
EluceEluce – snižováním polarity mobilní fáze – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH, ACN, MetOH,
ChromatogramChromatogram
Vm
Vr’
Vr
Analýza kvalitativníAnalýza kvalitativní Srovnání retenčních časů píků u Srovnání retenčních časů píků u
vzorku a standardůvzorku a standardů
„„spiking“ – přidání standardu do spiking“ – přidání standardu do vzoru vzoru nárůst výšky píků nárůst výšky píků
MSMS
Analýza kvantitativníAnalýza kvantitativní
Plocha (výška) píkuPlocha (výška) píku
Metoda externího Metoda externího standardustandardu
Metoda standardního Metoda standardního přídavkupřídavku
LC analýzaLC analýza
Plynová chromatografiePlynová chromatografie
Mobilní fázeMobilní fáze -- plynplyn
Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalina fáze, kapalina
Schéma plynového Schéma plynového chromatografuchromatografu
Plynový chromatografPlynový chromatograf
Nosné plynyNosné plyny
Plyn Výhody Nevýhody
N2 levný, bezpečná práce
nízká tepelná vodivost
H2 vysoká tepelná vodivost
explosivní
He inertní drahý
Ar inertní drahý
Příprava vzorků pro GCPříprava vzorků pro GC
Plyny, kapalinyPlyny, kapaliny -- přímo přímo
Pevné látkyPevné látky -- po po derivatizaciderivatizaci
KolonyKolony Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen,
10 - 100 metrů - délka 10 - 100 metrů - délka
Kapilární kolonaKapilární kolona
EluceEluce
EluceEluce
Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID
DestruktivníDestruktivní Princip – ionty vznikající Princip – ionty vznikající
spalováním vzorku vyvolávají spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudunárůst proudu
Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID
Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD
NedestruktivníNedestruktivní Princip – interakce Princip – interakce -- částic se částic se
vzorkem vyvolává pokles prouduvzorkem vyvolává pokles proudu
Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD
- - 63Ni
GC MSGC MSpřímé spojenípřímé spojení
GC analysaGC analysa
Elektromigrační metody Elektromigrační metody
PodstataPodstata
„„Pohyb elektricky nabitých Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“částic v elektrickém poli“
PodstataPodstata
+ Fe Ff - +
E
Elektromigrační metodyElektromigrační metody ElektroforézaElektroforéza
Izoelektrická fokusaceIzoelektrická fokusace
Dvojrozměrná elektroforézaDvojrozměrná elektroforézapI
Mr
Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza
1981 - Jorgenson Lukacsová1981 - Jorgenson Lukacsová
2003 - Projekt lidského genomu2003 - Projekt lidského genomu
PAGE - sekvenace DNAPAGE - sekvenace DNA
37303730xlxl DNA Analyzer DNA AnalyzerApplied BiosystemsApplied Biosystems
Proč CE a biochemie ?Proč CE a biochemie ?
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita
nabité i neutrální látkynabité i neutrální látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkychirální i achirální látkychirální i achirální látkybakterie i virybakterie i viry
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace
CZE, MEKC, CIEF, CITPNACE, MEEKC, CGE, ChCE
CEC
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separacíVysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorkuMalá spotřeba vzorku Rychlost analýzyRychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé Malá spotřeba chemikálií a malé
množství odpadůmnožství odpadů
Elektroosmotický tokElektroosmotický tok
Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku
CathodeAnode EOF
Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku
Módy CEMódy CE
Kapilární zónová elektroforéza Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapilářeve volné kapiláře
Princip MEKCPrincip MEKC
Micela
a – střed – rozpustná v oboub – silně hydrofilní – nerozpustná v micelec – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi
Micelární elektrokinetická Micelární elektrokinetická chromatografiechromatografie
Chiralita –chirální separace ?Chiralita –chirální separace ?
ThalidomidThalidomid
ThalidomidThalidomid
Chirální separaceChirální separace
Kapilární gelová elektroforézaKapilární gelová elektroforéza
Polymerní matrice pro CGEPolymerní matrice pro CGE
Kapilární izoelektrická Kapilární izoelektrická fokusacefokusace
Instrumentace CEInstrumentace CE
Schéma zařízení pro CZESchéma zařízení pro CZE
Napájecí zdrojNapájecí zdroj
stabilizovaný stabilizovaný ± 30 ± 30 kVkV 300 μA300 μA
konstantní napětí nebokonstantní napětí nebo proudproud
obojí polaritaobojí polarita ochrana obsluhyochrana obsluhy
KapiláraKapilára
křemenná křemenná - - 25 -100 25 -100 μm i.dμm i.d - 3- 350 μm o.d.50 μm o.d.
délka délka až 100 cm až 100 cm délkadélka
polyimidové vnější polyimidové vnější pokrytípokrytí
DávkováníDávkování
HydrodynamickéHydrodynamické
ElektrokinetickéElektrokinetické
DetekceDetekce
Spektrofotometrická detekceSpektrofotometrická detekce
Fluorescenční detekceFluorescenční detekce
CZE-MSCZE-MS
Schéma CZE-ESI-MSSchéma CZE-ESI-MS
µµCE CE
Bioanalyser Agilent 2100
Charakterizace CECharakterizace CE
Výhody :Výhody : Široká řada aplikací Minimální organické odpady nízká cena Minimální požadavky na množství vzorku (méně než pg nebo nl) Vysoká účinnost separace Rychlost analýzy Automatizace
Nevýhoda :Nevýhoda : Nízká koncentrační citlivost (CE s UV detekcí)
Dávkování malých objemů analytů do kapiláry Krátká absorpční dráha paprsku
Charakterizace CECharakterizace CE
Řešení nízké koncentrační citlivosti:Řešení nízké koncentrační citlivosti: Použití detektoru s vyšší citlivostí. Bublinkové kapiláry, Z - kapiláry, … On-line prekoncentrační techniky
field enhanced sample stacking sweeping dynamic pH junction transient isotachophoresis
Princip on-line prekoncentračních technik:Princip on-line prekoncentračních technik: prekoncentrace analytů v kapiláře do úzkých zón před vlastní separací možno nadávkovat větší objem vzorku zvýšení koncentrační citlivosti CE-analýz.
Field enhanced stacking Field enhanced stacking (zakoncentrování vzorku zesílením pole)(zakoncentrování vzorku zesílením pole)
Obrázek: Field enhanced stacking, EOF potlačen.
VLEVO: zóna vzorku – zóna s nízkou elektrickou vodivostí – zóna s vysokým elektrickým polem.
VPRAVO: zóna základního elektrolytu – zóna s vysokou elektrickou vodivostí – zóna s nízkým elektrickým polem.
Obrázek: Field enhanced stacking, rychlost EOF je vyšší než rychlost elektroforetického pohybu.
ExperimentExperiment
Analytická metoda:KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA, on-line prekoncentrace – field enhanced stacking
Metabolity: adeninové nukleotidy: ATP, ADP, AMPadeninové koenzymy: NAD+, NADH, NADP+, NADPH
Živý systém: bakterie Paracoccus denitrificans
ExperimentExperiment 1) Optimalizace metody na standardech.1) Optimalizace metody na standardech.
Optimální podmínky separace:
KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.
BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.
VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.
SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).
TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.
DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Separace standardů za optimálních podmínek.
CE-analýza
ExperimentExperiment
2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.Kultivace přes 2 inokula, sklízení, dávkování po 500 l, centrifugace.
Extrakce 50 % ACN, centrifugace, zisk supernatantu.
Odpaření rozpouštědla na vakuovém koncentátoru
Filtrace získaného extraktu přes 5 kDa filtr.
+ H2O
[1] W. Lu, E. Kimball, J. D. Rabinowitz, J. Am. Soc. Mass. Spectrom 17 (2006) 37; [2] E. Kimball, J. D. Rabinowitz, Anal. Biochem. 358 (2006) 273; [3] J. D. Rabinowitz, E. Kimball, Anal. Chem. 79 (2007) 6167.
ExperimentExperiment
3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie 3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.CE-analýza
Optimální podmínky separace:
KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.
BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.
VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.
SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).
TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.
DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Analýza bezbuněčného extraktu.
ExperimentExperiment 4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů
bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.
[Baker, S., C., Ferguson, S., J., Ludwig, B., Page, M., D., Richter, O-M., H., Spanning, R., J., J., van. Microbiology and Molecular biology reviews. 1998, 62, 1046-1078.]
ExperimentExperiment
4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Čas (s)
Ploc
ha p
íků
(mA
U)
NAD AMP NADP ADP ATP